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Biochemistry

लेजर Microdissection शाही सेना seq के लिए प्रायोगिक डिजाइन: मक्का पत्तियों के विकास के एक विश्लेषण से सबक

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55004
Automatic Translation
1, 2, 1
1Plant Biology Section, School of Integrative Plant Science, Cornell University, 2Department of Developmental Genetics, University of Wyoming

Abstract

विकास में महत्वपूर्ण भूमिका के साथ जीन अक्सर स्थानिक और / या अस्थायी प्रतिबंधित अभिव्यक्ति पैटर्न है। अक्सर इन जीन टेप पता नहीं कर रहे हैं या पहचान नहीं कर रहे हैं के रूप में विभिन्न पूरे संयंत्र अंगों के transcriptomic विश्लेषण (डी) में व्यक्त किया। लेजर Microdissection शाही सेना Seq (एल एम शाही सेना seq) जीन है कि विशिष्ट विकास डोमेन में डे की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, सेलुलर डोमेन के चुनाव microdissect करने के लिए और तुलना करें, और microdissections की सटीकता प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। इधर, दो उदाहरण transcriptomics प्रयोगों के लिए डिजाइन विचारों को स्पष्ट; एक एलएम शाही सेना seq विश्लेषण जीन है कि मक्का पत्ती समीपस्थ-बाहर का अक्ष के साथ डे रहे हैं की पहचान करने के लिए, और एक दूसरे प्रयोग जीन है कि में डे liguleless1 आर (lg1-आर) कर रहे हैं की पहचान करने के लिए म्यूटेंट जंगली प्रकार की तुलना में। महत्वपूर्ण तत्व है कि इन प्रयोगों की सफलता में योगदान ऊतकीय और सी में विस्तृत थेTu संकरण क्षेत्र के विश्लेषण का विश्लेषण किया जा सकता है, बराबर विकास के चरणों में पत्ती primordia के चयन, रूपात्मक स्थलों के उपयोग के क्षेत्रों microdissection के लिए चयन करें, और ठीक मापा डोमेन की microdissection करने के लिए। इस पत्र एलएम शाही सेना Seq द्वारा विकासात्मक डोमेन के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यहाँ प्रस्तुत डेटा वर्णन कैसे क्षेत्र microdissection के लिए चुना प्राप्त परिणामों को प्रभावित करेगा।

Introduction

के रूप में यह ब्लेड और म्यान कि आनुवंशिक विच्छेदन (चित्रा 1 ए) के लिए उत्तरदायी है के बीच एक स्पष्ट सीमा है मक्का की पत्ती, morphogenesis दौरान विकास क्षेत्रों के गठन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। पत्ती विकास, छोटे कोशिकाओं के एक रेखीय बैंड के प्रारंभिक चरण के दौरान, preligule बैंड (पीएलबी), पूर्व ब्लेड और पूर्व म्यान डोमेन में पत्ती उत्स उप विभाजित। एक किनारे की तरह ligule और त्रिकोणीय अलिंद पीएलबी (चित्रा 1 ए, सी, डी) से विकसित करना। जेनेटिक म्यूटेशन स्क्रीन है कि ब्लेड-म्यान सीमा को बाधित की पहचान की है। उदाहरण के लिए, पीछे हटने का liguleless1 (lg1) म्यूटेशन ligule और अलिंद 1, 2, 3, 4 (चित्रा 1 बी) को हटा दें। बगल में संकरण से पता चला है कि lg1 प्रतिलेख पी पर जम जाता हैपौंड और उभरते ligule, यह ligule विकास 5, 6 (चित्रा 1E) के लिए एक उत्कृष्ट मार्कर कर रही है।

आकृति 1
चित्रा 1: जंगली प्रकार और liguleless1 आर मक्का छोड़ देता है। (ए) परिपक्व जंगली प्रकार ligule और अलिन्द संरचनाओं दिखा पत्ती के ब्लेड-म्यान सीमा क्षेत्र। (बी) ligule और अलिन्द संरचनाओं के परिपक्व liguleless1 आर पत्ती दिखा अभाव के ब्लेड-म्यान सीमा क्षेत्र। ए और बी में पत्तियां midrib साथ आधे में कटौती की गई है। (सी) अनुदैर्ध्य जंगली प्रकार पत्ती उत्स के माध्यम से खंड। नमूना संसाधित और histological विश्लेषण के लिए दाग कर दिया गया है। की शुरुआत ligule एक टक्कर पत्ती (नोक) के विमान से फैलने वाला के रूप में स्पष्ट है। (डी) अनुदैर्ध्य संप्रदायजंगली प्रकार पत्ती उत्स के माध्यम से आयन। नमूना पाठ में वर्णित के रूप में एलएम के लिए कार्रवाई की जा चुकी है। Arrowhead ligule की शुरुआत का संकेत है। (ई) शूट एपेक्स पार्श्व अनुदैर्ध्य खंड के स्वस्थानी संकरण में lg1। तारों के पी 6 पत्ती उत्स के पीएलबी पर lg1 प्रतिलेख संचय संकेत मिलता है। तीर पी 6 उत्स के आधार संकेत मिलता है। बार पीएलबी के लिए उत्स के आधार से माप इंगित करता है। ए और बी में स्केल सलाखों 20 मिमी =। सीई में स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा संदर्भ 6 (प्लांट जीव के कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी) से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस अध्ययन में, एलएम शाही सेना Seq पत्ती उत्स की और आईडीई के लिए अन्य भागों में ब्लेड म्यान सीमा रिश्तेदार (डी) जीनों का एक सूट है कि विभिन्न व्यक्त कर रहे हैं की पहचान करने के लिए नियुक्त किया गया था ntify जीन है कि lg1 आर म्यूटेंट जंगली प्रकार भाई बहन के सापेक्ष में डी कर रहे हैं। एलएम शाही सेना Seq विशिष्ट कोशिकाओं या सेलुलर डोमेन 7 में प्रतिलेख संचय बढ़ाता का एक तरीका है। एलएम सिस्टम एक लेजर और एक डिजिटल कैमरे के साथ एक माइक्रोस्कोप गठबंधन। Sectioned ऊतक स्लाइड पर मुहिम शुरू की और माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा जाता है। एलएम सॉफ्टवेयर आम तौर पर ड्राइंग उपकरण है कि उपयोगकर्ता microdissection के लिए किसी भी चयनित क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करने की अनुमति भी शामिल है। रेखा के साथ लेजर कटौती, और चयनित ऊतक स्लाइड बंद पहुंचा और एक ट्यूब स्लाइड ऊपर निलंबित में है। एलएम उपयोगकर्ता विशेष सेल परतों और यहां तक कि एकल कक्षों 8, 9 सहित सटीक डोमेन, microdissect करने के लिए अनुमति देता है। आरएनए तो microdissected ऊतक से निकाला जा सकता है। इसके बाद शाही सेना Seq घटक निकाले शाही सेना 10 से उत्पन्न सीडीएनए पुस्तकालयों अनुक्रम करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का इस्तेमाल करता है,= "xref"> 11।

एलएम शाही सेना seq के प्रमुख लाभ ठीक से परिभाषित डोमेन में प्रतिलेख संचय यों की क्षमता और क्षमता पूरे transcriptome एक साथ 7 प्रोफ़ाइल करने के लिए कर रहे हैं। तकनीक विशेष रूप से प्रारंभिक विकास घटनाओं जहां ब्याज के क्षेत्र में अक्सर सूक्ष्म है की जांच कर रही करने के लिए उपयुक्त है। पिछले अध्ययनों का उपयोग किया है एलएम माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी के साथ संयुक्त पौधों 9, 12, 13 में विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए। शाही सेना Seq कम व्यक्त जीनों सहित एक व्यापक गतिशील रेंज, भर टेप बढ़ाता का लाभ दिया है, और पूर्व अनुक्रम जानकारी 10 की आवश्यकता नहीं है, 11। इसके अलावा, एल एम शाही सेना Seq संभावित developmentally महत्वपूर्ण जीनों के- नुकसान आनुवंशिक अतिरेक के कारण या की मारक है कि म्युटाजेनेसिस स्क्रीन में याद किया जा सकता उजागर करने के लिए हैसमारोह उत्परिवर्ती।

इस तरह के संकीर्ण sheath1 (NS1) और कप के आकार cotyledon2 (cuc2) के रूप में developmentally महत्वपूर्ण जीनों, अक्सर कुछ कोशिकाओं 17, 18, 19, 20 के लिए सिर्फ एक विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न या है। कई केवल प्रारंभिक विकास के चरणों के दौरान और परिपक्व अंग में नहीं व्यक्त कर रहे हैं। जब पूरे अंगों या बड़े डोमेन विश्लेषण कर रहे हैं, इन सेल विशिष्ट टेप पतला कर रहे हैं और अधिक परंपरागत विश्लेषण में पता नहीं किया जा सकता है। ठीक परिभाषित डोमेन के विश्लेषण की अनुमति से, एल एम शाही सेना Seq इन ऊतक विशेष जीनों की पहचान की और मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है।

यहाँ वर्णित प्रयोगों की सफलता में महत्वपूर्ण कारकों में एक पूरी तरह से ऊतकीय विश्लेषण है कि उचित विकास मंच और विश्लेषण के लिए डोमेन के चयन निर्देशित, और सटीक measureme थेएलएम के लिए सेल ऊतक डोमेन की NT। यह सुनिश्चित करें कि बराबर डोमेन सभी प्रतिकृति के लिए नमूना थे, ऊतक ही विकास के चरण में पत्ती primordia से एकत्र किया गया था और microdissected डोमेन, जैसे उभरते ligule (चित्रा 2) के रूप में रूपात्मक स्थलों के रिश्तेदार मापा गया। यह ज्ञात है कि कुछ जीन पत्ती के आधार को सिरे से एक ढाल में व्यक्त कर रहे हैं। पत्ती समीपस्थ-बाहर का अक्ष के साथ अलग-अलग स्थानों से नमूने के कारण सटीक डोमेन, बदलाव को मापने के द्वारा एक न्यूनतम (चित्रा 3) के लिए रखा गया था। एक ही आकार के डोमेन microdissecting रखकर कारण भिन्नता करने के लिए अंतर सेल विशिष्ट टेप के कमजोर पड़ने से भी कम हो गया था (चित्रा 3 बी)। शूट एपेक्स के पार्श्व अनुदैर्ध्य वर्गों सभी microdissections के लिए इस्तेमाल किया गया। इन वर्गों है कि midrib मार्जिन अक्ष को सीधा कर रहे हैं (चित्रा 4) कर रहे हैं। केवल वर्गों है कि सैम का उपयोग करके यह सुनिश्चित करता है कि बराबर पार्श्व क्षेत्रोंपत्ती primordia विश्लेषण कर रहे हैं।

संसाधित और एलएम के लिए sectioned नमूनों में ligule परिणाम के पहले रूपात्मक साइन adaxial एपिडर्मिस (चित्रा -1, चित्रा 2) में periclinal कोशिका विभाजन के कारण adaxial पक्ष पर एक टक्कर है। यह निर्धारित किया है कि उभरते ligule मज़बूती plastochron 7 चरण पत्ती primordia में पहचाना जा सकता था। हम पूरे ligule क्षेत्र में व्यक्त जीनों, उभरते ligule और कोशिकाओं को तुरंत बाहर का है कि अलिन्द बनेगी सहित में रुचि रखते थे। आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि बराबर ऊतक चयन किया गया, ligule टक्कर एक रूपात्मक मील का पत्थर के रूप में इस्तेमाल किया गया था और एक 100 माइक्रोन ligule टक्कर पर केन्द्रित आयत एलएम (चित्रा 2A, 2 बी) के लिए चुना गया था। पूर्व ब्लेड और पूर्व म्यान के बराबर आकार की आयतों में एक ही पत्ता primordia से चयन किया गया था।

liguleless उत्परिवर्ती पौधों का विश्लेषण एक अलग challe प्रस्तुतnge; lg1 आर म्यूटेंट एक ligule, इसलिए इस रूपात्मक सुविधा एलएम के लिए क्षेत्र का चयन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता फार्म नहीं है। इसके बजाय, जंगली प्रकार पत्ती primordia में lg1 प्रतिलेख संचय के क्षेत्र निर्धारित किया गया था, और एक क्षेत्र है कि इस डोमेन धरना होगा परिभाषित किया गया था। इन प्रारंभिक विश्लेषण करती है, उसी के रोपण से पौध पर प्रदर्शन किया गया के रूप में अंतिम विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है के बाद से पिछले काम दिखाया गया है कि पीएलबी के स्थान के विकास की स्थिति पर निर्भर करता है। बगल में संकरण संकेत दिया कि lg1 टेप पी 6 की पीएलबी पत्ती primordia (चित्रा 1E) में जमा है। हम पत्ती primordia कि lg1 अभिव्यक्ति के डोमेन (बैंगनी आयत, 2A चित्रा) घेर लिया और जंगली प्रकार और lg1 आर पौधों से इन क्षेत्रों पर कब्जा कर लिया बराबर के आधार से एक डोमेन 400-900 माइक्रोन का चयन किया। जब transcrip की तुलना आनुवंशिक पृष्ठभूमि और विकास की स्थिति में भिन्नता को कम करनेlg1 आर और जंगली प्रकार के पौधे, म्यूटेंट और जंगली प्रकार भाई बहन के परिवारों को अलग करने में संचय टी इस्तेमाल किया गया।

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Protocol

नोट: एक ही समय है कि ऊतक एलएम के लिए तय हो गई है पर ऊतकीय विश्लेषण के लिए ऊतक को ठीक करें। कि बाद में एलएम मार्गदर्शन करेंगे रूपात्मक सुविधाओं के लिए दाग वर्गों की जांच करना। जब जंगली प्रकार के लिए उत्परिवर्ती की तुलना, डोमेन (इस मामले में lg1) जहां ब्याज की जीन व्यक्त किया है परिभाषित करने के लिए सीटू संकरण या immunolocalization में प्रदर्शन करते हैं।

1. ऊतक निर्धारण और प्रसंस्करण

  1. दो सप्ताह के मानक शर्तों के तहत 6 वर्ष के लिए मक्का पौध के फ्लैटों के लिए आगे बढ़ें।
  2. पार्श्व वर्गों (चित्रा 4) के लिए शूट apices काटना।
    1. सिर्फ मिट्टी की रेखा से नीचे आबकारी अंकुर।
    2. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, जब तक एक या दो परिपक्व पत्तियों से घेर लिया कल्म का एक अंडाकार दिखाई (चित्रा 4 बी) है स्टेम (कटौती 1, चित्रा -4 ए) के आधार से पतले स्लाइस को हटा दें।
    3. एक और कटौती बेस के ऊपर लगभग 10 मिमी (2 कटौती, चित्रा -4 ए) बनाओ।यह 10 मिमी खंड सैम और युवा पत्ती primordia में शामिल होंगे।
    4. 10 मिमी खंड बारी इतनी आधार सामना करना पड़ रहा है। दो कटौती पार्श्व धुरी के समानांतर इतना है कि ऊतक 2-3 मिमी मोटी का एक टुकड़ा प्राप्त किया जाता है (कटौती 3 से 4, चित्रा 4 बी, और) बनाओ। बाहरी दो भागों त्यागें और निर्धारण और embedding के लिए केंद्रीय टुकड़ा बरकरार रहती है।
      नोट: बाहरी पत्तियों छंटनी और खारिज किया जा सकता है।
  3. embedding के लिए ऊतक और इस प्रक्रिया को ठीक करें।
    1. सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री बाद के चरणों में प्रयोग की जाने वाली RNase मुक्त कर रहे हैं। diethyl pyrocarbonate (DEPC) के साथ समाधान समझो (प्रति लीटर समाधान के 1 मिलीलीटर DEPC। कभी-कभी मिलाते हुए, और आटोक्लेव के साथ रात भर सेते हैं)। 200 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में बनाओ कांच के बने पदार्थ या कम से कम 6 घंटे के लिए उच्च और RNase परिशोधन समाधान के साथ प्लास्टिक के बर्तन का इलाज।
    2. दिन 1: बर्फ पर कांच की शीशी में (एसिटिक एसिड: 1 इथेनॉल 3) में ऊतक स्लाइस किसान तय की 10 मिलीलीटर विसर्जित ~। बाद सभी नमूनों विच्छेदित कर दिया गया है, vacuu लागूमीटर हवा के बुलबुले और लगानेवाला की सहायता पैठ हटा दें। वैक्यूम के अंतर्गत पकड़ के लिए 10 मिनट फिर धीरे धीरे वैक्यूम जारी। लगानेवाला बदलें और कोमल झटकों के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. दिन 2: समाधान के निम्नलिखित श्रृंखला में सेते हैं, ~ 10 मिलीलीटर प्रत्येक, 1 घंटा प्रत्येक, कोमल झटकों के साथ सभी; 4 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस पर 100% इथेनॉल में 100% इथेनॉल में 100% इथेनॉल में 95% इथेनॉल, 1 पर 85% इथेनॉल: 1 इथेनॉल: कमरे के तापमान पर Xylenes, कमरे के तापमान पर 100% Xylenes, कमरे के तापमान पर 100% Xylenes।
      नोट: Xylenes संपर्क और साँस लेना द्वारा विषाक्त कर रहे हैं। एक धूआं हुड में काम करने और उचित दस्ताने का उपयोग करें।
    4. पैराफिन ऊतक मध्यम छर्रों embedding Xylenes की लगभग आधी मात्रा में जोड़ें और कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर रातोंरात सेते हैं।
    5. दिन 3: 60 डिग्री सेल्सियस ओवन के लिए शीशी स्थानांतरण तक छर्रों पिघला। समाधान डालो और ताजा पिघला ऊतक एम्बेडिंग मध्यम के साथ बदलें। मध्यम दो बार बदलेंदिन के दौरान।
    6. 4 दिन: ऊतक बदलें सुबह में एक बार मध्यम embedding। दोपहर तक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन पर लौटें।
  4. कास्ट ब्लॉकों
    1. ऊतक एम्बेडिंग स्टेशन के गर्म थाली पर एम्बेड नए नए साँचे रखें। कटौती की सतह के नीचे का सामना करना पड़ के साथ embedding नए नए साँचे के लिए ऊतक के नमूने हस्तांतरण करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। पिघल आयल के साथ मोल्ड ऊपर और मोल्ड के शीर्ष पर एम्बेड अंगूठी जगह है। एक ठंडा प्लेट को हस्तांतरण तक आयल जम गया है। सिलिका जेल के साथ एक कंटेनर में स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन ब्लॉकों।

2. सेक्शनिंग और स्लाइड तैयारी

  1. एक microtome 25 पर 10 माइक्रोन वर्गों में कटौती।
  2. रिबन की जांच करने और मंझला वर्गों चुनें। माध्य वर्गों उन है कि सैम, जो पत्ती primordia से घिरे कोशिकाओं का एक गुंबद के रूप में प्रकट होता है शामिल हैं।
  3. स्लाइड पर माउंट वर्गों।
    1. जगह स्लाइड कि एलएम के लिए उपयुक्त हैं (या तो RNase मुक्त यापके हुए) 42 डिग्री पर गर्म स्लाइड और स्लाइड को कवर करने के लिए 50% इथेनॉल समाधान की कई बूँदें लागू सी।
    2. इथेनॉल समाधान पर वर्गों फ्लोट तक वर्गों का विस्तार किया है।
      नोट: इथेनॉल समाधान के बजाय पानी पर तैरती वर्गों एक उपजी राज्य आरएनए गिरावट को कम करने में शाही सेना रहता है।
    3. स्लाइड झुकाव और एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण विंदुक के साथ आकांक्षा से अतिरिक्त इथेनॉल समाधान निकालने। किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल समाधान दूर बाती प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे का प्रयोग करें।
    4. कई घंटे के लिए या रात भर के 42 डिग्री सेल्सियस पर सूखी स्लाइड। स्टोर सिलिका जेल के साथ एक कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड।
  4. Deparaffinize के उपयोग के दिन पर स्लाइड।
    1. तीन गिलास Coplin युक्त जार तैयार करें; 100% Xylenes (मैं Xylenes), 100% Xylenes (Xylenes द्वितीय), और 100% इथेनॉल (~ प्रत्येक समाधान के 50 एमएल)।
    2. साफ संदंश का उपयोग कर स्लाइड हस्तांतरण करने के लिए, 2 मिनट के लिए Xylenes में विसर्जित स्लाइड मैं, Xylenes द्वितीय 2 मिनट और 1 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के लिए।
    3. नाली गिरावटकमरे के तापमान पर एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे और शुष्क हवा पर es।

3. Plastochron 7 पत्ता primordia से ब्लेड, ligule और म्यान नमूने की Microdissection

  1. एलएम खुर्दबीन के मंच पर स्लाइड सुरक्षित। प्रत्येक को दोहराने के लिए पांच या छह स्लाइड्स का प्रयोग करें, स्लाइड प्रति पांच वर्गों का उपयोग।
    नोट: ऊतक एक भी दोहराने के लिए पूलिंग चित्रा 5 में सचित्र है।
  2. स्लाइड की जांच करने और केंद्रीय संदर्भ बिंदु के रूप में सैम शीर्ष का उपयोग कर प्रत्येक स्लाइड पर पांच सबसे मंझला वर्गों की पहचान,।
    नोट: यह कम बढ़ाई किया जा सकता है, आम तौर पर एक 5X उद्देश्य के लिए पर्याप्त है।
  3. 10x या 20x उद्देश्य का उपयोग, प्रत्येक अनुभाग के plastochron 7 पत्ती उत्स पर ligule की स्थिति की पहचान। ligule एक टक्कर पत्ती उत्स के adaxial सतह से फैलने वाला के रूप में दिखाई जाएगी। इस स्थिति एलएम सॉफ्टवेयर की ड्राइंग उपकरण का उपयोग मार्क; पेंसिल आइकन का चयन करें, उचित स्थिति में कर्सर ले जाने केपर और क्लिक करें और माउस आकर्षित करने के लिए खींचें।
    नोट: एक 10x या 20X उद्देश्य इस और बाद के चरणों के लिए उपयुक्त है। पार्श्व वर्गों का उपयोग कर, प्रत्येक पत्ती उत्स के दो पक्षों के प्रत्येक अनुभाग (2A चित्रा) में उपस्थित रहेंगे।
  4. शासक उपकरण और आयताकार ड्राइंग उपकरण का उपयोग, 100 माइक्रोन उच्च आयतों प्रत्येक अनुभाग के ligule पर केंद्रित (लाल आयत, चित्रा 2A, 2 बी) को मापने। ये "ligule" नमूना होगा।
    1. शासक उपकरण का उपयोग करने के लिए; शासक आइकन का चयन करें, वस्तु के एक छोर पर कर्सर ले जाने मापा जा करने के लिए, क्लिक करें और खींचें वस्तु को मापने के लिए। शासक की लंबाई स्क्रीन पर दिखाया जाएगा।
    2. एक आयत आकर्षित करने के लिए; आयत आइकन का चयन करें, एक बात यह है कि आयत के एक कोने हो, क्लिक करें और उचित आकार की एक आयत आकर्षित करने के लिए खींचें करने के लिए कर्सर ले जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, सीधी रेखा ड्राइंग उपकरण का चयन करें और चार सीधे लाइनों आकर्षित।
    3. उपाय 100 माइक्रोन आयतों 50 माइक्रोन से ऊपर और नीचे "ligule" आयत तैनात हैं।
      नोट: ये "ब्लेड" और "म्यान" नमूने, क्रमशः (हरे और नीले आयत, चित्रा 2A, 2 बी) हो जाएगा। हमारे ऊतकीय डेटा के आधार पर, एक 100 माइक्रोन आयत पूरे ligule क्षेत्र शामिल हैं। ब्लेड और म्यान के बराबर भागों आकार कि यह सुनिश्चित करने के ऊतकों की समान मात्रा में प्रत्येक के लिए एकत्र किए गए थे चुने गए हैं। 50 माइक्रोन की Spacers सुनिश्चित करें कि कोई ligule क्षेत्र ऊतक अनजाने ब्लेड या म्यान microdissections में शामिल है इस्तेमाल किया गया।
  5. Microdissect मापा आयतों (चित्रा 2 डी - 2 एफ) 7, 8, 9, अलग नलियों में ligule, ब्लेड और म्यान के नमूने इकट्ठा। लेजर कट समारोह का प्रयोग करें चयनित डोमेन की रूपरेखा के साथ ऊतक अनुभाग के माध्यम से कटौती करने के लिए। CATA का प्रयोग करेंpult समारोह स्लाइड बंद और ट्यूब (- 2 एफ चित्रा 2 डी) के ढक्कन में ऊतकों की आयत प्रेरित करने के लिए।

4. Plastochron 7 पत्ता primordia से ब्लेड, ligule और म्यान adaxial एपिडर्मल नमूने की Microdissection

  1. वर्गों का चयन करें और धारा 3 (ऊपर) में वर्णित के रूप में, 100 माइक्रोन उच्च plastochron 7 ligule पर केन्द्रित खंडों को मापने के लिए शासक उपकरण का उपयोग करें।
    1. ड्राइंग उपकरण के साथ रूपरेखा द्वारा प्रत्येक 100 माइक्रोन उच्च "ब्लेड" और "म्यान" खंड (हरे और नीले रंग के चयन, चित्रा -2) का केवल adaxial एपिडर्मल कोशिकाओं का चयन करें। एपिडर्मिस बाहरी सेल परत है; adaxial पक्ष एक सैम के सबसे करीब है।
    2. "Ligule" नमूना के लिए, उभरते ligule टक्कर की ही कोशिकाओं की धारा 3.3 (लाल चयन, चित्रा -2) में वर्णित के रूप में चयन करें।
  2. Microdissect चयनित क्षेत्रों का संग्रह, ब्लेड, ligule और एक प्रकार का वृक्षवें खंड 3.5 में वर्णित के रूप में, अलग ट्यूबों में नमूने epidermis।

Lg1 आर और जंगली प्रकार भाई बहन से Plastochron 6 पत्ता primordia 5. Microdissection

  1. उत्परिवर्ती (lg1-आर) और जंगली प्रकार के पौधों के परिवारों को अलग हो जाना।
  2. एलएम के लिए ठीक करें और इस प्रक्रिया को शूट apices, वर्गों 1.2-1.4 में वर्णित है। ताकि उन्हें अलग रखने के लिए जंगली प्रकार और अलग शीशियों में उत्परिवर्ती शूट apices को ठीक करें। एक ही रोपण से नमूने तय की और सीटू संकरण में लिए कार्रवाई की जानी चाहिए।
  3. निर्धारित बनाने के लिए जहां lg1 जंगली प्रकार भाई बहन में लिखित है स्वस्थानी संकरण 6, 26, 27 में lg1 प्रदर्शन से। उपाय कई नमूने (चित्रा 1E) में पत्ती उत्स के आधार से lg1 प्रतिलेख संचय की स्थिति।
  4. सीटू संकरण डेटा के आधार पर, पत्ती Primo के हिस्से को चुनेंrdium है कि इस क्षेत्र में जहां lg1 लिखित है शामिल हैं। इस मामले में, plastochron 6 पत्ती primordia (बैंगनी आयत, 2A चित्रा) के आधार से 400-900 माइक्रोन।
  5. Microdissect धारा 3.5 में वर्णित के रूप में चयनित पत्ती primordia के हिस्से, अलग ट्यूबों में एकत्रित lg1 आर और जंगली प्रकार के नमूने हैं।

6. लागू आरएनए निष्कर्षण बफर

  1. microdissected ऊतक करने के लिए 50 μl आरएनए निष्कर्षण बफर लागू करें और आरएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें। संदर्भ 6 में वर्णित के रूप में शाही सेना निष्कर्षण, आरएनए प्रवर्धन, पुस्तकालय निर्माण, अनुक्रमण और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।

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Representative Results

एलएम योजना चित्रा 2 में उल्लिखित है, लगभग 1,000,000-1,500,000 माइक्रोन 2 टिशू से प्रत्येक के लिए एकत्र किया गया था का उपयोग कर सभी सेल की परतों एलएम में (चित्रा 5) को दोहराने, और 200,000 माइक्रोन 2 प्रति adaxial एपिडर्मिस एलएम के लिए पेश करता है। लगभग 2,500,000 माइक्रोन ऊतक के 2 प्रत्येक lg1 आर और जंगली प्रकार पत्ती primordia के एलएम में दोहराने के लिए एकत्र किया गया था। रैखिक प्रवर्धन आरएनए के दो दौर प्रत्येक को दोहराने के लिए शाही सेना के माइक्रोग्राम मात्रा झुकेंगे। शाही सेना की राशि किसी भी microdissection से प्राप्त सेल आकार और ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से कब्जा कर लिया ऊतक की मात्रा पर निर्भर करेगा। शाही सेना की अखंडता आरएनए प्रवर्धन की क्षमता को प्रभावित करेगा।

ट्रांसक्रिप्ट संचय ब्लेड, ligule और म्यान क्षेत्रों के सभी सेल परतों और 2359 DE जनरल के कुल में विश्लेषण किया गया थाes के एक झूठे खोज दर (एफडीआर) <0.05 (चित्रा 6A) के साथ, पाए गए। विशेष रूप से, 1,714 जीन ligule और ब्लेड के बीच डे थे, 1,044 जीन ligule और म्यान के बीच डे थे, और 657 जीनों ब्लेड और म्यान के बीच डे थे (कुछ जीन एक से अधिक तुलना में डे) कर रहे हैं। जीन अगर वे काफी दोनों में upregulated थे ब्लेड की तुलना में ligule के रूप में ligule क्षेत्र में upregulated में वर्गीकृत किया गया और ligule म्यान की तुलना में। सभी सेल परतों एलएम में, 373 जीनों काफी ligule क्षेत्र में upregulated थे।

ट्रांसक्रिप्ट संचय adaxial एपिडर्मिस ब्लेड, ligule और म्यान क्षेत्रों में विश्लेषण किया गया था और 3128 डे जीन की कुल मिला कर रहे थे; 1971 जीन, ligule और ब्लेड के बीच डे थे 2,032 जीन ligule और म्यान के बीच डे थे, और 871 जीनों ब्लेड और म्यान (चित्रा 6B) के बीच डे थे। 287 जीनों काफी ब्लेड और म्यान ईपी की तुलना में ligule में upregulated थेidermis।

चयनित जीन के लिए डेटा है कि ligule क्षेत्र में upregulated कर रहे हैं 1 टेबल और चित्रा 7 में प्रस्तुत कर रहे हैं। सीटू संकरण विश्लेषण में एक प्रारंभिक संकेत दिया कि lg1 टेप पीएलबी और जंगली प्रकार पत्ती primordia के उभरते ligule में विशेष रूप से जमा है, और कहा कि lg1 अधिक अत्यधिक आंतरिक सेल परतों (चित्रा 6C) की तुलना में एपिडर्मिस में लिखित है। एलएम शाही सेना seq डेटा प्राप्त किया गया है कि इस परिणाम के साथ संगत कर रहे हैं; lg1 प्रतिलेख संचय या तो ब्लेड या दोनों एपिडर्मल एलएम और सभी सेल परतों (तालिका 1, चित्रा 7A) के एलएम में म्यान में से ligule में काफी अधिक है। lg1 सभी सेल परतों, चित्रा 8 में सचित्र परिदृश्य के लिए इसी तरह के विश्लेषण में से एपिडर्मल विश्लेषण में एक उच्च सीपीएम है।

NS1 काफी ligule क्षेत्र में दोनों सभी सेल परतों एलएम और adaxial एपिडर्मिस एलएम (तालिका 1, चित्रा 7B) में upregulated था। यह निष्कर्ष सीटू संकरण, जो दिखाता है कि NS1 प्रतिलेख उभरते ligule (चित्रा 6D) की नोक में विशेष रूप से जम जाता है में से पुष्टि की गई। NS1 सभी सेल परतों (19.6 सीपीएम और 2.7 सीपीएम, क्रमशः) सभी परतों एलएम में प्रतिलेख के कमजोर पड़ने की वजह से एलएम में से एपिडर्मिस केवल एलएम विश्लेषण में एक बहुत अधिक पढ़ा गिनती है। इस कमजोर पड़ने प्रभाव चित्रा 8A में सचित्र है। इसी तरह, GRMZM2G101682, अज्ञात समारोह की एक जीन, सभी परतों एलएम (तालिका 1, चित्रा 7C) की तुलना में ligule एपिडर्मल एलएम में एक उच्च मतलब पढ़ा गिनती की थी। बगल में संकरण से पता चला है इस जीन प्रतिलिपि भी जम जाता है कि सबसे जोरदार एपिडर्मल कोशिकाओं (चित्रा 6E) में। ZM PIN1a सभी सेल परतों के विश्लेषण में डे काफी नहीं था, लेकिन काफी एपिडर्मिस केवल विश्लेषण में ligule (तालिका 1, चित्रा 7 दिन) में upregulated था। इसका कारण यह है ZM PIN1a अत्यधिक संवहनी ऊतकों में व्यक्त किया जाता है और इस एल 2 व्युत्पन्न संवहनी अभिव्यक्ति एपिडर्मिस में ZM PIN1a संचय में मतभेद घालमेल कर दिया जब सभी सेल परतों एकत्र कर रहे हैं (चित्रा 6F) सबसे अधिक संभावना है। एक ऐसी ही स्थिति चित्रा 8B में दिखाया गया है।

जीन है कि lg1 आर म्यूटेंट में डे की पहचान करने के लिए, प्रतिलिपि संचय प्रकार के जंगली और lg1 आर पी 6 पत्ती primordia का एक निर्धारित क्षेत्र में तुलना में था। नब्बे छह जीनों lg1-आर में De थे (एफडीआर <0.05); 59 lg1 आर म्यूटेंट में downregulated रहे थे, और 37 upregulated थे। चयनित जीन में है कि डे के लिए डेटा <उन्हें> lg1 आर म्यूटेंट 2 तालिका में प्रस्तुत कर रहे हैं। bel14 34 जीन है कि दोनों प्रकार के जंगली पत्ती primordia में ligule क्षेत्र में upregulated और lg1 आर म्यूटेंट में downregulated कर रहे हैं में से एक है। बगल में संकरण की पुष्टि की है कि bel14 टेप प्रकार के जंगली पौधों में लेकिन lg1 आर पत्ती primordia 6 की इसी क्षेत्र में नहीं preligule क्षेत्र में जमा है।

चित्र 2
चित्रा 2: पत्ती मौलिक डोमेन की लेजर microdissection के लिए योजना। (ए) मक्का शूट एपेक्स एलएम के लिए कार्रवाई की पार्श्व अनुदैर्ध्य अनुभाग। बक्से microdissection के लिए चयनित क्षेत्रों से संकेत मिलता है। Ligule क्षेत्र ऊतक (लाल बॉक्स) 100 माइक्रोन उच्च आयत, पीएलबी पर केंद्रित से microdissected किया गया था। पूर्व ब्लेड (हरा) और पूर्व म्यान (नीला) ऊतक 100 माइक्रोन से लिया गया50 माइक्रोन से ऊपर है और क्रमश: preligule चयन नीचे rectangles। पी 6 पत्ती primordia के आधार से जंगली प्रकार और lg1 आर transcriptomes, ऊतकों की तुलना 400-900 माइक्रोन के बीच के लिए पार्श्व वर्गों (बैंगनी धराशायी लाइन) से microdissected किया गया था। (बी) P7 उत्स और क्षेत्रों के सभी सेल परतों के microdissection के लिए चयनित बंद हुआ। (सी) P7 उत्स और क्षेत्रों adaxial एपिडर्मिस की microdissection के लिए चयनित बंद हुआ। (डी) Preligule microdissection पहले P7 उत्स के क्षेत्र। Arrowhead ligule की शुरुआत की स्थिति को इंगित करता है। (ई) रेड लाइन microdissection के लिए चयनित क्षेत्र इंगित करता है। लेजर इस रेखा के साथ कटौती करेगा। सर्किलों अंक जहां लेजर दालों ऊतक गुलेल होगा संकेत मिलता है। (एफ) microdissection के बाद उत्स। सर्किलों अंक जहां लेजर दालों ऊतक पहुंचा दिया संकेत मिलता है। सैम = शिखर विभज्योतक गोली मार। पी plastochron नंबर इंगित करता है। स्केल सलाखों = 100 &# 181; मी। यह आंकड़ा संदर्भ 6 (प्लांट जीव के कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी) से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: क्षेत्र एलएम के लिए चयनित किया है कि जीन पत्ती उत्स साथ डे रहे हैं के लिए पढ़ें मायने रखता प्रभावित करता है। (ए) रूपात्मक स्थलों के एलएम रिश्तेदार के लिए चयनित क्षेत्र की सही स्थिति का पत्ता अक्ष के साथ एक ढाल में व्यक्त जीनों के लिए भिन्नता कम कर देता है। बाईं तरफ प्रतिकृति में 1-3, चयन उभरते ligule कम भिन्नता है, जिसके परिणामस्वरूप पर केन्द्रित कर रहे हैं। सही पर प्रतिकृति में 1-3, एल एम के लिए चयनित क्षेत्र की स्थिति में वृद्धि हुई भिन्नता है, जिसके परिणामस्वरूप संगत नहीं है। (बी) microdissecting एक लगातार आकार रोंचुनाव ligule विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ जीनों के लिए भिन्नता (बाईं ओर 1-3 प्रतिकृति) विभिन्न आकार चयन microdissecting की तुलना में (सही पर 1-3 प्रतिकृति) कम कर देता है। देखिए अधिक बड़ा चयन में पतला कर रहे हैं, एक कम पढ़ा गिनती में जिसके परिणामस्वरूप, और छोटे चयन में अधिक ध्यान केंद्रित किया, एक उच्च पढ़ा गिनती में जिसके परिणामस्वरूप। कार्टून ligule क्षेत्र में पत्ती primordia के माध्यम से अनुदैर्ध्य वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं। Arrowhead ligule की शुरुआत का संकेत है। सीपीएम = लाख प्रति मायने रखता है। एसडी = मानक विचलन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: पार्श्व वर्गों के लिए मक्का अंकुर के विच्छेदन। (क) दो सप्ताह पुरानी मक्का अंकुर जड़ गोली मार जंक्शन पर excised। पतले स्लाइस मंगलवार हटायेओम शूट (1) कल्म का एक छोटा सा अंडाकार तक के आधार शूट के आधार पर दिख रहा है। अनुप्रस्थ आधार (2) के ऊपर लगभग 10 मिमी कटौती और इस सिलेंडर को बनाए रखने सुनिश्चित करें। (बी) के ऊतक के सिलेंडर उन्मुख इसलिए आधार सामना करना पड़ रहा है। नोट पत्ती से घेर लिया कल्म का अंडाकार। दो अनुदैर्ध्य कटौती पार्श्व अक्ष (3 और 4) के समानांतर बनाओ। को बनाए रखने और ऊतकों की केंद्रीय टुकड़ा को ठीक है, इस भाग सैम और युवा पत्ती primordia शामिल होंगे। (सी) कार्टून शूट एपेक्स के माध्यम से पार्श्व खंड (हरी धराशायी लाइन) के विमान को दर्शाता हुआ। लाल वृत्त को इंगित करता है midrib, लाल नोक ग्रे पत्ती उत्स के हाशिये इंगित करता है। midrib मार्जिन अक्ष: ब्लू लाइन धराशायी। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: कार्टून ligule क्षेत्र में से एक को दोहराने के लिए लेजर microdissected ऊतक की पूलिंग को दर्शाता हुआ। पांच से छह स्लाइड से microdissected ऊतक प्रत्येक को दोहराने के लिए जमा किया जाता है। प्रत्येक स्लाइड से पांच मंझला वर्गों उपयोग किया जाता है और दो चयन (लाल आयतों) प्रत्येक खंड से बना रहे हैं। प्रत्येक आयत लगभग 20,000 माइक्रोन 2 है। प्रत्येक को दोहराने के लिए ऊतक एक अलग ट्यूब (ब्लू ओवल) में एकत्र किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: पत्ती क्षेत्रों के बीच और चयनित डे जीन की स्वस्थानी संकरण में जोड़ो में तुलना में डे जीनों की संख्या। (ए) डे जीनों की संख्या के बीच जोड़ो में तुलना मेंब्लेड, ligule और म्यान क्षेत्रों, सभी सेल परतों के एलएम। (बी) डे जीनों की संख्या ब्लेड, ligule और म्यान क्षेत्रों, केवल adaxial एपिडर्मिस के एल एम के बीच जोड़ो में तुलना में। (सी) lg1 में सीटू संकरण। (डी) स्वस्थानी संकरण में NS1। (ई) स्वस्थानी संकरण में GRMZM2G101682। (एफ) स्वस्थानी संकरण में ZmPIN1a। डे: विभिन्न व्यक्त। पहनाना एल में: ligule में, बी में ऊपर: ब्लेड में। पहनाना एस में: म्यान में। सीएफ में तीर ligule उभरते संकेत मिलता है। एफ में तीर संवहनी ऊतकों में प्रतिलेख संचय इंगित करता है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा संदर्भ 6 (प्लांट जीव के कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी) से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

टी = "चित्रा 7" src = "/ files / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
चित्रा 7: चयनित डे जीनों के लिए डेटा की चित्रमय प्रतिनिधित्व। चित्रा 1 टेबल में और सीटू संकरण परिणामों में प्रस्तुत आंकड़ों को दिखाता है। कार्टून पत्ती primordia के माध्यम से अनुदैर्ध्य वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं। गहरे नीले रंग की एक विशेष जीन के लिए प्रतिलिपि संचय इंगित करता है। हरे, लाल और नीले बक्से ब्लेड, ligule और म्यान के नमूने के लिए microdissection के लिए चयनित क्षेत्र से संकेत मिलता है। बाईं तरफ के कार्टून सभी सेल परतों के एलएम वर्णन। सही पर कार्टून केवल adaxial एपिडर्मिस की एलएम वर्णन। विज्ञापन: adaxial एपिडर्मिस, एबी: abaxial एपिडर्मिस, सीपीएम: लाख प्रति मायने रखता है, तारांकन दो डोमेन के बीच महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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8 चित्रा: कार्टून illustrating कैसे काल्पनिक डे जीनों के लिए मायने रखता है पढ़ microdissection के लिए चुना सटीक क्षेत्रों के आधार पर अलग। (ए) ligule विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ जीन। (बी) के जीन ligule में और संवहनी ऊतकों में व्यक्त किया। (सी) जीन सभी सेल परतों में ligule क्षेत्र में है, लेकिन एपिडर्मिस में उच्च अभिव्यक्ति के साथ विशेष रूप से व्यक्त की है। (डी) जीन ligule क्षेत्र में व्यक्त की, केवल एल 2 व्युत्पन्न सेल परतों। कार्टून पत्ती primordia के माध्यम से अनुदैर्ध्य वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं। गहरे नीले रंग की एक विशेष जीन के लिए प्रतिलिपि संचय इंगित करता है। हरे, लाल और नीले बक्से ब्लेड, ligule और म्यान के नमूने के लिए microdissection के लिए चयनित क्षेत्र से संकेत मिलता है। बाईं तरफ के कार्टून सभी सेल परतों के एलएम वर्णन। सही पर कार्टून केवल adaxial एपिडर्मिस की एलएम वर्णन। विज्ञापन: adaxial एपिडर्मिस, एबी: abaxial एपिडर्मिस, सीपीएम: cou प्रति दस लाख एनटीएस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: चयनित जीन मौलिक ligule में upregulated। प्रति दस लाख गिनता: Benjamini और होचबर्ग विधि के अनुसार झूठे खोज दर: प्रति मिलियन कुल टेप मायने रखता है, तीन प्रतिकृति, logFC = लॉग आधार 2 गुना बदलें, FDR.BH का मतलब है। सभी परतों: सभी सेल परतों के एलएम। एपिडर्मिस: केवल adaxial एपिडर्मिस की एलएम। यह आंकड़ा संदर्भ 6 (प्लांट जीव के कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी) से संशोधित किया गया है। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ई 2 "src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
तालिका 2: चयनित जीन डे lg1 आर म्यूटेंट में। प्रति दस लाख गिनता: Benjamini और होचबर्ग विधि के अनुसार झूठे खोज दर: प्रति मिलियन कुल टेप मायने रखता है, तीन प्रतिकृति, logFC = लॉग आधार 2 गुना बदलें, FDR.BH का मतलब है। यह आंकड़ा संदर्भ 6 (प्लांट जीव के कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी) से संशोधित किया गया है। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रायोगिक डिजाइन शाही सेना seq प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण कारक है। महत्वपूर्ण विचार सटीक डोमेन (एस) और विकास मंच (ओं) का विश्लेषण किया जाए, और क्या तुलना बनाया जा जाएगा रहे हैं। यह तुलना के संदर्भ में सोचने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि आम तौर पर उत्पादन जीन है कि दो या दो से अधिक की स्थिति के बीच de रहे हैं की एक सूची है। सभी प्रयोगों के साथ के रूप में, यह एक समय में केवल एक चर को बदलने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, जब विभिन्न पत्ती डोमेन की तुलना, का एक ही उम्र और विकास मंच, एक ही परिस्थितियों में उगाया तुलना की जानी चाहिए छोड़ देता है।

इन प्रयोगों के उद्देश्य जीन है कि विशेष रूप से ऊपर या जंगली प्रकार पत्ती primordia के ligule क्षेत्र में नीचे विनियमित रहे हैं की पहचान करने के लिए, और जीन है कि जंगली प्रकार की तुलना में lg1 आर म्यूटेंट में डे की पहचान करने के लिए किया गया था। हम पहले विकासशील पत्ती primordia की आकृति विज्ञान और lg1 प्रतिलेख संचय के पैटर्न का अध्ययन किया। ये रूपात्मक और आणविक स्थलों wअरे एल एम 14, 15, 16 के लिए सटीक डोमेन का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पहले प्रयोग में, ligule क्षेत्र में प्रतिलेख संचय ही पत्ता primordia के अन्य क्षेत्रों की तुलना में था, इस प्रकार विकास की स्थिति, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, विकास मंच, और संयंत्र के लिए संयंत्र भिन्नता के कारण मतभेद दूर करने। जंगली प्रकार के लिए उत्परिवर्ती तुलना करने के लिए है, यह निर्धारित करने के लिए जहां और जब ब्याज की जीन व्यक्त किया है आवश्यक है। हम या तो सीटू संकरण या immunolocalization में अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने और उस जीन अभिव्यक्ति के अधिकार क्षेत्र शामिल एलएम के लिए एक क्षेत्र का चयन सलाह देते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि बराबर डोमेन तुलना कर रहे हैं और आनुवंशिक पृष्ठभूमि दोनों उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के लिए एक ही है।

microdissections की सटीकता, जीन है कि ब्याज के क्षेत्र में विशेष रूप से व्यक्त कर रहे हैं के लिए पढ़ा मायने रखता जाँच द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, अगर सुचर्चा जीन जाना जाता है। यह भी एलएम ऊतक अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों बनाने के लिए पहले से निकाले शाही सेना पर आरटी पीसीआर प्रदर्शन से किया जा सकता है। यहाँ वर्णित प्रयोगों में, lg1 ligule क्षेत्र के एल एम के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा की है, के बाद से सीटू संकरण दिखाया गया था कि विश्लेषण में lg1 अभिव्यक्ति पीएलबी के लिए विशिष्ट है और उभरते ligule 5, 6।

ऐसे RT-qPCR, जहां उम्मीदवार जीन (एस) के नाम से जाना चाहिए के रूप में विधियों के विपरीत, शाही सेना seq एक दिया ऊतक के नमूने में सभी टेप के संचय quantifies। इस प्रकार, एलएम शाही सेना seq उम्मीदवार जीनों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी तरीका है। इस अध्ययन से एक उदाहरण GRMZM2G101682, अज्ञात समारोह की एक जीन एक हड़ताली ligule विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न (चित्रा 6E) किया है। इस अध्ययन में भी इस तरह के रूप में bel14 जीन है कि lg1-आर में डी कर रहे हैं, जो पहले से lg1 के बहाव के अभिनय के रूप में फंसा नहीं किया गया था की पहचान की। इस मैएस उदाहरण के लिए, एकाधिक डेटा सेट की तुलना (जंगली प्रकार ligule क्षेत्र और lg1-आर में डे में upregulated) विशेष रूप से जानकारीपूर्ण था। यह ध्यान रखें कि एक जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न अपने कार्य को प्रदर्शित नहीं करता है महत्वपूर्ण है: बाद में आनुवंशिक और / या जैव रासायनिक विश्लेषण जीन समारोह की स्थापना के लिए आवश्यक हैं।

Transcriptomic विश्लेषण करती है कि छोटे, असतत विकास डोमेन है, जो विभिन्न अलग और आसानी से चित्रित कर रहे हैं पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, सबसे सफल रहे हैं। एलएम शाही सेना seq इस तरह के विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त तरीका है और संभावित कई विकासात्मक घटना के लिए लागू किया गया है। यह विशेष रूप से जीन है कि स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न, या म्यूटेंट कि विशिष्ट संरचनाओं के विकास को प्रभावित प्रतिबंधित कर दिया है की म्यूटेंट में अंतर जीन अभिव्यक्ति की पहचान के लिए अनुकूल है। यह भी प्रक्रियाओं है कि इस तरह के एपिडर्मिस या वाहिका के रूप में विशिष्ट पहचान योग्य और कोशिकाओं या ऊतकों में घटित करने के लिए लागू किया जा सकता है, और में इस्तेमाल किया गया हैमक्का की एक transcriptomic विश्लेषण गोली मार शिखर विभज्योतक (एसएएम) ontogeny 16। यह कम जीन है कि सर्वत्र व्यक्त कर रहे हैं के समारोह के अध्ययन के लिए या प्रक्रियाओं है कि सभी कोशिकाओं में पाए जाते हैं के लिए उपयुक्त है। यहाँ प्रस्तुत तरीकों को सफलतापूर्वक पौधों की प्रजातियों (मक्का, बाजरा, Ocimum, मेंथा और Antirrhinum) और संरचनाओं (पत्ती primordia, मेरिस्टेमों, rhizomes और ट्राइकोम) की एक किस्म के लिए लागू किया गया है।

एलएम की आवश्यकता नहीं है, जब एक विश्लेषण अपेक्षाकृत बड़ी डोमेन शामिल है। दरअसल, हाथ से विच्छेदित या पूरे अंगों पर शाही सेना Seq सफलतापूर्वक, 15 संयंत्रों में 14 डे जीनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह दृष्टिकोण कम श्रम गहन होने का फायदा है और histological तकनीक के साथ कोई अनुभव आवश्यक है। हालांकि, वहाँ हाथ विच्छेदन की परिशुद्धता के लिए सीमाएं हैं, जिसका अर्थ है कि हाथ विच्छेदन जल्दी डी के अध्ययन के लिए कम उपयुक्त हैevelopmental प्रक्रियाओं।

सफल एलएम शाही सेना Seq विकासात्मक घटना के विश्लेषण के लिए, विकास के संदर्भ में अच्छी तरह से विशेषता किया जाना चाहिए। हम एक प्रयोग की योजना बना रहा से पहले प्रक्रिया या ब्याज के डोमेन का पूरी तरह से ऊतकीय परीक्षा के उपक्रम सलाह देते हैं। एलएम के लिए कार्रवाई नमूने के ऊतक विज्ञान को आम तौर पर गरीब है, के बाद से ऊतकों बेदाग रहे हैं और कवर फिसल जाता है कि गहराई के क्षेत्र उपलब्ध कराने के साथ मुहिम शुरू नहीं कर रहे हैं। इसलिए, यह एक ही समय में धुंधला और अवलोकन के लिए अलग नमूने ठीक करने के लिए के रूप में एलएम नमूने तय कर रहे हैं (चित्रा 1 सी और डी) उपयोगी है।

एलएम सामग्री से प्राप्त आरएनए आम तौर पर खंडित है और कुल उपज कम 8 है। एक प्रवर्धन कदम पुस्तकालय तैयारी के लिए पर्याप्त 28 आरएनए उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। आरएनए टुकड़ा लंबाई प्रवर्धन के बाद और पुस्तकालय पीढ़ी से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए। एसई के एक औसत टुकड़ा लंबाईveral सौ आधार जोड़े आम तौर पर अच्छा माना जाता है, 500 आधार जोड़े उत्कृष्ट है। गरीब शाही सेना उपज परिणाम हो सकता है अगर ऊतक अच्छी तरह से तय है, अगर गिरावट की वजह से RNase प्रदूषण होता है, या पैराफिन ब्लॉकों को गलत तरीके से जमा हो जाती है अगर नहीं है। यह बहुत छोटा डोमेन microdissecting करने के लिए समय की एक बहुत devoting से पहले एक अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र के एक परीक्षण एलएम उपक्रम द्वारा तय ऊतक की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए उपयोगी है। क्योंकि आरएनए एलएम कोशिकाओं से प्राप्त एक oligo डीटी प्राइमर एक मजबूत 3 'पूर्वाग्रह का परिचय का उपयोग कर खंडित और प्रवर्धन है, इस विधि में इस तरह के ब्याह वेरिएंट के रूप में वैकल्पिक टेप का पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं है। न ही एलएम छोटे RNAs का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।

एक वैकल्पिक तरीका विशिष्ट ऊतकों या सेलुलर डोमेन में प्रतिलेख संचय यों की छंटनी (FACS) 21 प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा अलग कक्षों की शाही सेना seq है। इस विधि को आम तौर पर ब्याज के क्षेत्र के लिए एक उपयुक्त मार्कर जीन की पहचान की आवश्यकताएक फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन और protoplasting व्यक्त ट्रांसजेनिक पौधों की पीढ़ी। माइक्रोएरे के साथ संयुक्त FACS जड़ 22, 23 में सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों व्यक्त कोशिकाओं को अलग करके Arabidopsis जड़ की अभिव्यक्ति के नक्शे उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। शूटिंग के ऊतकों के FACS क्लोरोफिल autofluorescence 24 के कारण जड़ ऊतकों की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण है। एलएम की एक सीमा है कि ब्याज की डोमेन ऊतकीय वर्गों में पहचाने जाने होना चाहिए। FACS मामलों में एक अधिक उपयुक्त विधि जहां एक उपयुक्त जीन मार्कर उपलब्ध है हो सकता है। विकल्प है जो की कोशिकाओं या ऊतकों को अलग और तुलना करने के लिए transcriptomic विश्लेषण है कि या तो FACS या एलएम का उपयोग करने में एक महत्वपूर्ण विचार है।

यहाँ प्रस्तुत डेटा वर्णन है कि अलग-अलग परिणाम प्राप्त हो जाएगा एलएम (चित्रा 3, 8 चित्रा के लिए चुना सटीक डोमेन पर निर्भर करता है)। जीन है कि इस तरह के NS1 के रूप में एक या कुछ कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं के देखिए, जब बड़े ऊतक डोमेन विश्लेषण कर रहे हैं पतला हो जाएगा। यह संभावना है कि यदि पूरी पत्ती primordia नमूना थे, NS1 प्रतिलिपि नहीं पाया जा होता है। ZmPIN1a काफी ब्लेड और म्यान एपिडर्मिस की तुलना में ligule में upregulated है, लेकिन इस अंतर नाड़ी अभिव्यक्ति से चकित है जब सभी सेल परतों जांचा जाता है। इसके विपरीत, जीन है कि केवल एल 2 व्युत्पन्न सेल परतों में व्यक्त कर रहे हैं जब केवल एपिडर्मिस नमूना है (चित्रा 8D) पता नहीं होगा। यह अध्ययन यह दर्शाता है कि, जबकि एलएम शाही सेना Seq morphogenesis दौरान जीन अभिव्यक्ति में मतभेद का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, विश्लेषण के लिए चुने गए डोमेन के प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं।

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Acknowledgments

लेखकों के सहयोग से चल रही है और ligule विकास के बारे में विचार विमर्श के लिए उत्तेजक एस हेक धन्यवाद। यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान एमसीबी 1052051 और IOS-1848478 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl pyrocarbonate Sigma-Aldrich 159220 Used for RNase treatment of solutions
Razor blades  Electron Microscopy Sciences 72000
RNase Zap Sigma-Aldrich R2020-250ML RNase decontamination solution
Ethanol absolute 200 proof Fisher Scientific BP28184
Acetic acid, glacial Sigma-Aldrich A6283
Glass vials - 22 ml VWR 470206-384
Xylenes, histological grade Sigma-Aldrich 534056-4L
Paraplast plus Sigma-Aldrich P3683-1KG
Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm VWR 15154-072
Embedding rings VWR 15154-303
Silica gel packets Electron Microscopy Sciences 71206-01 Desiccant for storage of paraffin blocks
Oven Fisher Scientific 15-103-0503 Oven must maintain temperature of 60 °C
Paraffin embedding station Leica  EG1160
Microtome Leica  RM2235
Slide warmer Electron Microscopy Sciences 71317-10
Coplin jars Electron Microscopy Sciences 70316-02
Laser microdissector Zeiss
KIMWIPES™ Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 34120 Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides
Membrane Slide 1.0 PEN Zeiss 415190-9041-000 Slides for laser microdissection
Adhesive Cap 200 opaque Zeiss 415190-9181-000 Tubes for laser microdissection
PicoPure RNA Isolation Kit ThermoFisher Scientific KIT0204

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References

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Johnston, R. M., Sylvester, A. W., Scanlon, M. J. Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development. J. Vis. Exp. (121), e55004, doi:10.3791/55004 (2017).

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