Abstract
Genes com funções importantes no desenvolvimento têm frequentemente padrões de expressão espacial e / ou temporalmente limitados. Muitas vezes, estes transcritos do gene não são detectados ou não são identificados como diferencialmente expressos (DE) em análises transcriptomic de órgãos vegetais inteiros. Laser Microdissecção RNA-Seq (LM RNA-Seq) é uma ferramenta poderosa para identificar genes que são DE em domínios específicos de desenvolvimento. No entanto, a escolha de domínios celulares para microdissect e comparar, e a precisão dos microdissecações são cruciais para o sucesso dos experimentos. Aqui, dois exemplos ilustram as considerações de design para experiências transcriptômica; LM uma análise de RNA-Seq para identificar genes que são dé ao longo do eixo proximal-distal folha de milho, e uma segunda experiência para identificar genes que estão em liguleless1 DE-R (LG1-R) mutantes em comparação com o tipo selvagem. Os principais elementos que contribuíram para o sucesso desses experimentos foram detalhados histológica e em siTU hibridação análises da região a ser analisada, selecção de primórdios foliares nas fases de desenvolvimento equivalentes, a utilização de pontos de referência morfológicas para seleccionar regiões de microdissecação, e microdissecação de domínios precisamente medidos. Este documento proporciona um protocolo detalhado para a análise de domínios de desenvolvimento por LM RNA-Seq. Os dados aqui apresentados ilustram como a região selecionada para microdissection irá afetar os resultados obtidos.
Introduction
A folha de milho é um modelo ideal para estudar a formação de campos de desenvolvimento durante a morfogénese, uma vez que tem uma fronteira distinta entre a lâmina e a bainha que é passível de dissecção genética (Figura 1A). Durante as fases iniciais do desenvolvimento foliar, uma faixa linear de células menores, a banda preligule (PLB), subdivide o primórdio foliar em domínios pré-lâmina e pré-bainha. A ligule franja-like e aurículas triangulares desenvolver a partir da PLB (Figura 1A, C, D). telas genéticas identificaram mutações que perturbam o limite lâmina de bainha. Por exemplo, liguleless1 recessivo (LG1) mutações excluir o ligule e aurículas 1, 2, 3, 4 (Figura 1B). A hibridação in situ revelou que LG1 transcrição acumula no PLB e ligule emergentes, tornando-se um excelente marcador para o desenvolvimento ligule 5, 6 (Figura 1E).
Figura 1: Tipo selvagem e folhas de milho liguleless1-R. (A) a região Blade-bainha limite da folha de tipo selvagem maduro mostrando estruturas ligule e aurícula. (B) a região Blade-bainha limite da maturidade liguleless1-R folha que mostra ausência de estruturas ligule e aurícula. Folhas em A e B foram cortadas pela metade ao longo da nervura central. (C) longitudinal secção através primórdio foliar de tipo selvagem. Amostra foi processada e corados para análise histológica. A lígula iniciadora é evidente como uma colisão que sobressai a partir do plano da folha (ponta de seta). (D) seita Longitudinalíon através primórdio folha de tipo selvagem. Amostra foi processada por LM como descrito no texto. Arrowhead indica iniciar ligule. (E) lg1 hibridização in situ de corte longitudinal lateral do ápice filmagem. Os asteriscos indicam acumulação transcrição lg1 na PLB do primórdio foliar P6. As setas indicam a base do P6 primórdio. A barra indica a medição a partir da base de o primórdio da PLB. As barras de escala em A e B = 20 mm. As barras de escala em Ce = 100 uM. Esta figura foi modificado a partir da referência 6 (Copyright: Sociedade Americana de biólogos da planta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Neste estudo, LM RNA-Seq foi empregue para identificar um conjunto de genes que são expressos diferencialmente (DE) para a lâmina de bainha limite em relação a outras partes do primórdio foliar e de IDE genes ntify que estão DE em mutantes lg1-R em relação aos irmãos de tipo selvagem. LM RNA-Seq é um método de quantificação de acumulação de transcrição em células específicas ou domínios celulares 7. sistemas lineares combinar um laser e um microscópio com uma câmera digital. tecido é seccionado montadas em lâminas e visualizaram pelo microscópio. O software LM normalmente inclui ferramentas de desenho que permitem ao usuário para delinear qualquer região selecionada para microdissection. Os cortes a laser ao longo da linha, e o tecido selecionado é catapultado para fora da lâmina e em um tubo suspenso acima do slide. LM permite que o usuário microdissect domínios precisos, incluindo camadas de células específicas e até mesmo células individuais 8, 9. ARN pode então ser extraído a partir do tecido microdissecados. Subsequentemente, o componente de RNA-Seq utiliza a próxima geração de sequenciação para sequenciar bibliotecas de cDNA geradas a partir do RNA extraído 10,= "xref"> 11.
Principais vantagens do LM RNA-seq são a capacidade de quantificar a acumulação de transcrição em domínios bem definidos ea capacidade ao perfil todo o transcriptoma simultaneamente 7. A técnica é particularmente adequada para sondagem eventos precoces de desenvolvimento, onde a região de interesse é muitas vezes microscópica. Estudos anteriores têm utilizado LM combinado com a tecnologia de microarrays para estudar processos de desenvolvimento em plantas 9, 12, 13. RNA-Seq tem a vantagem de quantificar transcritos de uma vasta gama dinâmica, incluindo os genes de baixo-expresso, e informação da sequência anterior não é necessária 10, 11. Além disso, LM RNA-Seq tem o potencial para destacar genes desenvolvente importantes que podem ser perdidas em telas de mutagénese devido à redundância genética ou a letalidade da perda de de-função mutante.
Genes Developmentally importantes, como sheath1 estreita (NS1) e em forma de taça cotyledon2 (CUC2), muitas vezes têm padrões de expressão específicas de apenas uma ou algumas células 17, 18, 19, 20. Muitos são expressos apenas durante as fases iniciais de desenvolvimento e não no órgão maduro. Quando órgãos inteiros ou grandes domínios são analisados, estes transcritos específicos de células são diluídas e não pode ser detectada em análises mais convencionais. Ao permitir análises de domínios bem definidos, LM RNA-Seq permite que estes genes específicos de tecido a ser identificados e quantificados.
factores cruciais para o sucesso das experiências descritas aqui foram uma análise histológica minuciosa que orientou a seleção do estágio de desenvolvimento apropriado e de domínio para análise e MeasureMe precisant de domínios de tecido celular para LM. Para assegurar que os domínios equivalentes foram amostrados de todas as repetições, o tecido foi recolhido a partir de primórdios foliares, ao mesmo estágio de desenvolvimento e os domínios microdissecadas foram medidos em relação a pontos de referência morfológicas, tais como a lígula emergente (Figura 2). Sabe-se que alguns genes são expressos em um gradiente a partir da ponta para a base da folha. Ao medir domínios precisos, devido à variação de amostragem a partir de diferentes locais ao longo do eixo proximal-distal folha foi mantido a um mínimo (Figura 3A). Por microdissecting domínios do mesmo tamanho, devido a variação diferencial de diluição de transcritos específicos de células também foi reduzida (Figura 3B). secções laterais longitudinais do ápice filmagem foram usadas para todos os microdissecações. Estes são secções que são perpendiculares ao eixo nervura central-margem (Figura 4). Usando apenas as seções que incluem a SAM assegura que as regiões laterais equivalentes deprimórdios foliares são analisados.
Em amostras processadas e seccionados para LM, o primeiro sinal morfológico de crescimento ligule é um inchaço no lado adaxial devido a divisões celulares periclinais na epiderme adaxial (Figura 1D, Figura 2). Determinou-se que o ligule emergentes poderiam ser identificados de forma confiável no plastocrono 7 primórdios foliares palco. Nós estávamos interessados em genes expressos em toda a região ligule, incluindo a ligule emergentes e as células imediatamente distais que formarão a aurícula. A fim de assegurar que as selecções de tecido equivalente foram feitas, a colisão lígula foi usada como um ponto de referência morfológica e um rectângulo de 100 um centrada na protuberância lígula foi seleccionado para LM (Figura 2A, 2B). rectângulos de dimensão equivalente de pré-lâmina e pré-bainha foram seleccionados a partir dos mesmos primórdios foliares.
As análises de plantas mutantes liguleless apresentada uma diferente challeESL; lg1-R mutantes não formam um ligule, portanto, esse recurso morfológica não poderia ser usado para selecionar a região de LM. Em vez disso, foi determinado o domínio de transcrição acumulação LG1 em primórdios foliares de tipo selvagem, e uma região que abrange este domínio foi definido. Estas análises preliminares foram realizadas em plântulas a partir do mesmo plantação como foram usadas para a análise final, uma vez que o trabalho anterior demonstrou que a localização do PLB varia dependendo das condições de crescimento. A hibridação in situ indicaram que os transcritos LG1 acumulam no PLB de P6 primórdios foliares (Figura 1E). Nós seleccionado um domínio de 400-900 ^ M a partir da base do primórdios foliares, que englobava o domínio de expressão LG1 (rectângulos roxo, Figura 2A) e capturou estas regiões equivalentes do de tipo selvagem e plantas LG1-R. Para minimizar a variação de fundo e de crescimento genéticos condições quando se comparam transcripforam usadas acumulação t em LG1-R e plantas de tipo selvagem, segregando famílias de mutantes e de tipo selvagem irmãos.
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Protocol
NOTA: Fix tecidos para análise histológica, ao mesmo tempo que o tecido é fixado por LM. Examinar secções coradas para características morfológicas que guiarão depois LM. Ao comparar mutante com o tipo selvagem, efectuar hibridização in situ ou imunolocalização de definir o domínio em que o gene de interesse é expresso (neste caso LG1).
1. fixação do tecido e Processamento
- Crescer apartamentos de plântulas de milho com duas semanas de idade, sob condições padrão 6.
- Dissecar ápices vegetativos para as secções laterais (Figura 4).
- mudas Excise logo abaixo da linha do solo.
- Usando uma lâmina de barbear, remover fatias finas a partir da base da haste (cortes 1, Figura 4A) até uma oval de colmo circundado por uma ou duas folhas maduras é visível (Figura 4B).
- Faça outro corte aproximadamente 10 mm acima da base (cortar 2, Figura 4A).Este segmento 10 milímetros irá conter o SAM e primórdios de folhas jovens.
- Vire o segmento de 10 mm, de forma a base está voltada para cima. Fazer dois cortes paralelos ao eixo lateral de modo a que um pedaço de tecido de 2-3 mm de espessura, é obtido (cortes 3 e 4, Figura 4B). Descartar o exterior duas partes e manter a fatia central para fixação e incorporação.
NOTA: folhas exteriores podem ser aparadas e descartado.
- Fixar o tecido e o processo para a incorporação.
- Assegurar que todos os materiais a serem utilizados nos passos subsequentes são realizados a RNase livre. Tratar soluções com pirocarbonato de dietilo (DEPC) (1 ml de DEPC por litro de solução. Incubar durante a noite com agitação ocasional, e autoclave). Coza artigos de vidro em um forno a 200 ° C ou superior durante pelo menos 6 horas e tratar artigos de plástico com uma solução de descontaminação de RNase.
- Dia 1: Imergir fatias de tecido em ~ 10 ml de solução de Farmer (3: 1 etanol: ácido acético) em frasco de vidro em gelo. Depois de todas as amostras foram dissecados, aplicar vacuum para remover as bolhas de ar e de penetração ajuda de fixador. Mantenha sob vácuo, durante 10 min, em seguida, liberar o vácuo lentamente. Substituir fixador e incubar a 4 ° C durante a noite com agitação suave.
- Dia 2: Incubar à seguinte série de soluções, ~ 10 ml cada, 1 h cada, todos com agitação suave; 85% de etanol a 4 ° C, 95% de etanol a 4 ° C, 100% de etanol a 4 ° C, 100% de etanol a 4 ° C, 100% de etanol a 4 ° C, 1: 1 de etanol: xilenos, à temperatura ambiente, 100% xilenos, à temperatura ambiente, 100% xilenos, à temperatura ambiente.
NOTA: xilenos são tóxicas por contato e inalação. Trabalhar em um exaustor e usar luvas apropriadas. - Adicionar tecido inclusão em parafina peletes médias para aproximadamente metade do volume de xilenos e incubar durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave.
- Dia 3: Transferir o frasco a 60 ° C forno até derreter os peletes. Decantar solução e substituir por meio de incorporação de tecido derretido fresco. Mudar o meio mais duas vezesdurante o dia.
- Dia 4: Alteração do tecido de meio de inclusão, uma vez de manhã. Voltar para 60 ° C forno até tarde.
- blocos elenco
- Coloque moldes de incorporação na placa quente de estação de incorporação de tecidos. Utilize uma pinça para transferir as amostras de tecido para os moldes embutindo com a superfície de corte voltada para baixo. Encher o molde com parafina derretida e colocar o anel de incorporação na parte superior do molde. Transfira para um prato fria até parafina tem solidificado. Armazenar os blocos de parafina, a 4 ° C num recipiente hermético com gel de sílica.
2. corte e Deslize Preparação
- Cortar 10 mm seções em um micrótomo 25.
- Examinar fitas e escolha seções medianas. secções medianos são aqueles que incluem o SAM, que aparece como uma cúpula de células rodeado por primórdios foliares.
- seções de montagem em lâminas.
- Colocar as lâminas que são adequados para LM (ou RNase livre oucozido) em 42 ° C deslizar mais quente e aplique algumas gotas de solução de etanol a 50% para cobrir o slide.
- Flutuar seções sobre solução de etanol até que as secções têm expandido.
NOTA: Flutuante seções sobre solução de etanol em vez de água mantém RNA em um estado precipitado reduzir a degradação do RNA. - Inclinação lâmina e remover a solução de etanol em excesso por aspiração com uma pipeta de transferência descartável. Use toalhetes sem fiapos para afastar qualquer solução de etanol adicional.
- lâminas seco a 42 ° C durante várias horas ou durante a noite. Loja desliza a 4 ° C num recipiente hermético com gel de sílica.
- Desparafinar desliza no dia da utilização.
- Prepare três frascos de vidro de Coplin contendo; 100% xilenos (xilenos I), 100% xilenos (xilenos II) e 100% de etanol (~ 50 mL de cada solução).
- Usando fórceps limpas para transferir lâminas, mergulhe as lâminas em xilenos I durante 2 min, xilenos II durante 2 min, e 100% de etanol durante 1 min.
- dreno deslizoues sobre toalhetes sem fiapos e secar ao ar à temperatura ambiente.
3. Microdissecção de Blade, lígula e bainha Amostras de plastocrono 7 Folha Primordia
- Garantir os slides no palco do microscópio LM. Use cinco ou seis lâminas para cada repetição, utilizando cinco secções por slide.
NOTA: Tissue utilização comum para uma única réplica é ilustrada na Figura 5. - Examinar as lâminas e identificar as cinco seções mais medianos em cada slide, utilizando o SAM ápice como o ponto de referência central.
NOTA: Este pode ser feito a baixa ampliação, geralmente um objectivo 5X é suficiente. - Usando 10X ou 20X objectivo, identificar a posição do lígula no plastocrono 7 primórdio foliar de cada secção. O ligule será visível como um galo que sobressai da superfície adaxial do primórdio foliar. Marque esta posição usando a ferramenta de desenho do software LM; selecione o ícone do lápis, mova o cursor para o positi apropriadaon e clique e arraste o mouse para desenhar.
NOTA: A 20X objetiva de 10X ou é apropriado para este e os passos subsequentes. Ao utilizar secções laterais, os dois lados de cada primórdio foliar estará presente em cada secção (Figura 2A). - Usando a ferramenta régua e a ferramenta de desenho retangular, mede 100 mm altas retângulos centradas no ligule de cada seção (retângulos vermelhos, Figura 2a, 2b). Estes serão a amostra "Lígula".
- Para usar a ferramenta régua; selecione o ícone de régua, mova o cursor para uma das extremidades do objeto a ser medido, clique e arraste para medir o objeto. O comprimento da régua será mostrado na tela.
- Para desenhar um retângulo; selecione o ícone do retângulo, mova o cursor para um ponto que será um canto do retângulo, clique e arraste para desenhar um retângulo do tamanho apropriado. Como alternativa, selecione a ferramenta de desenho linear e desenhar quatro linhas retas.
- medida 100 uM rectângulos posicionado 50 mm acima e abaixo do rectângulo "Lígula".
NOTA: Estes serão os "Blade" e amostras "Bainha", respectivamente (verde e azul retângulos, Figura 2a, 2b). Com base em nossos dados histológicos, um retângulo mm 100 abrange a região ligule inteiro. tamanho porções equivalentes de lâmina e bainha foram escolhidos para garantir que quantidades semelhantes de tecidos foram coletadas para cada um. Os espaçadores de 50 pM foram usados para garantir que nenhum tecido região lígula inadvertidamente é incluído nas microdissecações lâmina ou bainha.
- Microdissect medida retângulos (Figura 2D - 2F) 7, 8, 9, coletando amostras Lígula, lâminas e bainhas em tubos separados. Utilizar a função de corte a laser para cortar através da secção de tecido ao longo do contorno do domínio seleccionado. Use o catafunção pult para impulsionar o rectângulo de tecido da lâmina e para a tampa do tubo (Figura 2D - 2F).
4. Microdissecção de Blade, lígula e Bainha adaxial da epiderme Amostras de plastocrono 7 Folha Primordia
- Selecionar seções e usar a ferramenta régua para medir 100 mm elevados segmentos centrados no ligule plastocrono 7, como descrito na seção 3 (acima).
- Selecione apenas as células da epiderme adaxial de cada 100 mm alta "Blade" e "bainha" segmento (verde e azul seleções, figura 2C), descrevendo com a ferramenta de desenho. A epiderme é a camada celular externa; o lado adaxial é o mais próximo do SAM.
- Para a amostra "Lígula", selecionar apenas as células da colisão ligule emergindo como descrito na Seção 3.3 (seleção vermelho, Figura 2C).
- regiões Microdissect selecionada, recolhendo Blade, Lígula e Sheath epiderme amostras em tubos separados, como descrito na seção 3.5.
5. Microdissecção de plastocrono 6 Folha Primordia de lg1-R e do tipo selvagem Irmãos
- Crescer segregando famílias de mutante (lg1-R) e as plantas do tipo selvagem.
- Fix e filmagem processo ápices para LM, conforme descrito nas seções 1,2-1,4. Fix do tipo selvagem e ápices vegetativos mutantes em frascos separados, a fim de mantê-los separados. As amostras da mesma plantação deve ser fixados e processados para hibridação in situ.
- Determinar em que LG1 é transcrito em irmãos de tipo selvagem, através da realização de LG1 a hibridação in situ de 6, 26, 27. Posição de acumulação de transcrição lg1 de base do primórdio da folha em várias amostras (Figura 1E) medir.
- Com base em dados de hibridização in situ, escolha porção do primo folhardium que engloba a região em que LG1 é transcrito. Neste caso, 400-900 ^ M a partir da base de plastocrono 6 primórdios foliares (rectângulos roxo, Figura 2A).
- Microdissect selecionada parte da primórdios foliares, como descrito na seção 3.5, recolhendo lg1-R e as amostras de tipo selvagem em tubos separados.
6. Aplique RNA Tampão de Extracção
- Aplicar 50 ul de tampão de extração de RNA para o tecido microdissecção e prosseguir com a extração de RNA. Continue com a extração de RNA, amplificação RNA, construção de biblioteca, sequenciamento e análise bioinformática como descrito na referência 6.
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Representative Results
Usando o esquema LM delineado na Figura 2, a cerca de 1,000,000-1,500,000 mm 2 de tecido foi recolhida para cada replicar no todo-cell-camadas LM (Figura 5), e 200.000 mm 2 por replicar para a epiderme adaxial LM. Aproximadamente 2 uM 2.500.000 de tecido foi colhido para cada replicar no LM de LG1-R e primórdios foliares de tipo selvagem. Duas rondas de amplificação de ARN lineares produziram quantidades de micrograma de RNA para cada replicado. A quantidade de ARN obtido a partir de qualquer dada microdissecação vai depender do tamanho das células e a actividade de transcrição, assim como a quantidade de tecido capturado. A integridade do ARN irá afectar a eficiência da amplificação de ARN.
acumulação de transcritos foram analisados em todas as camadas de células da lâmina, e regiões lígula bainha e um total de 2.359 DE genES foram encontrados, com uma taxa de falsos descoberta (FDR) <0.05 (Figura 6A). Especificamente, 1.714 genes foram DE entre ligule e lâmina, 1.044 genes foram DE entre ligule e bainha, e 657 genes eram DE entre a lâmina e bainha (alguns genes são a Alemanha, em mais de uma comparação). Os genes foram classificados como regulada positivamente na região lígula se eles foram significativamente regulada positivamente em ambos lígula comparação com lâmina e lígula comparação com bainha. Na LM todas as camadas de células, 373 genes foram significativamente upregulated na região ligule.
acumulação de transcrição foi analisada nas regiões lâmina epiderme, lígula e bainha adaxial e um total de 3.128 genes DE foram encontrados; 1.971 genes foram DE entre ligule e lâmina, 2.032 genes foram DE entre ligule e bainha, e 871 genes eram DE entre a lâmina e bainha (Figura 6B). 287 genes foram significativamente regulada positivamente no lígula comparação com lâmina e EP bainhaidermis.
Os dados para os genes seleccionados que são regulados positivamente na região lígula são apresentados na Tabela 1 e na Figura 7. Um inicial na análise de hibridação in situ indicaram que os transcritos LG1 acumulam especificamente no PLB e o lígula emergente de primórdios foliares de tipo selvagem, e que LG1 é mais altamente transcritos na epiderme do que nas camadas celulares internas (Figura 6c). A LM dados RNA-seq que foram obtidos são consistentes com esse resultado; acumulação transcrição LG1 é significativamente mais elevada no lígula do que em qualquer lâmina ou bainha, tanto no LM LM epidérmica e de todas as camadas de células (Tabela 1, Figura 7A). LG1 tem um CPM maior na análise epidérmica do que na análise de todas as camadas de células, semelhante ao cenário ilustrada na Figura 8C.
NS1 foi significativamente regulada positivamente na região lígula em ambos os todas as camadas de células LM e o LM epiderme adaxial (Tabela 1, Figura 7B). Esta constatação foi confirmada por hibridação in situ, o que mostra que se acumula especificamente transcrito NS1 na ponta do lígula emergente (Figura 6D). NS1 tem uma contagem lido muito mais elevada na epiderme somente análise LM LM em que todas as camadas de células (19,6 CPM CPM e 2,7, respectivamente), devido à diluição da transcrição no LM todas as camadas. Esse efeito de diluição está ilustrado na Figura 8A. Da mesma forma, GRMZM2G101682, um gene de função desconhecida, tinham uma contagem média ler maior no LM epidérmica lígula do que em todas as camadas do LM (Tabela 1, Figura 7C). A hibridação in situ revelou que este transcrito do gene também se acumula mais fortemente em células epidérmicas (Figura 6E). Zm PIN1a não foi significativamente DE na análise de todas as camadas de células, mas foi significativamente regulada positivamente no lígula na análise epiderme apenas (Tabela 1, Figura 7D). Isto é mais provável porque Zm PIN1a é altamente expresso nos tecidos vasculares e esta expressão vascular derivado de L2 confunde diferenças na acumulação Zm PIN1a na epiderme, quando todas as camadas de células foram recolhidas (Figura 6F). Um cenário semelhante é mostrada na Figura 8B.
Para identificar genes que estão em mutantes DE lg1-R, a acumulação de transcrição foi comparado em uma região definida de tipo selvagem e primórdios foliares lg1-R P6. Noventa e seis genes eram DE nas lg1-R (FDR <0,05); 59 foram regulados negativamente em mutantes LG1-R, e 37 foram regulados positivamente. Os dados para genes selecionados que são a Alemanha, em <em> mutantes LG1-R estão apresentados na Tabela 2. bel14 é um dos 34 genes que são regulados positivamente tanto na região lígula em primórdios foliares de tipo selvagem e mutantes em downregulated LG1-R. A hibridização in situ confirmaram que as transcrições bel14 acumular na região preligule em plantas de tipo selvagem mas não na região correspondente de LG1-R 6 primórdios foliares.
Figura 2: Esquema de microdissecção a laser de domínios primordiais da folha. (A) corte longitudinal lateral do ápice do milho disparar processados para LM. Caixas indicam regiões selecionadas para microdissection. tecidos região Lígula (caixa vermelha) foi microdissectados a partir de 100 mm retângulos altos, centradas no PLB. Pré-lâmina (verde) e no tecido pré-bainha (azul) foi feita a partir de 100 uMrectângulos 50 mm acima e abaixo da selecção preligule respectivamente. Para a comparação do tipo selvagem e transcriptomes LG1-R, tecido entre 400-900 ^ M a partir da base de primórdios foliares P6 foi microdissecado a partir de secções laterais (roxo linha a tracejado). (B) Close-up de P7 primórdio e regiões selecionados para microdissection de todas as camadas celulares. (C) Close-up de P7 primórdio e regiões selecionados para microdissection da epiderme adaxial. (D) Preligule região de P7 primórdio antes microdissection. Arrowhead indica a posição de iniciar ligule. (E) linha vermelha indica região selecionada para microdissection. O laser será cortado ao longo desta linha. Círculos indicam pontos onde pulsos de laser irá catapultar tecido. (F) Primordium após microdissecção. Círculos indicam pontos onde pulsos de laser catapultaram tecido. SAM = atira meristema apical. P indica o número plastocrono. Barras de escala = 100 &# 181; m. Esta figura foi modificado a partir da referência 6 (Copyright: Sociedade Americana de biólogos da planta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A região selecionada para LM afeta as contagens de leitura para genes que são dé ao longo do primórdio foliar. (A) O posicionamento preciso da região seleccionada para a LM em relação a pontos de referência morfológicas reduz a variação de genes expressos num gradiente ao longo do eixo da folha. Em repetições 1-3 na esquerda, as seleções estão centradas na ligule emergentes resultando em baixa variação. Em repetições 1-3 sobre o direito, o posicionamento da região selecionada para LM não é consistente resultando em aumento da variação. (B) Microdissecting um tamanho consistente seleição reduz a variação (replica 1-3 à esquerda) em comparação com microdissecting diferentes seleções porte (replica 1-3 à direita) para genes com padrões de expressão específicos de ligule. Os transcritos estão mais diluída na selecção maior, o que resulta numa contagem de leitura mais baixa, e mais concentrada na selecção mais pequena, o que resulta numa contagem lido superior. Cartoons representam cortes longitudinais através primórdios foliares na região ligule. Arrowhead indica iniciar ligule. CPM = contagens por milhão. DP = desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A dissecção de mudas de milho para as secções laterais. (A) de plântulas de milho Duas semanas de idade excisadas na junção raiz-shoot. Remover finas fatias from base da filmagem (1) até um pequeno oval de colmo é visível na base do tiro. Verifique corte transversal aproximadamente 10 mm acima da base (2) e manter esse cilindro. (B) Cilindro de tecido orientada de modo base está voltada para cima. Nota oval de colmo cercada por folha. Fazer dois cortes longitudinais paralelos ao eixo lateral (3 e 4). Reter e corrigir fatia central do tecido, esta parte irá incluir o SAM e primórdios de folhas jovens. (C) dos desenhos ilustrando plano de corte lateral (verde linha tracejada) através ápice filmagem. círculo vermelho indica nervura central, seta vermelha indica margens do primórdio foliar cinza. Linha tracejada azul: eixo midrib-margem. Escala da barra = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cartoon ilustrando partilha de laser para tecido microdissectados para uma réplica da região ligule. Tissue microdissectados de cinco a seis lâminas é agrupada para cada repetição. Cinco seções medianas de cada slide são utilizados e duas selecções (retângulos vermelhos) são feitos de cada seção. Cada retângulo é de aproximadamente 20.000 mm 2. Tecidos para cada repetição é coletado em um tubo separado (oval azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Número de genes De em comparações de pares entre as regiões da folha e da hibridação in situ de genes DE seleccionados. (A) Número de genes DE em comparação aos pares entreregiões blade, lígula e bainha, LM de todas as camadas celulares. (B) Número de genes DE em comparação aos pares entre as regiões blade, lígula e bainha, LM de apenas epiderme adaxial. (C) LG1 a hibridação in situ. (D) NS1 de hibridação in situ. (E) GRMZM2G101682 hibridação in situ. (F) ZmPIN1a hibridação in situ. DE: expresso diferencialmente. Up in L: em ligule, em B:-se na lâmina. Em S:-se na bainha. Pontas de seta em CF indicam ligule emergente. Arrow in F indica acúmulo de transcritos nos tecidos vasculares. Barras de escala = 100 pm. Esta figura foi modificado a partir da referência 6 (Copyright: Sociedade Americana de biólogos da planta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 7: Representação gráfica de dados para genes DE selecionados. A Figura ilustra os dados apresentados na Tabela 1 e nos resultados de hibridação in situ. Cartoons representam cortes longitudinais através primórdios foliares. azul escuro indica acúmulo de transcritos para um gene particular. caixas verdes, vermelhos e azuis indicam região selecionada para microdissection para amostras de lâmina, lígula e bainha. Desenhos do lado esquerdo ilustram LM de todas as camadas de células. Cartoons à direita ilustram LM de apenas epiderme adaxial. Ad: adaxial epiderme, AB: epiderme abaxial, CPM: contagens por milhões, asterisco indica diferença significativa entre os dois domínios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 8: dos desenhos animados que ilustra como ler as contagens de genes DE hipotéticas diferem consoante as regiões precisas selecionados para microdissection. (A) do gene com expressão específica de lígula. (B) o gene expresso em lígula e nos tecidos vasculares. (C) gene expresso especificamente na região lígula em todas as camadas de células, mas com a expressão mais elevada na epiderme. (D) gene expresso na região lígula, apenas as camadas de células-derivadas L2. Cartoons representam cortes longitudinais através primórdios foliares. azul escuro indica acúmulo de transcritos para um gene particular. caixas verdes, vermelhos e azuis indicam região selecionada para microdissection para amostras de lâmina, lígula e bainha. Desenhos do lado esquerdo ilustram LM de todas as camadas de células. Cartoons à direita ilustram LM de apenas epiderme adaxial. Ad: epiderme adaxial, AB: epiderme abaxial, CPM: cou nts por milhão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Selected genes regulados positivamente na ligule primordial. Contagens por milhões: contagens por milhão de transcrições no total, com média de três repetições, logFC = log base 2 Alterar Fold, FDR.BH: taxa de detecção falsa de acordo com o método Benjamini e Hochberg. Todas as camadas: LM de todas as camadas de células. Epiderme: LM de apenas epiderme adaxial. Esta figura foi modificado a partir da referência 6 (Copyright: Sociedade Americana de biólogos da planta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
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Tabela 2: Selected genes De em mutantes lg1-R. Contagens por milhões: contagens por milhão de transcrições no total, com média de três repetições, logFC = log base 2 Alterar Fold, FDR.BH: taxa de detecção falsa de acordo com o método Benjamini e Hochberg. Esta figura foi modificado a partir da referência 6 (Copyright: Sociedade Americana de biólogos da planta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
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Discussion
O delineamento experimental é um fator crítico em experimentos de RNA-seq. As principais considerações são o domínio preciso (s) e o estágio de desenvolvimento (s) a ser analisado, e será feito o que comparações. É fundamental pensar em termos de comparações, uma vez que a saída é normalmente uma lista de genes que são De entre duas ou mais condições. Tal como acontece com todas as experiências, é importante para alterar apenas uma variável de cada vez. Por exemplo, quando se comparam diferentes domínios da folha, das folhas da mesma idade e estado de desenvolvimento, cultivadas sob as mesmas condições devem ser comparados.
O objectivo destas experiências foi o de identificar genes que são especificamente para cima ou para baixo-regulado na região de lígula primórdios foliares de tipo selvagem, e para identificar genes que estão em mutantes DE LG1-R em comparação com o tipo selvagem. Em primeiro lugar, estudou a morfologia do desenvolvimento primórdios foliares e do padrão de acumulação transcrição lg1. Estes marcos morfológicos e moleculares were usado para selecionar domínios precisos para LM 14, 15, 16. No primeiro experimento, a acumulação de transcrição na região ligule foi comparado com outras regiões do mesmo primórdios foliares, eliminando assim diferenças devido a condições de crescimento, fundo genético, estágio de desenvolvimento, e variação planta-a-planta. Para comparar mutante com o tipo selvagem, é necessário determinar onde e quando o gene de interesse é expresso. Recomendamos analisando o padrão de expressão por qualquer uma de hibridação in situ ou imunolocalização e seleccionando uma região para LM que abrange o domínio de expressão do gene. É importante que os domínios equivalentes são comparados e que o fundo genético é o mesmo tanto para o tipo selvagem e mutante.
A precisão de microdissecações pode ser verificada por meio de verificação de contagem lido para genes que são expressos especificamente no domínio de interesse, se sugenes ch são conhecidos. Isto também pode ser feito realizando RT-PCR em ARN extraído de tecido LM antes de fazer bibliotecas para sequenciação. Nas experiências aqui descritas, LG1 serviu como um controlo para a LM da região lígula, uma vez que em análises de hibridação in situ mostraram que a expressão LG1 é específico para o PLB e lígula 5, 6 emergente.
Ao contrário de métodos, tais como RT-qPCR, onde o gene (s) candidato deve ser conhecida, de ARN-SEQ quantifica a acumulação de todos os transcritos de uma determinada amostra de tecido. Assim, LM-ARN SEQ é um método útil para identificar genes candidatos. Um exemplo deste estudo é GRMZM2G101682, um gene de função desconhecida, que tem um padrão de expressão específico do lígula marcante (Figura 6E). Este estudo também identificou genes que estão DE nas lg1-R, tais como bel14, que anteriormente não tinham sido implicados como agindo a jusante da lg1. em this exemplo, a comparação de vários conjuntos de dados (regulado positivamente na região de tipo selvagem e DE lígula em LG1-R) foi particularmente informativa. É importante notar que o padrão de expressão de um gene não demonstra a sua função: análises genéticas e / ou bioquímicas subsequentes são necessários para estabelecer a função do gene.
análises transcriptomic que estão focados em pequenos domínios de desenvolvimento distintos, que são diferencialmente distinta e facilmente delineada, são os mais bem sucedidos. LM ARN-seq é um método adequado para tais análises e tem o potencial para ser aplicado a diversos fenómenos de desenvolvimento. É particularmente adequado para identificar a expressão diferencial de genes em mutantes de genes que têm espacialmente restritos padrões de expressão, ou os mutantes que afectam o desenvolvimento de estruturas específicas. Ele também pode ser aplicado a processos que ocorrem em células ou tecidos específicos e identificáveis, tais como a epiderme ou vasculatura, e tem sido utilizado emuma análise do transcriptoma do milho disparar meristema apical (SAM) ontogenia 16. É menos apropriado para estudar a função de genes que são expressos ubiquamente ou a processos que ocorrem em todas as células. Os métodos aqui apresentados foram aplicados com sucesso em uma variedade de espécies de plantas (milho, sorgo, Ocimum, Mentha e Antirrhinum) e estruturas (primórdios foliares, meristemas, rizomas e tricomas).
LM não é necessária quando a análise envolve relativamente grandes domínios. Na verdade, o RNA-Seq em órgãos dissecados mão ou inteiros tem sido usado com sucesso para identificar genes em plantas DE 14, 15. Esta abordagem tem a vantagem de ser menos trabalho intensivo e nenhuma experiência com técnicas histológicas é necessária. No entanto, existem limitações para a precisão das dissecções mão, o que significa que a dissecção mão é menos adequado para estudar d inícioprocessos evelopmental.
Para bem sucedida LM RNA-Seq análises de fenómenos de desenvolvimento, o contexto de desenvolvimento deve ser bem caracterizada. Recomendamos realizar um exame histológico completa do processo ou domínio de interesse antes de planejar um experimento. A histologia de amostras processadas para LM é geralmente pobre, uma vez que os tecidos são não coradas e não são montadas com peças de cobertura que proporcionam uma profundidade de campo. Por isso, é útil para corrigir amostras separadas para a coloração e observação ao mesmo tempo como amostras lineares são fixo (Figura 1C e D).
ARN obtido a partir de material LM é geralmente fragmentado e o rendimento total é baixo 8. Um passo de amplificação é necessária para gerar ARN suficiente para a preparação da biblioteca 28. comprimento de fragmentos de ARN deve ser avaliada após amplificação e antes da geração da biblioteca. Um comprimento médio fragmento de several centenas de pares de bases é geralmente considerada boa, 500 pares de bases é excelente. rendimento de RNA pobre pode resultar se o tecido não está bem fixo, se a degradação devido à RNase contaminação ocorre, ou se blocos de parafina de forma incorrecta são armazenados. É útil para testar a qualidade do tecido fixado mediante a realização de um LM julgamento de uma área relativamente grande antes de dedicar muito tempo para microdissecting muito pequenos domínios. Uma vez que o ARN obtido a partir de células LM é fragmentado e amplificação, utilizando um iniciador oligo dT introduz uma forte 'viés 3, este método não é adequado para a detecção de transcritos alternativos, tais como variantes de splicing. Também não é LM adequado para a detecção de pequenos RNAs.
Um método alternativo de quantificar a acumulação de transcrição em tecidos específicos ou domínios celular é ARN-SEQ de células separadas por fluorescência de células activadas (FACS) 21. Este método requer geralmente a identificação de um gene marcador adequado para a região de interesse,a geração de plantas transgénicas que expressam uma proteína fluorescente marcada com e protoplasting. FACS combinadas com micro-arranjo tem sido utilizado para gerar um mapa de expressão da raiz de Arabidopsis por células que expressam os promotores específicos do tipo de célula na raiz 22, 23 de separação. FACS de tecido da parte aérea é mais desafiador do que tecidos da raiz devido à clorofila autofluorescência 24. Uma limitação do LM é que o domínio de interesse deve ser identificável em cortes histológicos. FACS pode ser um método mais adequado nos casos em que um gene marcador adequado esteja disponível. A escolha de quais as células ou tecidos para isolar e comparar é uma consideração importante em análises que usam transcriptomic FACS ou LM.
Os dados aqui apresentados demonstram que diferentes resultados serão obtidos em função dos domínios seleccionados precisos para LM (Figura 3, Figura 8). Os transcritos de genes que são expressos numa ou algumas células, tais como NS1, será diluída quando os domínios grandes de tecido são analisadas. É provável que se primórdios foliares inteiras foram amostrados, transcrição NS1 não seria detectado. ZmPIN1a é significativamente regulada na ligule comparado a epiderme lâminas e bainhas mas esta diferença é confundida por expressão vascular quando todas as camadas celulares são amostrados. Por outro lado, os genes que são expressos somente em camadas de células-derivadas L2 não será detectado quando apenas a epiderme é amostrado (Figura 8D). Este estudo demonstra que, enquanto LM RNA-Seq é uma ferramenta poderosa para a detecção de diferenças na expressão genética durante a morfogénese, os domínios seleccionados para análise são cruciais para o sucesso da experiência.
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Acknowledgments
Os autores agradecem a S. Hake para em curso colaboração e estimular discussões sobre o desenvolvimento ligule. Este trabalho é apoiado pela National Science Foundation Grants MCB 1052051 e IOS-1848478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
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