Abstract
Гены с важную роль в развитии часто имеют в пространстве и / или во времени ограниченные паттерны экспрессии. Часто эти генные транскрипты не обнаруживаются или не определяются как дифференциально экспрессируются (DE) в транскриптомных анализа целых органов растений. Лазерная микродиссекция-Seq РНК (LM-Seq РНК) является мощным инструментом для идентификации генов, которые DE в конкретных областях развития. Тем не менее, выбор клеточных доменов microdissect и сравнить, и точность microdissections имеют решающее значение для успеха экспериментов. Вот два примера иллюстрируют конструктивные соображения для транскриптомике экспериментов; Л.М. РНК-сл анализ , чтобы идентифицировать гены, которые - де вдоль листа кукурузы проксимальной-дистальной оси, а второй эксперимент , чтобы идентифицировать гены, которые в DE liguleless1-R (lg1-R) Мутанты по сравнению с диким типом. Ключевые элементы , которые внесли свой вклад в успех этих экспериментов были подробно гистологическое и в сиTu гибридизация анализ области для анализа, выбор листа зачатков на эквивалентных стадиях развития, использование морфологических ориентиров для выбора регионов для микродиссекции и микродиссекции точно измеренных доменов. В настоящем документе приводится подробный протокол для анализа областей развития с помощью LM РНК-Seq. Представленные здесь данные показывают, как область выбрана для микродиссекции будет влиять на полученные результаты.
Introduction
Лист кукурузы является идеальной моделью для исследования образования полей развития в процессе морфогенеза, поскольку она имеет четкую границу между лопаткой и оболочкой, которая поддается генетической диссекции (рис 1А). На ранних стадиях развития листьев, линейной полосы более мелких ячеек, то preligule группа (PLB), подразделяет листовой зачаток в предварительно лопаточной и предварительно оболочки доменов. Бахромой, как Язычок и треугольные ушки развиваются из PLB (рис 1А, C, D). Генетические экраны выявили мутации, которые нарушают границу лопастного оболочки. Например, рецессивный liguleless1 (lg1) мутации удаления язычка и ушные раковины 1, 2, 3, 4 (Фигура 1В). В гибридизация показало , что lg1 транскрипт накапливается в РLB и возникающих язычка, что делает его отличным маркером для язычка развития 5, 6 (рис 1E).
Рисунок 1: дикого типа и liguleless1-R листьев кукурузы. (А) граница Блейд-оболочка область зрелого дикого типа листа , показывающий язычка и предсердия структур. (B) граница Блейд-оболочка область зрелого liguleless1-R листьев показывая отсутствие язычка и ушной раковины структур. Листья в А и В были сокращены в два раза вдоль жилки. (С) Продольный разрез через лист примордия дикого типа. Образец был обработан и окрашивают для гистологического анализа. Инициирующий Язычок очевидно как выпуклость, выступающую из плоскости листа (стрелки). (D) Продольная разделиона через лист зачатка дикого типа. Образец был обработан для LM, как описано в тексте. Arrowhead указывает на инициирование язычка. (E) lg1 на месте гибридизации побегов верхушки корня бокового продольного разреза в. Звездочки показывают lg1 накопление транскриптов в PLB от P6 листа зачатка. Стрелки указывают основание P6 зачатка. Бар показывает измерение от основания зачатка к ИПР. Шкала баров в А и В = 20 мм. Шкала баров в CE = 100 мкм. Эта цифра была изменена из ссылки 6 (Авторское право Американского общества биологов растений). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
В этом исследовании, Л.М. Секвенирование РНК был использован, чтобы идентифицировать набор генов, которые дифференциально экспрессируются (DE) на границе лопастного оболочки по отношению к другим частям листа зачатка и Ide ntify гены, которые DE в lg1-R мутантов по отношению к братьев и сестер дикого типа. LM-РНК Seq представляет собой метод количественного накопления транскриптов в специфических клетках или клеточных доменов 7. LM системы сочетают в себе лазер и микроскоп с цифровой камерой. Секционного ткань монтируется на салазках и просмотрены через микроскоп. Программное обеспечение LM обычно включает в себя инструменты для рисования, которые позволяют пользователю выделить любую выбранную область для микродиссекции. Разрезы лазерные вдоль линии, и выбранная ткань катапультировался за пределы слайда и в трубу, подвешенную над слайде. LM позволяет пользователю microdissect точные домены, в том числе специфических клеточных слоев и даже отдельных клеток 8, 9. РНК затем может быть извлечено из микродиссекции ткани. Затем РНК-Seq компонент использует следующего поколения последовательности в последовательности кДНК - библиотек , сгенерированные из извлеченной РНК 10,= "Xref"> 11.
Основные преимущества LM Секвенирование РНК являются способность количественного накопления транскриптов в четко определенных областях и способность к профилю весь транскриптом одновременно 7. Метод особенно подходит для зондирования ранних событий в области развития, где область интереса часто микроскопическими. Предыдущие исследования использовали LM в сочетании с микрочипов технологии для изучения процессов развития растений 9, 12, 13. РНК-Seq имеет преимущество количественной оценки транскриптов в широком динамическом диапазоне, в том числе с низкой экспрессируемых генов, и информация до последовательности не требуется 10, 11. Более того, LM-Seq РНК имеет потенциал, чтобы выделить важные гены уровню развития, которые могут быть пропущены в экранах мутагенеза из-за генетической избыточности или к летальности потерь посещающихфункция мутант.
Развивающих важные гены, такие как узкий sheath1 (ns1) и чашеобразной cotyledon2 (cuc2), часто имеют специфические паттерны экспрессии только один или несколько ячеек 17, 18, 19, 20. Многие выражаются только на ранних стадиях развития, а не в зрелом органе. Когда целые органы или крупные домены анализируются, эти клеточные специфические транскрипты разбавлены и не могут быть обнаружены в более обычных анализах. Допустив анализ точно определенных областей, LM-Seq РНК позволяет эти гены тканеспецифические быть идентифицированы и количественно.
Решающие факторы в успехе экспериментов, описанных здесь, были тщательный гистологический анализ, который руководствовался выбор соответствующей стадии развития и области для анализа и точного MeasureMeнт доменов клеточной ткани для LM. Для того, чтобы гарантировать , что эквивалентные домены были отобраны для всех повторах, ткань была собрана из листьев зачатков на той же стадии развития и микродиссекции домены были измерены относительно морфологических ориентиров , таких как формирующейся язычка (рис 2). Известно, что некоторые гены экспрессируются в градиенте от кончика к основанию листа. Измеряя точные домены, изменение из - за выборки из разных мест вдоль листа проксимальной-дистальной оси была сведена к минимальной (рис 3А). По microdissecting домены одного и того же размера, изменение за счет дифференциальной разбавление клеток специфических транскриптов также была снижена (фигура 3В). Боковые продольные участки верхушки побега были использованы для всех microdissections. Эти участки, перпендикулярные оси жилка рентабельностью (Рисунок 4). Используя только разделы, которые включают SAM гарантирует, что эквивалентные боковые участкилистовые зачатки анализируются.
В образцах , обработанных и секционного для LM, первым морфологическим признаком язычка выроста является шишка на адаксиальную стороне из - за периклинальных клеточных делений в адаксиальной эпидермиса (рис 1D, Рисунок 2). Было установлено, что формирующаяся Язычок может быть надежно идентифицирован на plastochron 7 этап листьев зачатков. Мы были заинтересованы в генах, выраженных во всем регионе язычка, включая формирующейся язычка и клетки немедленно дистальных, которые будут образовывать ушную раковину. Для того , чтобы гарантировать , что выборы эквивалентные ткани были сделаны, Язычок шишка был использован в качестве ориентира морфологического и прямоугольник 100 мкм с серединой на Язычок бугорок был выбран для LM (рис 2А, 2В). Эквивалент размера прямоугольниками предварительного лезвия и предварительной оболочки были выбраны из тех же листьев зачатков.
Анализ liguleless мутантных растений представлены различные ChalleНге; lg1-R мутанты не образуют язычка, поэтому эта морфологическая особенность не может быть использована для выбора региона для LM. Вместо этого область lg1 накопления транскриптов в листьев зачатков дикого типа была определена, и была определена область , которая охватывала бы эту область. Эти предварительные анализы проводили на проростках из того же посадки, которые были использованы для окончательного анализа, поскольку предыдущие исследования показали, что местоположение PLB изменяется в зависимости от условий роста. В гибридизация показали , что lg1 транскрипты накапливаются в PLB Р6 листьев зачатков (рис 1E). Мы выбрали домен 400-900 мкм от основания листа зачатков , который охватывает область lg1 выражения (фиолетовый прямоугольник, рисунок 2А) и захватил эти эквивалентные области из дикого типа и lg1-R растений. Чтобы свести к минимуму изменение генетического фона и условий роста при сравнении transcripбыли использованы т накопление в lg1-R и растений дикого типа, семейства разделения мутантов , братьев и сестер дикого типа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Закрепить ткань для гистологического анализа в то же время, что ткань фиксируется для LM. Изучите окрашенные срезы для морфологических признаков, которые будут направлять позже LM. При сравнении мутанта дикого типа, выполнить гибридизация или иммунолокализации , чтобы определить домен , в котором выражается интерес ген (в данном случае Lg1).
1. Ткань фиксации и обработки
- Grow квартиры рассады кукурузы до двух недель старых в стандартных условиях 6.
- Рассеките стрелять для боковых вершинами секций (Рисунок 4).
- Акцизный рассада чуть ниже линии почвы.
- С помощью лезвия бритвы, удалите тонкие ломтики от основания стебля (режет 1, рисунок 4A) до тех пор , овал соломиной окружен одной или двух зрелых листьев видна (4Б).
- Сделайте еще один разрез примерно на 10 мм выше основания (вырезать 2, рисунок 4А).Этот сегмент 10 мм будет содержать SAM и молодых зачатков листьев.
- Поверните сегмент 10 мм таким образом, основание лицевой стороной вверх. Сделать два разреза , параллельно поперечной оси таким образом , чтобы срез толстой ткани 2-3 мм получается (порезы 3, и 4, 4Б). Отбросить внешние две части и удерживать центральную кусочек для фиксации и вложения.
Примечание: Внешние листья могут быть обрезаны и отбрасывают.
- Закрепить ткань и процесс для встраивания.
- Убедитесь, что все материалы, которые будут использованы в последующих стадиях являются РНКазы. Treat растворы с диэтилпирокарбонат (DEPC) (1 мл DEPC на литр раствора. Выдержите в течение ночи при периодическом встряхивании, и автоклав). Выпекать изделия из стекла в печи при температуре 200 ° C или выше в течение по крайней мере 6 часов и рассматривать пластиковую посуду с обеззараживающим раствором РНКазы.
- День 1: погрузить кусочки ткани в ~ 10 мл затруднительного Фармера (3: 1 смеси этанол: уксусная кислота) в стеклянной пробирке на льду. После того, как все образцы были расчленены, применяются VACUUм, чтобы удалить пузырьки воздуха и проникновение помощи фиксирующих. Держите под вакуумом в течение 10 мин, затем отпустите вакуум медленно. Заменить закрепитель и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи при осторожном встряхивании.
- День 2: Инкубируют в следующей серии решений, ~ 10 мл каждый раз, 1 час каждый, все при осторожном встряхивании; 85% этанола при температуре 4 ° С, 95% этанола при 4 ° С, 100% этанола при 4 ° С, 100% этанола при 4 ° С, 100% этанола при 4 & deg; С, 1: 1 этанол: ксилолов при комнатной температуре, 100% ксилолов при комнатной температуре, 100% ксилолов при комнатной температуре.
Примечание: ксилолов токсичен при контакте и вдыхании. Работа в вытяжном шкафу и использовать соответствующие перчатки. - Добавьте парафин ткани вложение среды гранул приблизительно половину объема ксилолы и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
- 3-й день: Трансфер флакона до 60 ° C духовке до тех пор, пока гранулы расплава. Слейте раствор и заменить свежим расплавленным ткани вложению среды. Изменение средних два раза большев течение дня.
- День 4: Изменение ткани вложение среды один раз утром. Возвращение не до 60 ° C духовке до полудня.
- Литые блоки
- Поместите встраивание формы на плитке тканевого вложении станции. Используйте пинцет, чтобы передать образцы тканей к вложению формы с поверхность среза лицевой стороной вниз. Долить форму с расплавленным парафином и поместить вложение кольцо на верхней части формы. Переход к холодной плите, пока парафин не затвердеет. Храните парафиновые блоки при 4 ° С в герметичном контейнере с силикагелем.
2. Секционирование и слайдов Подготовка
- Вырезать 10 - мкм срезы на микротомом 25.
- Изучите ленты и выбрать срединные участки. Срединные секции являются те, которые включают в себя SAM, которая появляется как купол клеток, окруженных листьев зачатков.
- секции для монтажа на слайдах.
- Место слайды, которые подходят для LM (либо РНКазы илизапеченные) на 42 ° С теплее слайд и нанесите несколько капель 50% -ного раствора этанола, чтобы покрыть слайд.
- Поплавок секции на растворе этанола, пока секции не расширили.
Примечание: Плавающие секции на растворе этанола, а не вода удерживает РНК в осажденном состоянии восстановительной деградации РНК. - Наклоните слайдов и удаления избытка раствора этанола путем аспирации с одноразовой пипетки передачи. чтобы фитиль от какого-либо дополнительного раствора этанола Используйте безворсовые салфетки.
- Сухие горок при 42 ° С в течение нескольких часов или в течение ночи. Хранить слайды при 4 ° С в герметичном контейнере с силикагелем.
- Deparaffinize скользит в день использования.
- Подготовьте три стеклянные банки, содержащие Коплин; 100% ксилолы (ксилолы I), 100% ксилолов (ксилолы II) и 100% этанола (~ 50 мл каждого раствора).
- Использование чистых щипцов для передачи слайдов, погружают слайды в ксилолы я в течение 2 мин, ксилолы II в течение 2 мин, и 100% этанолом в течение 1 мин.
- Дренажный скользилиэс на безворсовые салфетки и сухой воздух при комнатной температуре.
3. микродиссекция отвала, язычка и оболочкой Образцы из Plastochron 7 листьев зачатков
- Закрепите слайды на сцене LM микроскопа. Используйте пять или шесть слайдов для каждой повторности, используя пять секций на слайд.
Примечание: Ткань для объединения одной повторности показана на рисунке 5. - Изучить слайды и определить пять наиболее срединные секции на каждом слайде, с помощью SAM верхушку в качестве центральной точки отсчета.
Примечание: Это может быть сделано при малом увеличении, как правило, цель 5X достаточно. - Использование 10X или 20X цель, определить положение язычка на plastochron 7 листьев зачатка каждой секции. Язычок будет видна как выпуклость, выступающую из адаксиальной поверхности листа зачатка. Отметить эту позицию с помощью инструмента рисования программного обеспечения LM; выберите значок карандаша, переместите курсор к соответствующему positiна и нажмите и перетащите мышь, чтобы рисовать.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10X или 20X цель подходит для этого и последующих шагов. При использовании боковых секций, две стороны каждого листа зачатка будет присутствовать в каждом разделе (фиг.2А). - С помощью инструмента линейки и прямоугольного инструмент для рисования, измерения 100 мкм высокие прямоугольниками , центрированных на язычка каждой секции (красные прямоугольники, Фигура 2А, 2В). Это будет "Язычок" образца.
- Чтобы использовать инструмент линейки; выберите значок линейки, переместите курсор в один конец измеряемого объекта, нажмите и перетащите, чтобы измерить объект. Длина линейки будет отображаться на экране.
- Чтобы нарисовать прямоугольник; выберите значок прямоугольника, переместите курсор в точку, которая будет один угол прямоугольника, нажмите и перетащите, чтобы нарисовать прямоугольник нужного размера. В качестве альтернативы, выберите инструмент прямой линии рисования и нарисуйте четыре прямые линии.
- Мера 100 мкм прямоугольниками расположены 50 мкм выше и ниже прямоугольника "Язычок".
Примечание: Это будет "Клинок" и "ножен" образцы, соответственно (зеленый и синий прямоугольники, Рисунок 2А, 2В). На основании наших данных гистологического исследования, прямоугольник 100 мкм охватывает всю область язычка. были выбраны такого же размера порции лезвия и оболочкой, чтобы обеспечить, что такие же ткани были собраны для каждого из них. Распорки 50 мкм были использованы для того, чтобы не Язычок область ткани не случайно включен в лезвии или оболочки microdissections.
- Microdissect измеряется прямоугольниками (рис 2D - 2F) 7, 8, 9, собирая Язычок, лезвие и оболочкой образцы в отдельные пробирки. Используйте функцию с помощью лазерной резки, чтобы прорезать срез ткани вдоль контура выбранного домена. Используйте CataФункция Pult для приведения в движение прямоугольник ткани от слайда и в крышку трубки (рис 2D - 2F).
4. микродиссекция отвала, язычка и оболочки адаксиальная Эпидермальные Образцы из Plastochron 7 листьев зачатков
- Выберите разделы и использовать инструмент линейки для измерения 100 мкм высокие сегменты, сосредоточенные на plastochron 7 язычка, как описано в разделе 3 (выше).
- Выберите только адаксиальная эпидермальные клетки каждого 100 мкм высокой "Blade" и "Оболочка" сегмента (зеленый и синий, рисунок выборов 2С), выделяя с помощью инструмента рисования. Эпидермис внешний слой клеток; адаксиальную сторона ближе всего к САМ.
- Для "Язычок" образца, выберите только клетки развивающегося язычка шишка , как описано в разделе 3.3 (красный выбор, Рис 2С).
- Microdissect выбраны регионы, собирая лезвие, язычка и Sheaй эпидермис образцы в отдельные пробирки, как описано в разделе 3.5.
5. микродиссекции Plastochron 6 листьев зачатков из lg1-R , братья и сестры дикого типа
- Grow разделения семейства мутантов (lg1-R) и растений дикого типа.
- Фикс и процесс съемки для LM вершинами, как описано в разделах 1.2-1.4. Фикс дикого типа и мутантных побегов в отдельных вершинами ампул для того, чтобы держать их отдельно. Образцы из той же посадки должны быть зафиксированы и обработаны для гибридизация.
- Определите , где lg1 транскрибируется в братьев и сестер дикого типа, выполняя lg1 гибридизация 6, 26, 27 в. Измерьте положение lg1 накопления транскриптов от основания листьев зачатка в нескольких образцах (рис 1E).
- На основе данных гибридизации на месте в выберите часть листа Primordium , который охватывает регион , в котором транскрибируется lg1. В этом случае 400-900 мкм от основания plastochron 6 листьев зачатков (фиолетовые прямоугольники, рис 2А).
- Microdissect выбранной части листьев зачатков, как описано в разделе 3.5, собирая lg1-R и образцы дикого типа в отдельные пробирки.
6. Применение РНК-буфера для экстракции
- Нанесите 50 мкл буфера для экстракции РНК микродиссекции ткани и приступить к экстракции РНК. Продолжить экстракции РНК, амплификации РНК, создания библиотеки, секвенирования и анализа биоинформатики , как описано в ссылке 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя схему LM , описанную на рисунке 2, приблизительно 1,000,000-1,500,000 мкм 2 ткани собирали для каждой репликации в всех клеточно слоев LM (рисунок 5), и 200 000 мкм 2 на репликацию для адаксиальную эпидермис LM. Приблизительно 2500000 мкм2 ткани собирали для каждой репликации в п.м. lg1-R и листьев зачатков дикого типа. Два раунда линейной РНК амплификации получали микрограммов количества РНК для каждой повторности. Количество РНК, полученной из любого заданного микродиссекции будет зависеть от размера клеток и транскрипционной активности, а также от количества ткани захваченной. Целостность РНК будет влиять на эффективность РНК-амплификации.
Накопление Стенограмма анализировали во всех клеточных слоев лопасти, язычка и оболочки регионов и в общей сложности 2359 DE генэс были найдены, с ложной скорости обнаружения (FDR) <0,05 (рис 6А). В частности, 1,714 гены были DE между язычка и лезвием, 1044 гены были DE между язычка и оболочкой, и 657 генов были DE между лезвием и оболочкой (некоторые гены DE более чем в одном сравнении). Гены были классифицированы как повышающей регуляции в язычка области, если они были значительно усиливает свою активность в обоих Язычок по сравнению с лезвием и Язычок по сравнению с оболочкой. В все клеточные слои LM, 373 гены были значительно усиливается в Язычок регионе.
Накопление Стенограмма было проанализировано в адаксиальной эпидермис лезвий, язычка и оболочки регионов и в общей сложности 3,128 генов DE были обнаружены; 1,971 гены были DE между язычка и лезвием, 2,032 гены были DE между язычка и оболочкой, и гены были 871 DE между лезвием и оболочкой (рис 6б). 287 генов значительно усиливает свою активность в язычка по сравнению с лопастью и ер оболочкиidermis.
Данные для выбранных генов, активируемых в Язычок области представлены в таблице 1 и на рисунке 7. Первоначальный месте гибридизационного анализа показали , что в lg1 транскрипты накапливаются именно в PLB и формирующейся язычка листьев зачатков дикого типа, и что lg1 имеет более высокую степень транскрибируется в эпидермисе , чем во внутренних слоях клеток (рис 6в). LM-РНК последующие данные, которые были получены в соответствии с этим результатом; lg1 накопление транскрипт в язычка значительно выше , чем в любом лезвии или оболочки в обоих эпидермального LM и LM всех слоев клеток (таблица 1, рисунок 7А). lg1 имеет более высокую цену за тысячу показов в эпидермального анализа , чем при анализе всех слоев клеток, аналогичных сценарию , показанного на рисунке 8в.
ns1 значительно усиливает свою активность в области язычка в обоих всех слоев клеток LM и адаксиальную эпидермис LM (таблица 1, рисунок 7B). Этот вывод был подтвержден гибридизация, который показывает , что NS1 транскрипт накапливается специфически в наконечнике формирующейся язычка (рис 6D) в. ns1 имеет гораздо более высокий читать подсчет в эпидермисе-только LM анализа , чем в LM всех слоев клеток (19,6 CPM и 2,7 CPM, соответственно) за счет разбавления транскрипта в всех слоях LM. Это разбавление эффект показан на фиг.8А. Точно так же, GRMZM2G101682, ген неизвестной функции, имели более высокий средний чтения отсчет в язычка эпидермального LM , чем в всех слоях LM (таблица 1, рис 7в). В гибридизация показали , что этот ген также транскрипт накапливается наиболее сильно в эпидермальных клетках (рис 6е). Zm PIN1a существенно не DE при анализе всех слоев клеток, но значительно усиливает свою активность в язычка в анализе эпидермис-только (таблица 1, рисунок 7D). Это, скорее всего , потому что Zm PIN1a высоко экспрессируется в тканях сосудов и это L2 полученных сосудистое выражение путает различия в накоплении Zm PIN1a в эпидермисе , когда все слои клеток собираются (рис 6F). Подобный сценарий изображен на рисунке 8B.
Для того, чтобы идентифицировать гены, которые DE в lg1-R мутантов, накопления транскриптов сравнивали в определенной области дикого типа и листовых зачатков lg1-R Р6. Девяносто шесть генов были DE в lg1-R (FDR <0,05); 59 были подавляются в lg1-R мутантов, и 37 были повышающей регуляции. Данные для выбранных генов, которые DE в <EM> lg1-R мутанты представлены в таблице 2. bel14 является одним из 34 генов, которые одновременно активируемых в Язычок области в листовых зачатков дикого типа и подавляются в lg1-R мутантов. В гибридизация подтвердил , что bel14 транскрипты накапливаются в preligule области в растениях дикого типа , но не в соответствующей области lg1-R листьев зачатков 6.
Рисунок 2: Схема для лазерной микродиссекции листьев исконных областей. (A) Боковой продольный разрез кукурузы верхушки побегов обработанной для LM. Коробки указывают регионы, выбранные для микродиссекции. Язычок область ткани (красная коробка) была микродиссекции от 100 мкм больших прямоугольников, сосредоточенных на PLB. Предварительно лезвие (зеленый) и предварительно оболочка (синий) ткань была взята от 100 мкмпрямоугольники 50 мкм выше и ниже отбора preligule соответственно. Для сравнения дикого типа и lg1-R Транскриптом, ткани между 400-900 мкм от основания P6 листьев зачатков был микродиссекции из боковых секций (фиолетовый пунктирная линия). (B) Крупный план P7 зачатка и регионов , выбранного для микродиссекции всех слоев клеток. (C) Крупный план P7 зачатка и регионов , выбранного для микродиссекции адаксиальной эпидермиса. (D) Preligule область P7 зачатка перед тем микродиссекции. Arrowhead указывает позицию начала язычка. (Е) Красная линия указывает на область , выбранную для микродиссекции. Лазер будет разрезать вдоль этой линии. Круги указывают на точки, где лазерные импульсы будут катапульты ткани. (F) зачатка после микродиссекции. Круги указывают на точки, где лазерные импульсы катапультировали ткани. SAM = стрелять апикальной меристемы. P указывает номер plastochron. Шкала баров = 100 &# 181; м. Эта цифра была изменена из ссылки 6 (Авторское право Американского общества биологов растений). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Область выбрана для LM влияет на чтение счетчиков для генов, которые де вдоль листа зачатка. (А) точное позиционирование региона , выбранного для LM относительно морфологических ориентиров уменьшает вариацию генов , выраженных в градиенте вдоль оси листа. В повторах 1-3 на левой стороне, выбор сосредоточены на формирующейся язычка, что приводит к низкой изменчивости. В повторах 1-3 на правом, позиционирование региона, выбранного для LM не согласуется приводит к увеличению изменчивости. (B) Microdissecting последовательно размера SВыборы уменьшает вариации (размножается 1-3 слева) по сравнению с microdissecting разный выбор размера (тиражирует 1-3 справа) для генов с паттернов экспрессии язычка специфических. Транскрипты более разбавленный в более широком выборе, что приводит к снижению считывания счетчика, и более концентрированным в меньшем выборе, что приводит к увеличению считывания счетчика. Мультфильмы представляют собой продольные разрезы через лист зачатков в язычка области. Arrowhead указывает на инициирование язычка. CPM = рассчитывает на миллион. SD = стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Рассечение кукурузы рассады для боковых секций. (A) Две недельных кукурузы рассады вырезают на корневых побегов перехода. Удалить тонкие ломтики фром основание побега (1) до небольшого овала соломиной видна у основания побега. Сделайте поперечный разрез приблизительно 10 мм выше основания (2) и сохраняют этот цилиндр. (B) Цилиндр ткани ориентированы таким образом , основание лицевой стороной вверх. Примечание овал соломиной, окруженным листа. Сделать два продольных разреза, параллельно поперечной оси (3 и 4). Сохранил и зафиксировать центральную кусочек ткани, эта часть будет включать SAM и молодых зачатков листьев. (C) Мультфильм , иллюстрирующая плоскость боковой секции (зеленая пунктирная линия) через верхушки побега. Красный круг указывает на то жилка, красный стрелолист указывает допустимые пределы серого листа зачатка. Синий пунктирная линия: ось жилка рентабельностью. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Мультфильм , иллюстрирующая объединение лазерной микродиссекции ткани для одной повторности части язычка региона. Ткань микродиссекции от пяти до шести слайдов объединены для каждой повторности. Пять срединные сечения из каждого слайда используются и два выбора (красные прямоугольники) сделаны из каждой секции. Каждый прямоугольник составляет приблизительно 20000 мкм 2. Ткань для каждой повторности собирают в отдельную пробирку (синий овал). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Количество генов DE в парных сравнений между листовыми областей и гибридизация отобранных генов DE в. (A) Количество генов в DE парного сравнения междулезвие, язычка и оболочки областей, LM всех слоев клеток. (B) Количество генов в DE парного сравнения между лопаток, язычка и оболочкой регионов, LM всего адаксиальной эпидермиса. (C) lg1 в гибридизация. (D) ns1 гибридизация. (E) GRMZM2G101682 гибридизация. (F) ZmPIN1a гибридизация. DE: дифференцированно выражены. Up в L: вверх в язычка, Up в B: вверх в отвал. Up в S: вверх в оболочке. Наконечники в CF указывают на появление язычка. Стрелка в F указывает на накопление транскриптов в тканях сосудов. Масштабные полоски = 100 мкм. Эта цифра была изменена из ссылки 6 (Авторское право Американского общества биологов растений). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
т = "Рисунок 7" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
Рисунок 7: Графическое представление данных для выбранных генов DE. На рисунке представлены данные , представленные в таблице 1 и в точке результатов гибридизации. Мультфильмы представляют собой продольные срезы через лист зачатков. Темно-синий указывает на накопление транскриптов для конкретного гена. Зеленые, красные и синие коробки указывают на область, выбранную для микродиссекции для лезвий, язычка и оболочки образцов. Мультфильмы на левой иллюстрации LM всех слоев клеток. Мультфильмы на правой иллюстрации LM только из адаксиальной эпидермиса. Объявление: адаксиальная эпидермис, Ab: абаксиальный эпидермис, CPM: рассчитывает на миллион, Звездочка указывает на существенную разницу между двумя доменами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
"SRC =" / файлы / ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
Рисунок 8: Мультфильм , иллюстрирующий , как прочитать счетчики для гипотетических генов DE различаются в зависимости от конкретных областей , выбранных для микродиссекции. (A) Джин с выражением язычка конкретным. (Б) генов экспрессируется в язычка и в сосудистых тканях. (С) Ген экспрессируется специфически в Язычок области во всех клеточных слоев , но с большей экспрессией в эпидермисе. (D) , ген экспрессируется в Язычок области, только L2 , полученные из клеточных слоев. Мультфильмы представляют собой продольные срезы через лист зачатков. Темно-синий указывает на накопление транскриптов для конкретного гена. Зеленые, красные и синие коробки указывают на область, выбранную для микродиссекции для лезвий, язычка и оболочки образцов. Мультфильмы на левой иллюстрации LM всех слоев клеток. Мультфильмы на правой иллюстрации LM только из адаксиальной эпидермиса. Объявление: адаксиальная эпидермис, Ab: абаксиальный эпидермис, CPM: COU NTS на миллион. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Отдельные гены активируемых в изначальном язычка. Графы на миллион: считает на миллион полных транскриптов, средний из трех повторностей, logFC = логарифм 2 Fold Change, FDR.BH: вероятность ложного обнаружения в соответствии с Benjamini и Hochberg методом. Все слои: LM всех слоев клеток. Эпидермис: LM только из адаксиальной эпидермиса. Эта цифра была изменена из ссылки 6 (Авторское право Американского общества биологов растений). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
е 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
Таблица 2: Отдельные гены DE в lg1-R мутантов. Графы на миллион: считает на миллион полных транскриптов, средний из трех повторностей, logFC = логарифм 2 Fold Change, FDR.BH: вероятность ложного обнаружения в соответствии с Benjamini и Hochberg методом. Эта цифра была изменена из ссылки 6 (Авторское право Американского общества биологов растений). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экспериментальный дизайн является решающим фактором в РНК-сл экспериментов. Основные соображения точный домен (ы) и этап (ы) развития, которые будут проанализированы, и какие сравнения будут сделаны. Крайне важно, чтобы думать с точки зрения сравнения, так как выход, как правило, список генов, которые де между двумя или более условий. Как и во всех экспериментах, важно, чтобы изменить только одну переменную за раз. Например, при сравнении различных доменов листьев, листьев одного и того же возраста и стадии развития, выращенных в тех же условиях, следует сравнивать.
Целью этих экспериментов было идентифицировать гены, которые специфически вверх или вниз регулируется в язычка области листьев зачатков дикого типа, а также для идентификации генов, которые DE в lg1-R мутантов по сравнению с диким типом. Сначала мы изучали морфологию развивающихся листьев зачатков и характер накопления lg1 транскриптов. Эти морфологические и молекулярные ориентиры Wпрежде чем использовать для выбора точных доменов для LM 14, 15, 16. В первом эксперименте, накопление транскрипта в Язычок регионе по сравнению с другими регионами одного и того же листа зачатков, тем самым устраняя различия из-за условий роста, генетического фона, стадии развития, а также растений в растения вариации. Для сравнения мутанта дикого типа, необходимо, чтобы определить, где и когда интерес ген экспрессируется. Мы рекомендуем анализировать характер экспрессии либо гибридизация или иммунолокализации в и выбора региона для LM, охватывающую область экспрессии гена. Важно, что эквивалентные домены сравниваются и что генетический фон является одинаковым для обоих мутантных и дикого типа.
Точность microdissections может быть проверена путем проверки чтения счетчиков для генов, которые экспрессируются в частности, в области интереса, если суCH гены известны. Это также может быть сделано путем проведения ОТ-ПЦР на РНК, выделенной из LM ткани до внесения библиотек для секвенирования. В экспериментах , описанных здесь, lg1 служили в качестве контроля для LM от язычка области, так как в гибридизация анализы показали , что lg1 выражение является специфическим для PLB и возникающих язычка 5, 6.
В отличие от методов, таких как RT-кПЦР, где должен быть известен ген (ы) кандидат, РНК-ПОСЛ квантифицирует накопление всех транскриптов в данном образце ткани. Таким образом, LM-РНК сл является полезным методом для идентификации генов-кандидатов. Примером этого исследования является GRMZM2G101682, ген неизвестной функции , которая имеет поразительное язычка специфические паттерн экспрессии (рис 6е). Это исследование также идентифицированы гены, которые DE в lg1-R, такие как bel14, которые ранее не были замешаны в качестве исполняющего обязанности вниз по течению Lg1. В This экземпляра, сравнение нескольких наборов данных (повышающей регуляции в язычка области дикого типа и DE в lg1-R) была особенно информативны. Важно отметить, что паттерн экспрессии гена не демонстрирует функцию: последующие генетические и / или биохимические анализы необходимы, чтобы установить функции гена.
Транскриптомных анализы, которые были сосредоточены на малых, дискретных областей развития, которые дифференцированно различны и легко разграничены, являются наиболее успешными. LM-РНК сл является подходящим методом для такого анализа и имеет потенциал, который будет применен ко многим явлениям развития. Она особенно подходит для идентификации дифференциальной экспрессии генов у мутантов генов, которые пространственно ограниченной экспрессии узоры, или мутанты, которые влияют на развитие специфических структур. Он также может быть применен к процессам, которые происходят в конкретных и идентифицируемых клеток или тканей, таких как эпидермис или сосудистую систему, и был использован втранскриптомных анализ кукурузы апикальной меристемы побега (SAM) онтогенез 16. Это в меньшей степени подходит к изучению функции генов, которые экспрессируются Повсеместно или процессы, которые происходят во всех клетках. Методы , представленные здесь, были успешно применены к различным видам растений (кукуруза, сорго, Ocimum, Mentha и львиный зев) , и структуры (лист зачатков, меристемы, корневища и трихом).
LM не требуется, если анализ включает в себя относительно большие домены. Действительно, РНК-Seq на ручных рассеченные или целых органов был успешно использован для идентификации генов в растениях DE 14, 15. Такой подход имеет преимущество быть менее трудоемким и не требуется опыт работы с гистологических методов. Тем не менее, существуют ограничения на точность ручных вскрытий, а это означает, что рука рассечение меньше подходит для изучения раннего дevelopmental процессы.
Для успешного LM Секвенирование РНК анализ явлений развития, контекст развития должны быть хорошо охарактеризованы. Мы рекомендуем проведение тщательного гистологическое исследование процесса или области интереса, прежде чем планировать эксперимент. Гистологию образцов, обработанных для LM, как правило, бедны, так как ткани неокрашенными и не установлены с покровных стеклах, которые обеспечивают глубину резкости. Поэтому полезно , чтобы фиксировать отдельные образцы для окрашивания и наблюдения в то же время , как образцы LM фиксированы (фиг.1С, и D).
РНК , полученной из LM материала , как правило , фрагментарный и общий выход низок 8. Стадию амплификации требуется для выработки достаточного количества РНК для подготовки библиотеки 28. РНК длины фрагмента следует оценивать после амплификации и до библиотеки поколения. Средняя длина фрагмента SEVeral сто пар оснований, как правило, считается хорошим, 500 пар оснований отлично. Плохо выход РНК может привести, если ткань не хорошо налаженный, если деградация вследствие РНКазы загрязнение происходит, или если парафиновые блоки неправильно хранятся. Полезно проверить качество фиксированной ткани путем проведения пробной LM с относительно большой площади, прежде чем уделять много времени, чтобы microdissecting очень маленькие домены. Поскольку РНК, полученной из клеток LM раздроблен и амплификации с использованием олиго дТ праймер вводит сильный 3 'уклон, этот способ не подходит для обнаружения альтернативных транскриптов, таких как сплайс-варианты. Не является LM подходит для обнаружения малых РНК.
Альтернативный метод для количественного накопления транскриптов в определенных тканях или клеточных доменов РНК-последовательность SEQ клеток , разделенных с помощью флуоресцентной сортировка клеток (FACS) 21. Этот метод обычно требует идентификации подходящего гена-маркера для области, представляющей интерес,генерация трансгенных растений, экспрессирующих флуоресцентного меченых белков и protoplasting. FACS в сочетании с микрочипов был использован для создания экспрессионного карту корня Arabidopsis путем отделения клеток , экспрессирующих промоторы типоспецифические клеток в корень 22, 23. FACS всхода тканей является более сложной , чем корневых тканей из - за хлорофилла автофлюоресценции 24. Ограничение LM является то, что область интереса должны быть идентифицированы в гистологических срезах. FACS может быть более подходящим методом в тех случаях, когда подходящий ген-маркер доступен. Выбор которых клетки или ткани, чтобы изолировать и сравнить является важным фактором в транскриптомных анализах, которые используют либо FACS или LM.
Приведенные данные показывают , что будут получены разные результаты в зависимости от конкретных областей , выбранных для LM (рисунок 3, рисунок 8). Транскрипты генов, которые экспрессируются в одной или нескольких клеток, таких как NS1, будет разбавлен при анализе крупных доменов ткани. Вполне вероятно , что если были отобраны из целых листьев зачатков, NS1 транскрипт не будет обнаружен. ZmPIN1a значительно усиливает свою активность в язычка по сравнению с лопаточной и оболочки эпидермиса , но эта разница посрамлен сосудистым выражением , когда все слои клеток отбираются. С другой стороны , гены, которые выражаются только в L2-производных слоев клеток не будет обнаружен , когда только эпидермис оцифровывается (рис 8D). Это исследование показывает, что, в то время как LM-Seq РНК является мощным инструментом для выявления различий в экспрессии генов во время морфогенеза, домены, выбранные для анализа имеют решающее значение для успеха эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность С. хека за постоянное сотрудничество и стимулирующие дискуссии о развитии язычка. Эта работа поддерживается Национальным научным грантам Фонда MCB 1052051 и IOS-1848478.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
