Abstract
gelişmesinde önemli rolleri olan genler sıklıkla mekansal ve / veya zamansal sınırlı ifade desenleri var. Genellikle bu gen transkript tespit edilmemiştir ya da farklı olarak tüm bitki organlarının transkriptomik analizlerinde (DE) ifade edildiği gibi tanımlanmamıştır. Lazer Diseksiyon RNA Seq (LM RNA Seq) özel gelişimsel alanlarda DE olan genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, hücresel alanlarının seçimi microdissect ve karşılaştırmak ve microdissections doğruluğu deneylerin başarısı için çok önemlidir için. Burada, iki örnek transkriptomik deneyler için tasarım konuları göstermektedir; RNA DİZİ analizi, mısır yaprağı yakın-uzak eksen boyunca de genleri belirlemek için bir LM ve ikinci bir deney, DE liguleless1-R (LG1-R) olan genleri tanımlamak için mutantlar vahşi tip ile karşılaştırıldığında. Bu deneylerin başarısına katkıda kilit unsurları histolojik ve si ayrıntılı edilditu melezleme analiz edilecek bölgenin analizleri, eşdeğer gelişim aşamalarında yaprak primordiasında seçimi, morfolojik yerlerinden kullanımı mikrodiseksiyon bölgeleri seçin ve hassas ölçümler etki mikrodisseksiyon için. Bu makale LM RNA Sek tarafından gelişimsel etki analizi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Burada sunulan veriler mikrodiseksiyon seçilen bölge elde edilen sonuçları nasıl etkileyeceğini göstermektedir.
Introduction
Genetik diseksiyon (Şekil 1A) için uygun olan bıçak ve kılıf arasında belirgin bir sınır olduğu gibi mısır yaprağı, morfolojilerinden sırasında gelişimsel alanların oluşumunu incelemek için ideal bir model. yaprak gelişimi, küçük hücrelerden oluşan bir lineer grubun ilk aşamalarında, preligule bandı (PLB), pre-bıçak ve ön kılıf etki alanlarına yaprak primordium'u subdivides. Bir saçak gibi ligule ve üçgen kulakcık PLB (Şekil 1A, C, D) gelişir. Genetik ekranlar bıçak kılıf sınırını bozan mutasyonlar saptanmıştır. Örneğin, resesif liguleless1 (LG1) mutasyonları ligule kulakçıkların, 1, 2, 3, 4 (Şekil 1B) silin. İn situ hibridizasyon LG1 transkript P birikir ortayaLB ve ligule gelişme 5, 6 (Şekil 1E) için o mükemmel bir işaretleyici yaparak, ligule ortaya çıkıyor.
Şekil 1: vahşi tip ve liguleless1-R mısır yaprakları. Ligule ve kulak kepçesi yapıları gösteren, olgun, vahşi tip yaprak (A) Bıçak kaplama sınır bölgesi. (B) ligule ve kulak kepçesi yapıların olgun liguleless1-R yaprak gösteren yokluğunda Bıçak kılıf sınır bölgesi. A ve B Yapraklar yaprak orta damarı boyunca yarıya edilmiştir. Vahşi tip yaprak primordiumunun yoluyla (C) Boyuna kesit. Örnek işleme ve histolojik analiz için boyanmıştır edilmiştir. başlatılması ligule yaprak (ok başı) düzleminden dışarı çıkıntı yapan bir tümsek belirgindir. (D) Boyuna mezhepvahşi tip yaprak primordiumunun yoluyla iyon. metinde tarif edildiği gibi Örnek LM için işlenmiştir. Ok başı ligule başlatılması gösterir. Sürgün ucuna uzunlamasına yanal bölümün in situ hibridizasyon (E) LG1. Yıldız P6 yaprak primordiumunun PLB de LG1 transkript birikimi gösterir. Oklar P6 primordium'un tabanını gösterir. Bar PLB için primordium'un tabanından ölçümünü gösterir. A ve B Ölçek çubukları 20 mm =. CE Ölçek çubukları = 100 mikron. Bu rakam referans 6 (Bitki Biyologlar Telif Amerikan Derneği) modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu çalışmada, LM RNA Seq yaprak primordiumunun ve ide diğer bölgelerine bıçak-kılıf sınır nispetle farklı ifade edilen genlerin bir paketi (DE) tanımlamak için kullanılmıştır vahşi tip kardeşleri göre LG1-R mutantlar DE vardır ntify genler. LM RNA Seq özel hücreler ya da hücre alan 7 transkript birikimi ölçülmesi için bir yöntem olup. LM sistemleri lazer ve bir dijital kamera ile bir mikroskop birleştirir. Kesitli doku slaytlar üzerine monte edilir ve mikroskop aracılığıyla görüntülenebilir. LM yazılım genellikle kullanıcı mikrodiseksiyon seçilen herhangi bir bölgeyi anahat izin çizim araçları içerir. hat boyunca lazer kesim ve seçilen doku slayt kapalı mancınık ve slayt üzerinde asılı bir tüp içine almaktadır. LM kullanıcıya özel hücre katmanları ve hatta tek hücreler 8, 9 da dahil olmak üzere hassas etki, microdissect sağlar. RNA daha sonra microdissected dokusundan elde edilebilir. Daha sonra, RNA-Seq bileşen çıkarılan RNA 10 üretilen cDNA kütüphaneleri sıralamak için yeni nesil dizileme kullanır,= "xref"> 11.
LM RNA seq Anahtar avantajları kesin olarak tanımlanmış alanlarda transkript birikimi ölçmek yeteneği ve tüm transkriptom aynı anda 7 profile kapasite vardır. teknik faiz bölge genellikle mikroskobik erken gelişim olayları sondalama için uygundur. Daha önceki çalışmalar, LM bitkiler 9, 12, 13, gelişim süreçleri incelemek için mikrodizi teknolojisi ile birlikte kullanmıştır. RNA Seq düşük ifade edilen genler de dahil olmak üzere, geniş bir dinamik aralık, arasında transkript miktarının avantajı vardır ve önceki dizi bilgisi, 11 10 gerekli değildir. Ayrıca, LM RNA Seq nedeniyle-of-zarara genetik fazlalık veya öldürücülüğü için mutagenez ekranlarında gözden kaçabilir gelişimsel olarak önemli genlerin vurgulamak için potansiyele sahiptirfonksiyon mutant.
Bu tür dar bir sheath1 (NS1) ve kupa şekilli cotyledon2 (CUC2) halinde gelişimsel olarak önemli genler, genellikle sadece bir spesifik ekspresyon modelleri ya da birkaç hücre 17, 18, 19, 20 sahiptir. Çoğu sadece erken gelişim evrelerinde ve olgun bir organ olarak ifade edilir. Bütün organlar ya da büyük etki incelendiğinde, bu hücreye spesifik transkriptler seyreltilmiş ve daha geleneksel analizlerde tespit edilemez. kesin olarak tanımlanmış etki analiz edilmesine izin vererek, LM RNA Seq bu dokuya özgü genler belirlendi ve miktarları tayin edilmesini sağlar.
Burada tarif edilen deneylerde başarısında önemli faktörlerdir bir analiz için uygun gelişim aşamasında ve etki alanının seçimi güdümlü tam histolojik analiz ve hassas measureme vardıLM hücre dokusunu etki nt. Eş etki her kopya için örneklendi emin olmak için, doku, aynı gelişim aşamasında, yaprak primordia toplandı ve microdissected etki, ortaya çıkan ligule (Şekil 2) gibi morfolojik noktalara göre ölçülmüştür. Bazı genler, yaprak tabanına ucundan gradyanı olarak ifade edilmiştir bilinmektedir. Nedeniyle yaprak proksimal-distal ekseni boyunca farklı yerlerden numune hassas etki, varyasyon ölçerek en az (Şekil 3A) tutuldu. Aynı boyutta etki microdissecting ile nedeniyle değişkenlik hücreye özel transkriptlerin seyreltme (Şekil 3B) indirgenerek diferansiyel. Atış apeksinin yan uzunlamasına kesitleri, tüm microdissections kullanılmıştır. Bunlar (Şekil 4) yaprak orta damarı-margin eksenine dik bölümler vardır. SAM içeren tek bölümleri kullanarak o eşdeğer yanal bölgeleri sağlaryaprak taslakları analiz edilir.
İşlenmiş ve LM için kesitli numunelerde, ligule akıbet ilk morfolojik işareti nedeniyle adaxial epidermis (Şekil 1D, Şekil 2) periclinal hücre bölünmeleri adaxial tarafında bir darbedir. Gelişmekte olan ligule güvenilir plastochron 7 aşamalı yaprak primordiasında tespit edilebilir o belirlenmiştir. Biz gelişmekte olan ligule ve kulak kepçesi oluşturacaktır hemen uzak hücreleri dahil olmak üzere tüm ligule bölgede ifade genler, ilgilenmişlerdir. Eşdeğer doku seçimi yapılırken sağlamak amacıyla, ligule yumru morfolojik işareti olarak kullanıldı ve ligule yumru merkezli 100 um dikdörtgen LM (Şekil 2A, 2B) için seçildi. Ön bıçak ve ön kılıfın aynı büyüklükte dikdörtgenler aynı yaprak primordia seçilmiştir.
liguleless mutant bitkilerin analizi Farklı challe sunulmaktadırnge; LG1-R mutantlar bu nedenle bu morfolojik özellik LM için bölgeyi seçmek için kullanılan olamazdı bir ligule, oluşturmazlar. Bunun yerine, vahşi tip yaprak primordia olarak LG1 transkript birikimi alanı tespit edildi ve bu da kapsamak olan bir bölge tanımlanmıştır. son tahlilde için kullanılan önceki çalışma PLB yeri büyüme koşullarına bağlı olarak değişir göstermiştir beri bu ön analizler, aynı dikimden itibaren fidelerin üzerinde gerçekleştirilmiştir. In situ hibridizasyon LG1 transkript PLB P6 yaprak primordia (Şekil 1 E) birikir olduğunu göstermiştir. Biz LG1 ifadesinin alanını (mor dikdörtgenler, Şekil 2A) kapsıyor ve yabani tip ve LG1-R bitkilerden bu eşdeğer bölgeleri ele yaprak primordiasında tabanından bir alanı 400-900 mikron seçilmiş. transkripsiyonu karşılaştırırken genetik altyapı ve büyüme şartlarına varyasyonu en aza indirmek içinLG1-R ve vahşi tip bitkiler, mutant ve vahşi tipli kardeşlerinden ailelerini ayırma t birikimi kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Doku LM için sabit olduğunu, aynı zamanda histolojik analiz için doku sabitleyin. Daha sonra LM rehberlik edecek morfolojik özellikler için lekeli bölümleri inceleyin. Vahşi tip mutant karşılaştırıldığında, (bu durumda LG1) ilgili gen ifade alan tanımlamak için bir yerinde hibridizasyon veya bağışık gerçekleştirmek.
1. Doku Sabitleme ve İşleme
- Standart koşullar 6 altında eski iki hafta mısır fidelerinin daire büyür.
- Yanal bölümler (Şekil 4) için ateş apices teşrih.
- sadece toprak sınırının altında Tüketim fide.
- Bir jilet kullanarak, bir ya da iki olgun yapraklar çevrelediği culm oval görünür (Şekil 4B) kadar kök (kesikler 1, Şekil 4A) tabanından ince dilim çıkarın.
- Başka bir kesim tabanı üzerinde yaklaşık 10 mm (Şekil 4A 2 kesme) olun.Bu 10 mm segmenti SAM ve genç yaprak primordiasında içerecektir.
- Baz yukarı bakacak şekilde 10 mm segmenti çevirin. Kalın bir doku 2-3 mm'lik bir kesit elde edilir, böylece iki kesim yanal eksene paralel hale (kesikler 3 ve 4, Şekil 4B). Dış iki porsiyon atın ve sabitleme ve benimsenmesi için merkezi dilim saklayın.
NOT: Dış yaprakları kesilmiş ve atılabilir.
- gömmek için doku ve süreci sabitleyin.
- RNaz ücretsiz olan tüm malzemelerin daha sonraki kademelerde kullanım için emin olun. (. Çözeltinin litresi başına 1 mi DEPC, arada bir sallanarak ve otoklav ile bir gece boyunca inkübe) dietil pirokarbonat (DEPC) ile çözümleri tedavi edin. Fırında 200 ° C de bir fırında cam veya en az 6 saat boyunca daha yüksek ve RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile plastik eşya tedavi.
- Gün 1: buz üzerinde bir cam şişe içinde (asetik asit: 1 Etanol 3) ~ çiftçi düzeltmenin 10 ml doku dilimleri bırakın. Tüm numuneler kesilerek sonra, Vacuu geçerlidirm hava kabarcıkları ve fiksatif yardım penetrasyonunu kaldırmak için. 10 dk sonra yavaşça vakumu boşaltmak için vakum altında tutun. Fiksatif değiştirin ve hafifçe çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 2. Gün:, çözeltiler, aşağıdaki seri inkübe ~ her biri 10 mL, 1 saat, her biri hafifçe çalkalanarak Tüm; 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C 'de% 100 etanol% 100 etanol% 100 etanol% 95 etanol, 1 ile% 85 etanol: 1 etanol: Oda sıcaklığında ksilenler, Oda sıcaklığında% 100 ksilenler, oda sıcaklığında% 100 ksilenler.
NOT: ksilen temas ve solunum yoluyla zehirlidir. Davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven kullanın. - ksilen, yaklaşık yarım hacme orta peletler gömme parafın doku eklenir ve yavaşça çalkalanarak, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir.
- 3. Gün: peletler eriyene kadar 60 ° C fırında, şişe aktarın. çözüm dökün ve taze erimiş doku gömme ortamı ile değiştirin. Orta iki kez daha değiştirmegün boyunca.
- 4. Gün: Sabah bir kez gömme orta Değişim doku. Öğleden sonraya kadar 60 ° C fırında dönün.
- Oyuncular blokları
- Doku gömme istasyonunun sıcak plaka üzerinde gömme kalıpları yerleştirin. kesim yüzeyi aşağı bakacak şekilde gömme kalıplara doku örnekleri aktarmak için forseps kullanabilir. Erimiş parafin ile kalıp kontör ve kalıp üstüne gömme halkasını yerleştirin. parafin katılaşmış kadar soğuk plaka aktarın. silika jel ile hava geçirmez bir kap içinde, 4 ° C'de, parafin blokları saklayın.
2. Kesit ve Hazırlama Slayt
- Bir mikrotom 25 10 mikron bölümleri kesin.
- şeritler incelemek ve medyan bölümleri seçin. Medyan bölümler yaprak primordia çevrili hücrelerin bir kubbe olarak görünür SAM dahil olanlardır.
- slaytlar Mount bölümleri.
- LM için uygun yer slaytlar (ya RNaz ücretsiz ya dapişmiş) 42 ° üzerinde sıcak slayt ve slayt kapsayacak şekilde% 50 etanol çözeltisi birkaç damla uygulamak C.
- bölümler genişlettik kadar etanol çözeltisi ile ilgili bölümleri yüzer.
NOT: etanol çözeltisi yerine su bölümleri Yüzer RNA bozulmasını azaltan bir çöktürülmüş halde RNA tutar. - slayt eğin ve tek kullanımlık transfer pipet yardımıyla aspirasyon ile aşırı etanol çözüm kaldırmak. herhangi bir ek etanol solüsyonu uzak fitil havsız mendil kullanın.
- 42 ° C'de kuru slaytlar birkaç saat veya bir gece. Mağaza silika jel ile hava geçirmez bir kap içinde, 4 ° C 'de kayar.
- Deparaffinize kullanım gününde kayar.
- içeren üç cam Coplin kavanoz hazırlayın; % 100 ksilenler (ksilenler I) 'in,% 100 ksilenler (ksilenler II) ve% 100 etanol (~ Her çözeltinin 50 mi).
- temiz forseps kullanarak 2 dakika ve 1 dakika süreyle% 100 etanol için, slaytlar aktarmak Ben 2 dakika süreyle ksilol slaytları batırmayın, ksilen II.
- Tahliye kaydırdıOda sıcaklığında havsız mendil ve kuru hava ile ilgili es.
Plastochron 7 Yaprak Primordia Blade, ligule ve Kılıf Örneklerinin 3. Mikrodisseksiyon
- LM mikroskop sahnede slaytlar sabitleyin. slayt başına beş bölümden kullanan her tekrar için beş ya da altı slaytlar kullanın.
NOT: Tek deney için havuzu doku Şekil 5'de görüntülenmiştir. - slaytlar incelemek ve merkezi referans noktası olarak SAM apeks kullanarak, her slaytta beş en medyan bölümleri belirlemek.
Not: Bu, düşük büyütme yapılabilir genellikle 5X amacı yeterlidir. - 10X veya 20X objektif kullanılarak, her bir bölümün plastochron 7 yaprak primordiumunun üzerinde ligule konumunu belirlemek. ligule yaprak primordiumunun adaxial yüzeyinden çıkıntı bir yumru olarak görünür olacaktır. LM yazılım çizim aracını kullanarak bu konumu işaretleyin; Kalem simgesini seçin, uygun positi imlecive üzerine tıklayın ve çizmek için fareyi sürükleyin.
NOT: 10X veya 20X amacı, bu ve sonraki adımlar için uygun değildir. Yanal bölümleri kullanırken, her yaprak primordiumunun iki tarafın her bölüm (Şekil 2A) mevcut olacaktır. - Cetvel aracı ve dikdörtgen çizim aracını kullanarak, 100 mikron her bölümün ligule merkezli yüksek dikdörtgenler (kırmızı dikdörtgenler, Şekil 2A, 2B) ölçün. Bu "ligule" örnek olacaktır.
- cetvel aracını kullanmak için; , Cetvel simgesini seçin ölçülecek nesnenin bir ucuna imleci, nesneyi ölçmek için tıklayın ve sürükleyin. Cetvelin uzunluğu ekranda gösterilir.
- Bir dikdörtgen çizmek için; , Dikdörtgen simgesini seçin, dikdörtgenin bir köşesi olacak tıklayın ve uygun büyüklükte bir dikdörtgen çizmek için sürükleyin bir noktaya imleci. Alternatif olarak, düz bir çizgi çizim aracını seçin ve dört düz çizgiler çizmek.
- tedbir 100 mikron dikdörtgenler 50 mikron "ligule" dikdörtgen üstünde ve altında konumlandırılmış.
NOT: Bu "Blade" ve "Kılıf" örnekleri, sırasıyla (yeşil ve mavi dikdörtgenler, Şekil 2A, 2B) olacaktır. Bizim histolojik verilere dayanarak, 100 mikron dikdörtgen tüm ligule bölgesini kapsar. bıçak ve kılıfın eşdeğer porsiyon büyüklüğünde doku içindeki miktarları her biri için elde edilmiştir sağlamak için seçilmiştir. 50 um'lik Spacer'ler ligule bölgesi doku yanlışlıkla uç veya kılıf microdissections dahil olmasını sağlamak için kullanılmıştır.
- Ayrı tüplerde ligule, Blade ve Kılıf örneklerin toplanması 7, 8, 9, - Microdissect ölçülen dikdörtgenler (2F Şekil 2B). Seçilen etki anahat boyunca doku bölümünde kesmek için lazer kesim işlevini kullanın. Cata kullanınpult işlevi slayt kapalı ve tüp (- 2F Şekil 2B) kapağının içine doku dikdörtgen itmek için.
Plastochron 7 Yaprak Primordia Blade, ligule ve Kılıf adaxial Epidermal Örneklerinin 4. Mikrodisseksiyon
- bölümleri seçin ve bölüm 3 (yukarıda) de tarif edildiği gibi, plastochron 7 ligule merkezli 100 mikron yüksek kesimleri ölçmek için cetvel aracını kullanın.
- Çizim aracı ile özetleyen her 100 mikron yüksek "Blade" ve "Kılıf" segmenti (yeşil ve mavi seçimleri, Şekil 2C) sadece adaxial epidermal hücreleri seçin. Epidermis, dış hücre tabakasıdır; aks tarafı SAM yakın biridir.
- Bölüm 3.3 (kırmızı seçimi, Şekil 2C) de tarif edildiği gibi "ligule" örneği için, gelişmekte olan ligule yumru sadece hücreleri seçin.
- Bıçak, ligule ve Shea toplama Microdissect seçilen bölgeler,bölüm 3.5 anlatıldığı gibi inci, ayrı tüplerde örnekleri epidermis.
LG1-R ve vahşi tip kardeşlerinden Plastochron 6 Yaprak Primordia 5. mikrodiseksiyonu
- Mutant (LG1-R) ve vahşi tipli bitkiler ailelerini segregasyon büyütün.
- bölümlerde 1.2-1.4 açıklandığı gibi, LM için apices saptamak ve süreç ateş. Ayrı onları tutmak için vahşi tip ve ayrı şişelerde mutant ateş apices sabitleyin. Aynı dikim numuneler sabit ve in situ melezleme için işleme tabi tutulmalıdır.
- LG1 in situ hibridizasyon 6, 26, 27 LG1 gerçekleştirerek, vahşi tipli kardeşlerinden transkribe burada belirler. Birden çok numune (Şekil 1 E) yaprak primordiumunun tabanından LG1 transkript birikimi konumunu ölçün.
- Doğal olarak melezleşme verileri göre, yaprak primo kısmını tercihrdium bu LG1 transkribe bölgeyi kapsar. Bu durumda, plastochron 6 yaprak primordia (mor dikdörtgenler, Şekil 2A) tabanında 400-900 um.
- Bölüm 3.5 de tarif edildiği gibi, ayrı Microdissect tüplerde LG1-R ve vahşi tip numune toplama, yaprak primordia kısmı seçildi.
6. RNA Ekstraksiyon Buffer uygula
- microdissected dokuya 50 ul RNA ekstraksiyon tamponu uygulayın ve RNA ekstraksiyonu devam edin. Referans 6'da açıklandığı gibi RNA ekstraksiyonu, RNA amplifikasyonu, kütüphane oluşturma, sekanslama ve biyoinformatik analizi ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yaklaşık 1,000,000-1,500,000 um 2 doku her biri için elde edilmiştir, Şekil 2'de belirtilen LM şeması kullanarak, tüm hücre tabakaları LM (Şekil 5) çoğaltmak ve 200,000 mikron 2 başına adaxial epidermisin LM çoğaltma. Her LG1-R ve vahşi tip yaprak primordia LM replike yaklaşık doku 2,500,000 mikron 2 toplanmıştır. Doğrusal, RNA amplifikasyonuna ait iki tur her tekrar için RNA, mikrogram düzeylerindeki miktarlarda bulunmuştur. Herhangi bir mikrodiseksiyon elde edilen RNA miktarı, hücre boyutu ve transkripsiyonel aktivite hem de yakalanan doku miktarına bağlı olacaktır. RNA'nın bütünlüğü RNA amplifikasyonu verimliliğini etkileyecektir.
Transkript birikimi bıçak, ligule ve kılıf bölgelerinin tüm hücre katmanları ve 2359 DE gen toplam analiz edildies yanlış bir bulma oranı (FDR) <0.05 (Şekil 6A) ile bulunmuştur. Özel olarak, 1.714 genler ligule ve bıçak arasında DE edildi, 1.044 genler ligule kılıf arasında DE edildi ve 657 genler (bazı genler, birden fazla karşılaştırıldığında DE olan) bıçak ve kılıf arasında DE edildi. ligule bölgede yukarı regüle olduğu bıçağa göre ligule önemli ölçüde hem de yukarı regüle eğer genler sınıflandırılmıştır ve ligule kılıfa göre. Tüm hücre tabakaları LM, 373 genler önemli ölçüde ligule bölgede yukarı regüle edilmiştir.
Transkript birikimi adaxial epidermis bıçak, ligule ve kılıf bölgelerinde analiz edildi ve 3128 DE genlerinin toplam bulundu; 1,971 genler 2.032 genler ligule kılıf arasında DE edildi ve 871 genler bıçak ve kılıf (Şekil 6B) arasında DE edildi, ligule ve bıçak arasında DE edildi. 287 genler önemli bir bıçak ve kılıf ep göre ligule yukarı regüle edilmiştiridermis.
Ligule bölgede yukarı regüle seçilmiş genler için veriler Tablo 1 ve Şekil 7'de sunulmuştur. In situ hibridizasyon analizi bir ilk LG1 transkript PLB ve vahşi tip yaprak primordia çıkan ligule özel olarak birikir olduğunu göstermiştir ve bu LG1 daha çok dahili hücre katmanları (Şekil 6C) daha epidermis transkripsiyonu. elde edildi LM RNA seq veriler bu sonuçla tutarlı; LG1 transkript birikimi tüm hücre katmanları (Tablo 1, Şekil 7A) epidermal LM ve LM hem bıçak veya kılıf ya daha ligule anlamlı yüksektir. LG1 Şekil 8C gösterilen senaryo benzer tüm hücre katmanları, analizinde daha epidermal analizinde yüksek CPM vardır.
NS1 anlamlı hücre tabakaları LM ve polar taraf epidermisin LM (Tablo 1, Şekil 7B), hem de ligule bölgede yukarı regüle edilmiştir. Bu bulgu, NS1 transkript çıkan ligule (Şekil 6D) ucuna spesifik biriken gösterir, in situ hibridizasyon bölgesi ile teyit edilmiştir. ns1 nedeniyle tüm katmanları LM içinde transkript seyreltme tüm hücre katmanları (sırasıyla 19.6 CPM ve 2.7 CPM) ve LM daha epidermis sadece LM analizinde çok daha yüksek okuma sayısı vardır. Bu seyreltme etkisi Şekil 8A'da gösterilmiştir. Benzer şekilde, GRMZM2G101682, fonksiyonu bilinmeyen bir gen, tüm katmanlar LM (Tablo 1, Şekil 7C) daha ligule epidermal LM daha yüksek bir ortalama okuma sayısı vardı. İn situ hibridizasyon bu gen transkript de epidermal hücreler (Şekil 6E) en güçlü birikir ortaya koydu. Zm PIN1a hücre tabakaları analizinde anlamlı DE değildi, ancak önemli ölçüde epidermis sadece analiz ligule (Tablo 1, Şekil 7D) yukarı regüle edilmiştir. Zm PIN1a yüksek vasküler dokularda ifade edilir ve hücre tabakaları (Şekil 6F) toplandığı zaman, bu L2 türetilmiş vasküler sentezleme epidermiste Zm PIN1a birikimi farklılıkları boşa, bu olasılığı daha yüksektir. Benzer bir senaryo, Şekil 8B'de gösterilmektedir.
LG1-R mutantlarının De olan genleri belirlemek için, transkript birikimi vahşi tip ve LG1 R P6 yaprak primordia tanımlanmış bir bölge karşılaştırılmıştır. Doksan altı genler LG1-R DE idi (FDR <0.05); 59 LG1-R mutantlar olarak azaldı ve 37 regüle edildi. De, seçilmiş gen için veriler <em> LG1-R mutantlar Tablo 2'de sunulmuştur. bel14 hem doğal tipte hem yaprak primordia olarak ligule bölgesinde düzenlendiği ve LG1 R mutant sentezi azalırken 34 gen biridir. In situ hibridizasyon bel14 transkript vahşi tür bitkilerinde, ancak LG1 R yaprak primordia 6 karşılık gelen bölgede preligule bölgede birikebilecek doğruladı.
Şekil 2: yaprak ilkel etki lazer mikrodiseksiyon Programı. (A) LM için işlenmiş mısır sürgün ucuna Yanal boyuna kesit. Kutular mikrodiseksiyon seçilen bölgeleri göstermektedir. Ligule bölge dokusu (kırmızı kutu) PLB merkezli 100 mikron yüksek dikdörtgenler gelen microdissected edildi. Ön kanat (yeşil) ve ön kılıf (mavi), doku 100 um alınmıştır50 um üzerinde ve sırasıyla, preligule seçimi aşağıdaki dikdörtgenler. P6 yaprak primordia baz 400-900 um arasında yabani tip ve LG1 R transcriptomes doku Karşılaştırma için lateral bölümleri (mor kesikli çizgi) ile ilgili microdissected edildi. (B) tüm cep katmanlarının mikrodiseksiyon için seçilmiş P7 primordium ve bölgeler Close-up. (C) adaxial epidermisin mikrodiseksiyon için seçilmiş P7 primordium ve bölgeler Close-up. Mikrodiseksiyon önce P7 primordium'un (D) Preligule bölgesi. Ok başı ligule başlatılması konumunu gösterir. (E) Kırmızı hat mikrodiseksiyon seçili bölgeyi gösterir. lazer, bu hat boyunca kesecek. Çevreler lazer darbeleri doku mancınık noktalarını belirtir. Mikrodiseksiyon sonra (F) primordium. Çevreler lazer darbeleri doku mancınık var noktalarını belirtir. SAM = apikal meristemi vur. P plastochron sayısını gösterir. Ölçek çubukları = 100 &# 181; m. Bu rakam referans 6 (Bitki Biyologlar Telif Amerikan Derneği) modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: LM için seçilen bölge yaprak primordiumunun boyunca De olan genler için okuma sayıları etkiler. Morfolojik noktalarına LM göreceli olarak seçilen bölge (A) doğru konumlandırma yaprak ekseni boyunca bir derecede ifade edilen genler için varyasyon azaltır. sol çoğaltır 1-3, seçimleri düşük çeşitlenme ile sonuçlanan çıkan ligule üzerinde ortalanır. Sağdaki çoğaltır 1-3, LM için seçilen bölgenin konumlandırma artan çeşitlenme ile sonuçlanan tutarlı değil. Sürekli boy s microdissecting (B)Seçim ligule özgü ekspresyonu ile genler için farklı boyutlardaki seçimleri microdissecting karşılaştırıldığında varyasyon (solda 1-3 çoğaltır) (sağda 1-3 çoğaltır) azaltır. Transkript fazla düşük okuma sayısı ile sonuçlanan, daha geniş bir seçim içinde seyreltilmiş, ve daha yüksek bir okuma sayısı ile sonuçlanan, daha az seçiminde daha konsantre edilir. Çizgi ligule bölgede yaprak primordia uzunlamasına kesitini temsil etmektedir. Ok başı ligule başlatılması gösterir. milyonda CPM = sayar. SD = standart sapma. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: yanal bölümler için mısır fidesi diseksiyonu. Kök-çek kavşakta eksize (A) İki haftalık mısır fide. ince dilimler fr kaldırom culm küçük bir oval kadar sürgün (1) taban ateş dibinde görünür. ters taban (2) üzerinde yaklaşık 10 mm kesilmiş ve bu silindiri korumak olun. Doku (B) Silindir böylece taban yukarı baktığından odaklı. yaprak çevrelediği culm oval unutmayın. iki uzunlamasına kesik yanal eksen (3 ve 4) paralel sağlayın. doku merkezi dilim korumak ve düzeltmek, bu kısım SAM ve genç yaprak primordiasında içerecektir. (C) Çizgi atış apeksinden, yan bölüm (yeşil kesikli çizgi) düzlemini gösteren. Kırmızı daire yaprak orta damarı, kırmızı ok ucu gri yaprak primordiumunun marjları olduğunu gösterir. yaprak orta damarı marjlı ekseni: Mavi kesikli çizgi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Çizgi ligule bölgesinin bir deney için, lazer microdissected doku havuzu ile gösterilmiştir. beş-altı slaytlar microdissected doku her tekrar için toplanır. Her bir slayt beş medyan bölümleri kullanılır ve iki seçimleri (kırmızı dikdörtgenler) Her bölümden yapılır. Her dikdörtgen yaklaşık 20.000 mikron 2 'dir. Her örnek için doku, ayrı bir boru (oval mavi) içinde toplanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Yaprak bölgeler arasında ve seçilen DE genlerin in situ hibridizasyon ikili karşılaştırmaları DE genlerin sayısı. Arası ortalama karşılaştırıldığında DE genleri (A) sayısıbıçak, ligule ve kılıfın bölgeleri, hücre tabakaları LM. Bıçak, ligule ve kaplama bölgeleri, sadece polar taraf epidermisin LM arasında çiftli bir karşılaştırma DE genlerinin (B) sayısı. (C) LG1 in situ melezleşme. In situ hibridizasyon (D) NS1. In situ hibridizasyon (E) GRMZM2G101682. In situ hibridizasyon (F) ZmPIN1a. DE: farklı şekilde dile getirdi. L up: bıçak kadar: Yukarı B ligule içinde yukarı. S up: kılıf içinde up. CF Ok ucu ligule ortaya göstermektedir. F Ok vasküler dokularda transkript birikimini gösterir. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakam referans 6 (Bitki Biyologlar Telif Amerikan Derneği) modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
t = "Şekil 7" src = "/ files / ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
Şekil 7: Seçilen DE genleri için Verilerin grafiksel gösterimi. Şekil Tablo 1 'de ve in situ hibridizasyon sonuçlarını sunulan verileri göstermektedir. Çizgi yaprak primordia uzunlamasına kesitini temsil etmektedir. Koyu mavi, belirli bir gen için transkript birikimi gösterir. Yeşil, kırmızı ve mavi kutular bıçak, ligule ve kılıf örnekleri için mikrodiseksiyon seçili bölgeyi gösterir. Soldaki Karikatürler tüm cep katmanlarının LM göstermektedir. Sağdaki Karikatürler sadece adaxial epidermis LM göstermektedir. Reklam: adaxial epidermis, Ab: abaxial epidermis, CPM: Milyonda sayar, yıldız iki etki alanı arasında anlamlı bir fark göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
"Src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
Şekil 8: Karikatür varsayımsal DE genleri için sayıları okumak nasıl gösteren mikrodiseksiyon için seçilmiş kesin bölgelere göre değişmektedir. Ligule spesifik ifadesi (A) Gene. (B) Gene ligule ve vasküler dokularda ifade edilmiştir. (Cı) Gene, tüm hücre tabakalarının ligule bölgede değil epidermiste daha yüksek ifade ile, spesifik olarak tanımlanmalı. (D) Gene ligule bölgede ifade L2-türevi hücre tabakaları, sadece. Çizgi yaprak primordia uzunlamasına kesitini temsil etmektedir. Koyu mavi, belirli bir gen için transkript birikimi gösterir. Yeşil, kırmızı ve mavi kutular bıçak, ligule ve kılıf örnekleri için mikrodiseksiyon seçili bölgeyi gösterir. Soldaki Karikatürler tüm cep katmanlarının LM göstermektedir. Sağdaki Karikatürler sadece adaxial epidermis LM göstermektedir. Reklam: adaxial epidermis, Ab: abaxial epidermis, CPM: cou Milyonda NTS. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: ilkel ligule upregüle seçilen genler. Milyonda Sayımlar: Benjamini ve Hochberg yöntemine göre yanlış keşif oranı: milyon toplam transkript başına sayımları üç kez tekrarlanmış, logFC = log tabanı 2 Katlı Değişim, FDR.BH ortalama. Tüm katmanları: tüm cep katmanları LM. Epidermis: Sadece adaxial epidermis LM. Bu rakam referans 6 (Bitki Biyologlar Telif Amerikan Derneği) modifiye edilmiştir. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
Tablo 2: Seçilmiş genler DE LG1-R mutant. Milyonda Sayımlar: Benjamini ve Hochberg yöntemine göre yanlış keşif oranı: milyon toplam transkript başına sayımları üç kez tekrarlanmış, logFC = log tabanı 2 Katlı Değişim, FDR.BH ortalama. Bu rakam referans 6 (Bitki Biyologlar Telif Amerikan Derneği) modifiye edilmiştir. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deney tasarımı RNA DİZ deneylerinde önemli bir faktördür. Anahtar hususlar kesin etki (ler) ve gelişimsel aşaması (ler) analiz edilecek ve ne karşılaştırmalar yapılacaktır vardır. çıkış iki veya daha fazla durum arasında de genlerin bir liste genellikle, çünkü karşılaştırmalar açısından düşünmek için çok önemlidir. Tüm deneylerde olduğu gibi, aynı anda yalnızca tek bir değişken değiştirmek için önemlidir. Farklı yaprak etki karşılaştırırken Örneğin, aynı koşullar altında yetiştirilen aynı yaş ve gelişim aşaması, karşılaştırıldığında edilmelidir bırakır.
Bu deneylerin amacı, özel olarak yukarı ya da yabani tip yaprak primordia ligule bölgede aşağı regüle edilen genlerin belirlenmesi ve yabani-tür ile karşılaştırıldığında, LG1-R mutantlarının De olan genleri tanımlamak için oldu. Biz ilk gelişmekte olan yaprak taslakları morfolojisi ve LG1 transkript birikimi modelini inceledik. Bu morfolojik ve moleküler görülecek were LM 14, 15, 16 için kesin etki seçmek için kullanılır. İlk deneyde, ligule bölgede transkript birikimi dolayısıyla büyüme koşulları, genetik arka plan, gelişim aşamasında, ve bitki-to-bitki varyasyon nedeniyle farklılıkların giderilmesi, aynı yaprak taslakları diğer bölgelere göre edildi. Vahşi tip mutant karşılaştırmak için, nerede ve ne zaman ilgili gen olarak ifade belirlemek için gereklidir. Biz yoluyla in situ hibridizasyon veya bağışık olarak ifade desen analiz ve gen ifadesinin alanını kapsayan LM için bir bölgeyi seçmenizi öneririz. Eş etki mukayese edilir ve genetik arka hem de mutant ve vahşi tip için aynı olması önemlidir.
microdissections doğruluğu su ise, ilgi alanında özellikle ifade genler için okunan sayımları kontrol ederek kontrol edilebilirch genler bilinmektedir. Bu aynı zamanda, sıralama için kütüphane yapmadan önce LM dokusundan ekstre RNA üzerinde RT-PCR uygulayarak yapılabilir. Burada tarif edilen deneylerde, LG1 in situ hibridizasyon LG1 sentezleme PLB özgü olduğunu göstermiştir ve ligule 5, 6 ortaya olan analizleri beri, ligule bölgenin LM için bir kontrol olarak görev yapmıştır.
Bu aday gen (ler) i bilinmelidir RT-qPCR olarak yöntemlerden farklı olarak, RNA DİZ belirli bir doku numunesinde her transkript birikimini ifade etmektedir. Böylece, LM RNA seq aday genleri tanımlamak için yararlı bir yöntemdir. Bu çalışmadan elde edilen bir örnek GRMZM2G101682, çarpıcı bir ligule özgü sentezleme modelini (Şekil 6E) sahiptir fonksiyonu bilinmeyen bir gendir. Bu çalışma aynı zamanda, daha önce LG1 aşağı hareket olarak karıştığı olmasaydı böyle bel14 olarak LG1-R DE olan genleri, tespit. thi içindes örneği (LG1-R vahşi tipi ligule bölgesi ve DE yukarı regüle), birden çok veri setlerinin karşılaştırması, özellikle bilgilendirici. Bir genin ifade deseni işlevini göstermek olmadığını dikkat etmek önemlidir: sonraki genetik ve / veya biyokimyasal analizler gen fonksiyonunu kurmak için gereklidir.
farklı şekilde farklı ve kolayca tarif olan küçük, ayrık gelişimsel etki, odaklanmış transkriptomik analizler, en başarılı. LM RNA DİZ bu analizler için uygun bir yöntem, ve birçok gelişme olgulara uygulanacak bir potansiyele sahiptir. Özellikle mekansal ifade kalıpları, ya da belirli yapıların gelişimini etkileyen mutantlar kısıtlı olan genlerin mutantlar diferansiyel gen ifadesini tanımlamak için uygundur. Aynı zamanda, epidermis ya da damar gibi özel ve tanımlanabilir hücrelerden veya dokulardan meydana işlemlere tatbik edilebilir ve kullanılmaktadırmısır bir transkriptomik analiz apikal meristem (SAM) ontogenezini 16 vur. Her yerde ifade edilen genlerin işlevini okuyan veya tüm hücrelerde gerçekleşen işlemler için daha az uygundur. Burada yer alan yöntem başarılı bir şekilde bitki türleri (mısır, sorgum, Ocimum, Mentha ve Antirrhinum) ve yapılar (yaprak primordia, meristemler, rizomlar ve tüyler) çeşitli uygulanmıştır.
bir analiz nispeten büyük etki içerdiğinde LM gerekli değildir. Nitekim, el-disseke veya tüm organlar üzerinde RNA Seq, 15 bitkilerde 14 DE genleri tanımlamak için başarıyla kullanılmaktadır. Bu yaklaşım daha az emek yoğun olma avantajına sahiptir ve histolojik teknikler ile hiçbir deneyimi gereklidir. Ancak, el diseksiyonu hassas sınırlamalar El diseksiyonu erken d okuyan için daha az uygun olduğu anlamına vardırevelopmental işlemler.
Başarılı LM RNA Seq gelişimsel olayların analizleri için, gelişimsel bağlam iyi karakterize edilmelidir. Biz bir deney planlamadan önce süreç veya ilgi alanına kapsamlı bir histolojik inceleme üstlenen öneririz. dokular lekesiz ve derinliğini-of-field sağlayan kapak fişleri ile monte edilmez çünkü LM için işlenen örneklerin histoloji, genellikle kötüdür. Nedenle, LM örnekleri (Şekil 1 C, ve D) sabit olarak, aynı zamanda boyama ve gözlem için ayrı numune düzeltmek için yararlıdır.
LM malzemeden elde edilen RNA genelde parçalanmış ve toplam verim 8 düşüktür. Bir amplifikasyon aşaması, bir kütüphane hazırlanması 28 için yeterli RNA üretmek için yeterlidir. RNA fragmanı uzunluk amplifikasyonu sonra ve önceki kütüphane nesil değerlendirilmelidir. SE bir ortalama fragman uzunluğuyüz veral baz çifti genellikle iyi olarak kabul edilir, 500 baz çifti mükemmel. bozulması nedeniyle RNaz için kirlenme olursa, ya da parafin bloklar yanlış saklandığı takdirde doku, iyi sabit değilse yoksul RNA verimi neden olabilir. Çok küçük etki microdissecting için çok fazla zaman tahsis önce nispeten büyük bir alanın bir deneme LM üstlenerek sabit doku kalitesini test etmek için yararlıdır. LM hücrelerinden elde edilen RNA-dt primeri güçlü 3 'sapma katan bir oligo kullanılarak parçalanır ve amplifikasyon olduğu için, bu yöntem, ek yeri varyantları ve alternatif transkriptleri tespit edilmesi için uygun değildir. Ne LM küçük RNA saptanması için uygundur.
Alternatif bir yöntem, belirli bir doku ya da hücre etki transkript birikimi (FACS) 21 Kontrol THP ile ayrılan hücrelerin RNA DİZ edilir ölçmek için. Bu yöntem, genel olarak, ilgi bölgesi için uygun bir marker geninin tanımlanmasınıfloresan-etiketli protein ve protoplasting ifade eden transgenik bitkilerin üretimi. Mikroarray ile birlikte FACS kök 22, 23 hücre tipine spesifik promotörler eksprese eden hücrelerin ayrılması ile, Arabidopsis kök bir ekspresyon haritası oluşturmak için kullanılmıştır. Sürgün dokuların FACS klorofil otofloresansı 24 nedeniyle kök dokulara daha zordur. LM bir sınırlaması ilgi alanı histolojik bölümlerde tanımlanabilir olması gerekliliğidir. FACS uygun bir işaretleyici gen mevcut olduğu durumlarda daha uygun bir yöntem olabilir. hücreleri veya dokuları izole etmek ve karşılaştırmak için hangi seçim ya FACS veya LM kullanması transkriptomik analizlerde önemli bir husustur.
Burada sunulan veriler, LM (Şekil 3, Şekil 8 için seçilmiş kesin etki bağlı olarak farklı sonuçlar elde edilecek göstermektedir). Geniş doku etki incelendiğinde bu NS1 gibi bir ya da bir kaç hücre olarak ifade edilir genlerin kopyalanmasına, seyreltilmiş olacaktır. Bütün yaprak taslakları örneklenmiş olsaydı, ns1 transkript tespit edilemez olasıdır. ZmPIN1a anlamlı bıçak ve kılıf epidermis göre ligule yukarı regüle edilir ancak tüm hücre tabakaları örneklenmiş zaman bu fark vasküler ifadesi ile eleştirilmiştir edilir. Yalnızca epidermis (Şekil 8D) örneklenir tersine, sadece L2 türetilmiş hücre tabakaları olarak ifade edilmiştir genler tespit edilmez. Bu çalışma, LM RNA Seq morfogenez esnasında gen sentezlenmesinin farklılıkları tespit etmek için güçlü bir araç ise, analiz için seçilen alan deney başarısı için çok önemlidir, göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar işbirliği, devam eden ve ligule gelişimi ile ilgili tartışmalar uyarıcı S. Hake teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB 1052051 ve IOS-1848478 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
