Abstract
開発に重要な役割を持つ遺伝子は、しばしば、空間的および/または一時的に制限された発現パターンを有します。多くの場合、これらの遺伝子転写物は検出されないか、または差動で全体の植物器官のトランスクリプトーム解析に（DE）表現として識別されていません。レーザーマイクロダイセクションRNA-のSeq（LM RNA-のSeq）は、特定の発達のドメインにDEされる遺伝子を同定するための強力なツールです。しかし、顕微解剖と比較するための細胞ドメインの選択、およびmicrodissectionsの精度は、実験の成功に不可欠です。ここでは、2つの例は、トランスクリプトミクス実験のための設計上の考慮事項を説明します。 DEは、トウモロコシの葉の近位-遠位軸、及びliguleless1-R（LG1-R）でのDE遺伝子を同定するための第二の実験に沿っている遺伝子を同定するためのLM-RNA配列分析 変異体は、野生型と比較しました。これらの実験の成功に貢献の重要な要素は、組織学的およびSIで詳述しました。TUのハイブリダイゼーションは、同等の発生段階の葉原基の選択、分析されるべき領域の顕微解剖のための領域を選択するための形態学的なランドマークの使用を分析し、正確に測定されたドメインの顕微解剖。本稿では、LM、RNAのSeqによって発達ドメインの分析のための詳細なプロトコルを提供します。ここに示されたデータは、顕微解剖のために選択された領域が得られた結果にどのように影響するかを示しています。
Introduction
それは遺伝的解剖（ 図1A）の影響を受けやすいブレードとシースとの間に明確な境界を持っているとして、トウモロコシの葉は、形態形成の間に発達フィールドの形成を研究するための理想的なモデルです。葉の開発、より小さなセルの線形バンド、preliguleバンド（PLB）の初期段階で、事前ブレードおよびプレシースドメインに葉原基を細分化します。フリンジのような小舌と三角耳介は、PLB（ 図1A、C、D）から発生します。遺伝子スクリーニングは、ブレード・シース境界を崩壊させる変異を同定しました。例えば、劣性liguleless1（LG1）の変異は、小舌と耳介1、2、3、4（ 図1B）を削除します。 in situハイブリダイゼーションLG1転写物がPに蓄積することを明らかにしましたそれ小舌の開発5、6のための優れたマーカー（ 図1E）作りLBと新興小舌、。
図1：野生型と liguleless1-R トウモロコシの葉。 （A）小舌と耳介の構造を示す成熟した野生型の葉のブレードシース境界領域。小舌と耳介の構造が存在しないことを示す成熟liguleless1-Rの葉の（B）ブレード・シース界領域。 AとBでの葉は中肋に沿って半分にカットされています。 （C）野生型の葉の原基の縦断面図。サンプルを処理し、組織学的分析のために染色されています。開始小舌は葉（矢じり）の面から突出するバンプとして明らかです。 （D）縦宗派野生型の葉の原基を介してイオン。本文中に記載されているように、サンプルは、LMのために処理されています。アローヘッドは、小舌を開始示しています。シュート頂側面縦断面のin situハイブリダイゼーション（E）LG1。アスタリスクは、P6の葉原基のPLBでLG1転写産物の蓄積を示しています。矢印は、P6原基のベースを示しています。バーでは、PLBへの原基のベースから測定値を示しています。 AとBの中のスケールバーは20ミリメートルを=。 CEでのスケールバー=100μmです。この図は、参照6（植物生物学者の著作権協会）から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
本研究では、LM RNA-のSeqを差動葉原基の他の部分に、IDEにブレードシース境界相対で（DE）に発現する遺伝子群を同定しました野生型の兄弟に比べてLG1-R変異体でDEですntify遺伝子。 LM-RNAのSeqは、特定の細胞または細胞のドメイン7に転写物の蓄積を定量化する方法です。直動システムは、レーザーやデジタルカメラと顕微鏡を組み合わせます。切片組織は、スライド上にマウントし、顕微鏡を通して見られます。 LMソフトウェアは、典型的には、ユーザが顕微解剖のために任意の選択した領域を概説することを可能にする描画ツールが含まれています。線に沿って、レーザーカット、および選択された組織は、スライドをオフに放り出さし、スライド上に懸架チューブにされています。 LMは、ユーザが特定の細胞層を含む正確なドメイン、さらには単一細胞8,9を顕微解剖することができます。次いで、RNAを顕微解剖組織から抽出することができます。その後、RNA-のSeq成分が抽出されたRNA 10から生成されたcDNAライブラリーを配列決定するために、次世代シーケンシングを利用して、= "外部参照"> 11。
LM RNA-seqのの主な利点は、転写物の正確に定義されたドメイン内の蓄積と同時に全体のトランスクリプトーム7のプロファイルを作成する能力を定量する能力です。技術は、関心領域は、多くの場合、微小な初期発生イベントをプローブに特に適しています。以前の研究は、植物9の発生過程を研究するためのマイクロアレイ技術、12、13と組み合わさLMを利用しています。 RNA-SEQが低発現される遺伝子を含む、広いダイナミックレンジにわたって転写を定量化するという利点を有し、かつ事前配列情報は、11を 10に必要とされません。また、LM RNA-のSeqは、遺伝子冗長性または喪失型の致死性に突然変異誘発画面でミスの可能性があることを発育に重要な遺伝子を強調するために可能性を秘めています機能変異体。
このような狭いsheath1（NS1）とカップ状cotyledon2（CUC2）などの発達に重要な遺伝子は、多くの場合、ただ1つまたは少数の細胞17の特異的な発現パターンを持っている18、19、20。多くは成熟した臓器に発生初期の段階でのみ発現し、されていません。全体の臓器や大規模なドメインを分析すると、これらの細胞特異的転写産物が希釈され、より多くの従来の分析で検出されない場合があります。正確に定義されたドメインの分析を可能にすることにより、LM RNA-のSeqは、これらの組織特異的遺伝子を同定し、定量化することを可能にします。
ここに記載した実験の成功に重要な要因は、分析のための適切な発達段階とドメインの選択を導いた徹底的な組織学的分析、および正確なmeasuremeましたLMための細胞組織のドメインのヌクレオチド。同等のドメインは、すべての複製のためにサンプリングしたことを確認するために、組織は、同じ発達段階での葉原基から回収し、顕微解剖されたドメインは、新興小舌（ 図2）のような形態学的なランドマークと比較して測定しました。いくつかの遺伝子は、葉の基部の先端からの勾配で発現することが知られています。葉の近位-遠位軸に沿った異なる場所からサンプリングの正確なドメイン、変化を測定することにより、最小値（ 図3A）に維持しました。同じサイズのドメインをmicrodissectingすることにより、細胞特異的転写物の希釈差によるばらつきも（ 図3B）に減少しました。茎頂の側面縦断面は全てmicrodissectionsのために使用しました。これらは、（ 図4）中肋マージンの軸に垂直な部分です。 SAMを含むセクションのみを使用することと同等の横方向の領域を確保し葉原基が分析されます。
処理され、LMのために切片サンプルでは、小舌伸長の最初の形態学的兆候が原因向軸表皮（ 図1D、 図2）における周縁の細胞分裂に向軸側のバンプです。新興小舌を確実plastochron 7段葉原基で識別することができることを判断しました。私たちは、新興小舌と耳介を形成することになるすぐ遠位の細胞を含む全小舌の領域で発現する遺伝子、に興味を持っていました。同等の組織の選択が行われたことを確実にするために、小舌のバンプは、形態学的ランドマークとして使用し、小舌バンプを中心100μmの矩形はLM（ 図2A、2B）のために選択しました。前ブレードとプレシースの同等サイズの矩形が同じ葉原基から選択されました。
liguleless変異植物の分析は異なるchalleを発表しましたNGE; LG1-R変異体は、したがって、この形態学的特徴は、LMための領域を選択するために使用することができなかった、小舌を形成しません。代わりに、野生型の葉の原基におけるLG1転写物の蓄積の領域を決定し、このドメインを含むであろう領域を定義しました。以前の研究は、PLBの位置は、成長条件に依存して変化することを示したので、これらの予備的な分析は、最終的な分析のために使用したのと同じ植え付けから苗木上で実施しました。 in situハイブリダイゼーションはLG1転写物がPLB P6の葉原基（ 図1E）に蓄積することが示されました。私たちは、LG1式（紫の長方形、 図2A）のドメインを包含し、野生型とLG1-R植物からこれらの同等の領域を撮影した葉原基のベースからドメイン400〜900ミクロンを選択しました。 transcripを比較した場合、遺伝的背景と成長条件の変化を最小限に抑えるために、LG1-R及び野生型植物におけるT蓄積は、変異体と野生型同胞の分離ファミリーを使用しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：組織は、LMのために固定されるのと同時に、組織学的分析のために組織を修正しました。後でLM案内します形態学的特徴のために染色した切片を調べます。野生型と変異体を比較すると、目的の遺伝子を（この場合LG1に）発現されるドメインを定義するために、in situハイブリダイゼーションまたは免疫学的に行います。
1.組織固定および処理
- 標準的な条件6の下で旧2週間にトウモロコシ苗の干潟を成長させます。
- 側部（ 図4）のための茎頂を解剖。
- ちょうど土ライン以下の物品税の苗。
- カミソリの刃を使用して、1または2の成熟葉に囲ま稈の楕円形が見える（ 図4B）になるまで、ステム（カット1、 図4A）の基部から薄いスライスを削除します。
- 約10mmベース（2をカットし、 図4A）の上に別のカットを行います。この10ミリメートルのセグメントは、SAMと若い葉原基が含まれています。
- ベースが上を向いているので、10ミリメートルのセグメントをオンにします。 2-3 mm厚の組織切片を（切断3、及び図4、 図4B）が得られるように、2つの切り込みは、横軸に平行します。外側の2つの部分を破棄し、固定および包埋のために中央のスライスを保持しています。
注：外葉をトリミングして廃棄することができます。
- 埋め込むための組織とプロセスを修正しました。
- その後の工程で使用するすべての材料がRNaseフリーであることを確認します。 （溶液1リットル当たり1ミリリットルDEPC時々振盪し、オートクレーブで一晩インキュベート）ジエチルピロカーボネート（DEPC）の溶液を扱います。少なくとも6時間、200℃以上のオーブン中でガラス製品焼くおよびRNaseの除染液でプラスチックウェアを扱います。
- 1日目：氷上のガラスバイアル中（酢酸：1エタノール3）ファーマーズ修正〜10ミリリットルで組織切片を浸し。すべてのサンプルが解剖された後、vacuu適用M気泡を除去し、固定液の浸透を支援します。ゆっくり真空を解放した後、10分間真空下で保持します。固定液を交換し、穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートします。
- 2日目：各〜10ミリリットル、ソリューションの次のシリーズでインキュベート1時間ごと、穏やかに振盪しながら、すべての。 4℃、4℃、4℃、4℃、4℃、100％エタノールでの100％エタノールでの100％エタノールで95％エタノール、1 85％エタノール：1エタノール：室温でキシレン、室温で100％のキシレン、室温で100％のキシレン。
注：キシレンは接触および吸入による毒性があります。ドラフト内で作業し、適切な手袋を使用しています。 - キシレンの約半分の体積に培地ペレットをパラフィン包埋組織を追加し、穏やかに振盪しながら室温で一晩インキュベートします。
- 3日目：ペレットが溶融するまで60℃のオーブンにバイアルを転送します。ソリューションを捨て、新鮮な溶融組織包埋剤と交換してください。培地を2回以上変更日中。
- 4日目：午前中に一度メディアを埋め込む変更組織。午後になるまで60℃のオーブンに戻ります。
- キャスト・ブロック
- 組織埋め込みステーションのホットプレート上に埋め込む金型を置きます。切断面を下に向けて、埋め込み型への組織サンプルを転送するために鉗子を使用してください。溶融パラフィンで金型を補充し、金型の上に埋め込みリングを配置します。パラフィンが凝固するまでコールドプレートに移します。シリカゲルと密閉容器に4℃でパラフィンブロックを格納します。
2.セクショニングと準備をスライドさせ
- ミクロトーム25に10μmの切片をカットします。
- リボンを調べ、中央値のセクションを選択します。中央値のセクションでは、葉原基に囲まれた細胞のドームのように表示されるSAMを、記載されたものです。
- スライド上のマウントセクション。
- LMのに適している場所スライド（いずれかのRNaseを含みませんか、焼成）42°Cの暖かいスライド及びスライドをカバーするために、50％エタノール溶液の数滴を加えます。
- セクションが展開するまでエタノール溶液のセクションをフロート。
注：フローティングエタノール溶液のセクションではなく、水はRNA分解を減少させる沈殿した状態でRNAを保持します。 - スライドを傾け、使い捨てのトランスファーピペットで吸引により過剰のエタノール溶液を除去。追加のエタノール溶液を移送するようにリントフリーワイプを使用してください。
- 数時間または一晩42℃で乾燥したスライド。ストアは、シリカゲルで密閉容器中、4℃で摺動します。
- 脱パラフィンは、使用当日にスライドします。
- 含む3ガラスコプリンジャーを準備し; 100％キシレン（キシレンI）、100％キシレン（キシレンII）、および100％エタノール（〜各溶液50ml）。
- スライドを転送するためにクリーンな鉗子を使用して、Iは2分間、2分間、キシレンII、および1分間の100％エタノール、キシレンにスライドを浸します。
- ドレインにスライド室温でリントフリーワイプ、空気乾燥にエス。
Plastochron 7葉の原基からブレード、小舌とシースサンプルの3顕微解剖
- LM顕微鏡のステージ上にスライドを固定します。スライドごとに5つのセクションを利用し、各反復のために5または6のスライドを使用してください。
注：単一の反復のための組織のプールは、図5に示されています。 - スライドを調べ、中央の参照点としてSAM頂点を使用して、各スライド上に5つの最も中央値のセクションを識別します。
注：これは、低倍率で行うことができ、通常5倍対物レンズで十分です。 - 10倍または20倍対物レンズを使用して、各セクションのplastochron 7葉原基に小舌の位置を特定します。小舌は、葉原基の向軸面から突出するバンプとして表示されます。 LMソフトウェアの描画ツールを使用してこの位置をマークします。鉛筆アイコンを選択し、適切なPOSITIにカーソルを移動上および描画するマウスをクリックしてドラッグします。
注：10Xや20Xの目的は、この以降に適しています。横方向のセクションを使用する場合は、各リーフ原基の両側には、各区画（ 図2A）に存在します。 - 定規ツールと長方形の描画ツールを使用して、各セクション（赤長方形、 図2A、2B）の小舌を中心に100μmの高長方形を測定します。これらは、「小舌」のサンプルになります。
- 定規ツールを使用すること。定規のアイコンを選択し、測定対象物の一方の端にカーソルを移動し、クリックして、オブジェクトを測定するためにドラッグします。定規の長さが画面に表示されます。
- 四角形を描画するには、 、四角形のアイコンを選択し、長方形の一角であることをクリックして、適切な大きさの四角形を描画するためにドラッグしますポイントにカーソルを移動します。また、直線描画ツールを選択して、4本の直線を引きます。
- メジャー100μmの矩形は50μmの「小舌」の長方形の上方と下方に位置します。
注：これらは、「ブレード」と「シース」のサンプル、それぞれ（緑と青の長方形、 図2A、2B）となります。我々の組織学的データに基づいて、100μmの矩形は、全小舌の領域を包含する。ブレードシースの等価なサイズの部分は、組織の同様の量が毎に収集されたことを確認するために選択しました。 50μmのスペーサーには小舌地域組織が不注意ブレードまたはシースmicrodissectionsに含まれていないことを確認するために使用されました。
- 顕微解剖測定長方形（ 図2D - 2F）7、8、9、別々のチューブに小舌、ブレードシースサンプルを収集。選択したドメインの輪郭に沿って組織切片を切断するためにレーザーカット機能を使用してください。 CATAを使用してくださいスライドオフとチューブの蓋（ - 2F 図2D）に組織の矩形を推進するPULT機能。
Plastochron 7葉の原基からブレード、小舌とシース向軸表皮サンプルの4顕微解剖
- セクションを選択して、セクション3（上記）に記載されているように、plastochron 7小舌を中心に100μmの高いセグメントを測定するために、定規ツールを使用します。
- 描画ツールでアウトラインによって向高い各100μmの表皮細胞「ブレード」と「シース」セグメント（緑と青の選択、 図2C）のみを選択します。表皮は、外側の細胞層です。向軸側は、SAMに最も近いものです。
- 3.3節（赤選択、 図2C）に記載されているように「小舌」のサンプルについては、新興の小舌のバンプの細胞のみを選択します。
- ブレード、小舌とシェイ収集顕微解剖選択された領域、セクション3.5で説明したように別々のチューブ内番目表皮サンプル、。
LG1-Rおよび野生型兄弟からPlastochron 6葉の原基の5顕微解剖
- 変異体（LG1-R）および野生型植物の家族を分離育てます。
- セクション1.2から1.4で説明したように、LMのための茎頂を修正し、プロセス。分離それらを維持するために、別々のバイアル中の野生型および変異シュート頂点を修正しました。同じ植栽からの試料を固定し、in situハイブリダイゼーションのために処理されるべきです。
- LG1は、in situハイブリダイゼーション6、26、27 にLG1を実行することにより、野生型の兄弟で転写されている場所を特定。複数のサンプル（ 図1E）で葉原基のベースからLG1転写産物の蓄積の位置を測定します。
- in situハイブリダイゼーションデータに基づき、リーフプリモの一部を選択しますLG1が転写された領域を包含するrdium。この場合、plastochron 6葉原基（紫の長方形、 図2A）のベース400から900ミクロン。
- セクション3.5で説明したように顕微解剖は、別々のチューブにLG1-Rおよび野生型サンプルを収集、葉原基の部分を選択しました。
6. RNA抽出バッファーを適用します。
- 顕微解剖された組織に50μlのRNA抽出緩衝液を適用し、RNA抽出を進めます。参照6で説明したようにRNA抽出、RNA増幅、ライブラリー構築、シーケンシングとバイオインフォマティクス解析を続行します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
約1,000,000-1,500,000μm2の組織のそれぞれのために回収した。図2に概説LM方式を使用すると、すべてのセル-層LMに（ 図5）を複製し、20万平方 μmあたりは、向軸表皮LMのために複製します。それぞれがLG1-Rおよび野生型葉原基のLMで複製するための約組織の250万μm2で収集しました。リニアRNA増幅の2ラウンドの各反復のためのRNAのマイクログラム量が得られました。任意の顕微解剖から得られたRNAの量は、細胞の大きさおよび転写活性ならびに捕捉された組織の量に依存するであろう。 RNAの完全性は、RNA増幅の効率に影響を与えます。
転写産物の蓄積は、すべてのブレードの細胞層、小舌とシース領域および2359 DE GENの合計で分析しましたESは、偽発見率（FDR）<0.05（ 図6A）と、発見されました。具体的には、1714の遺伝子が小舌とブレードとの間のDEをした、1044の遺伝子が小舌とシースとの間のDEをした、と657の遺伝子は、（いくつかの遺伝子が複数の比較でDEをしている）、ブレードとシースとの間のDEでした。小舌地域においてアップレギュレートされるよう、それらはかなりシースに比べて翼と小舌に比べ両方で小舌上方制御された場合の遺伝子が分類されました。すべての細胞層LMでは、373の遺伝子が有意に小舌領域でアップレギュレートされました。
転写産物の蓄積は、向軸表皮の刃、小舌とシース地域で分析したところ、3128 DE遺伝子の合計が見つかりました。 1971の遺伝子が小舌とブレードの間DEた、2032の遺伝子が小舌とシースとの間のDEたし、871の遺伝子は、ブレードとシースとの間のDE（ 図6B）でした。 287遺伝子が有意にブレードとシースEPに比べて小舌にアップレギュレートされましたidermis。
小舌部位においてアップレギュレートされている選択された遺伝子についてのデータを表1および図7に示されています。 in situハイブリダイゼーション分析における初期はLG1転写物がPLBと野生型の葉原基の新興小舌に特異的に蓄積することが示され、そのLG1は、より高度の内部細胞層（ 図6C）に比べて表皮に転写されます。得られたLM RNA-seqのデータは、この結果と一致しています。 LG1転写物の蓄積は、全ての細胞層（ 表1、 図7A）の表皮LMとLMの両方のブレード又はシースのどちらかよりも小舌において有意に高いです。 LG1は、 図8Cに示されたシナリオに似たすべての細胞層の分析に比べて表皮の分析においてより高いCPMを持っています。
NS1が大幅にすべての細胞層LM及び向軸表皮LM（ 表1、 図7B）の両方で小舌の領域においてアップレギュレートされました。この知見は、NS1転写物が出現小舌（ 図6D）の先端に特異的に蓄積することを示しており、in situハイブリダイゼーションによって確認しました。 NS1が原因で、すべての層LMにおける転写物の希釈に（それぞれ19.6 CPMと2.7 CPM、）すべての細胞層のLMに比べて表皮のみのLM分析において非常に高いリード回数を持っています。この希釈効果は、 図8Aに示されています。同様に、GRMZM2G101682、機能未知の遺伝子が、すべてのレイヤLM（ 表1、 図7C）よりも小舌上皮LMが高い平均リード回数を持っていました。 in situハイブリダイゼーションでは、この遺伝子転写物はまた、上皮細胞（ 図6E）で最も強く蓄積することを明らかにしました。 ZM PIN1aは、すべての細胞層の分析で有意にDEはありませんでしたが、大幅に表皮のみの分析（ 表1、 図7D）に小舌でアップレギュレートされました。 ZmをPIN1aは非常に血管組織で発現し、このL2由来の血管発現はすべての細胞層が収集され、表皮でZmのPIN1aの蓄積（ 図6F）の違いを混乱させるされているため、これが最も可能性が高いです。同様のシナリオが、図8Bに示されています。
LG1-R変異体ではDEされる遺伝子を同定するために、転写産物の蓄積は、野生型およびLG1-R P6の葉原基の定義された領域で比較しました。 96遺伝子は、LG1-R（FDR <0.05）にDEありました。 59はLG1-R変異体においてダウンレギュレートされ、37が上方制御されました。でDEされている選択された遺伝子のためのデータ<EM> LG1-R変異体は、 表2に示されています。 bel14は、両方の野生型の葉原基に小舌地域においてアップレギュレートし、LG1-R変異体においてダウンレギュレートされた34遺伝子のうちの1つです。 in situハイブリダイゼーションbel14転写物は野生型植物でpreligule領域ではなくLG1-R葉原基6の対応する領域に蓄積することが確認されました。
図2： 葉原始ドメインのレーザーマイクロダイセクションのためのスキーム。 （A）LMために処理トウモロコシ茎頂の横方向の縦断面図。ボックスは、顕微解剖のために選択された領域を示しています。小舌地域組織（赤いボックス）は、PLBを中心に100μmの高長方形、から顕微解剖しました。前ブレード（緑）、プレシース（青）組織が100ミクロンから採取しましたそれぞれ50μmのpreligule選択の上下に長方形。 P6の葉原基のベース400から900ミクロンの間の野生型およびLG1-Rのトランスクリプトーム、組織の比較のために横方向のセクション（紫の破線）から顕微解剖しました。 （B）すべての細胞層の顕微解剖のために選択されたP7の原基と地域のクローズアップ。 （C）向軸表皮の顕微解剖のために選択されたP7の原基と地域のクローズアップ。顕微解剖前P7原基の（D）Preligule地域。アローヘッドは、小舌を開始する位置を示しています。 （E）レッドラインは、顕微解剖のために選択した領域を示しています。レーザーは、この線に沿ってカットします。円は、レーザーパルスが組織をカタパルトます点を示しています。顕微解剖後の（F）原基。円は、レーザーパルスが組織を放り出されているポイントを示します。 SAMは=頂端分裂組織を撃ちます。 Pはplastochron番号を示しています。スケールバー= 100＆＃181;メートル。この図は、参照6（植物生物学者の著作権協会）から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：LMのために選択された領域は、葉原基に沿っDEである遺伝子のためのカウントを読んで影響を与えます。 （A）の形態学的ランドマークにLMの相対のために選択した領域の正確な位置決めは、葉の軸に沿って勾配で発現する遺伝子のためのばらつきを低減します。左側の複製1-3で、選択は低い変動が生じ新興小舌を中心にしています。右側の複製1-3で、LMのために選択された領域の位置決めが増加変動が生じる一貫性がありません。一貫サイズSをMicrodissecting（B）選挙は小舌特異的な発現パターンを持つ遺伝子についての異なるサイズの選択をmicrodissectingに比べ変動（左の1-3を複製）（右側の1-3を複製）を低下させます。転写物は、より低い読み出し回数で、その結果、より大きな選択で希釈し、高いリード回数で、その結果、より小さな選択でより濃縮されています。漫画は小舌地域の葉原基を介して長手方向の断面を表します。アローヘッドは、小舌を開始示しています。 CPM =百万当たりのカウント。 SD =標準偏差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：横方向のセクションのためのトウモロコシの苗の解剖。ルートシュート接合部に切除した（A）2週齢のトウモロコシ苗。薄くスライスFRを削除します撮影の基本OM（1）稈の小さな楕円形のは、シュートの基部に表示されるまで。横方向のベース（2）より約10ミリメートルをカットし、このシリンダーを保持していることを確認します。ベースので、向きの組織の（B）シリンダが上を向いています。葉に囲ま稈の楕円形に注意してください。 2つの長手方向のカットが横軸（3と4）に平行してください。組織の中央スライスを保持し、修正し、この部分は、SAMと若い葉原基が含まれます。 （C）漫画は、茎頂を介して横方向セクション（緑の破線）の面を示します。赤い円は、赤色の矢印がグレーの葉原基のマージンを示し、中肋を示しています。主脈マージン軸：青破線。スケールバー= 1ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 小舌領域の一方の複製のためのレーザ顕微解剖組織のプーリングを示す > 漫画をtrong。 5〜6スライドから顕微解剖組織は、各反復のためにプールされています。各スライドから五メジアンセクションが使用され、2つの選択（赤い長方形）は、各セクションから作られます。各矩形は約2万平方 μmです。各反復のための組織は、別のチューブ（青楕円形）に回収されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6： 葉領域と 選択されたDE遺伝子の in situ ハイブリダイゼーション の間の一対比較のDE遺伝子の数 。間の一対比較のDE遺伝子の（A）数ブレード、小舌とシースの地域、すべての細胞層のLM。 （B）は、ブレード、小舌とシース領域の間の一対比較のDE遺伝子の数、唯一の向軸表皮のLM。 （C）in situハイブリダイゼーションLG1。 in situハイブリダイゼーション（D）NS1。 in situハイブリダイゼーション（E）GRMZM2G101682。 in situハイブリダイゼーション（F）ZmPIN1a。 DE：示差的に発現。 Lでアップ：最大Bにおける小舌でアップ、：ブレードでバックアップします。 Sでアップ：シースでバックアップします。 CF内の矢印は新興小舌を示しています。 F中の矢印は、血管組織における転写産物の蓄積を示しています。スケールバー=100μmです。この図は、参照6（植物生物学者の著作権協会）から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
トン= "図7" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 55004 / 55004fig7.jpg" />
図7： 選択されたDE遺伝子のためのデータのグラフ表示。図は、 表1およびin situハイブリダイゼーションの結果に示されるデータを示す図です。漫画は、葉原基を介して長手方向の断面を表します。ダークブルーは、特定の遺伝子のための転写産物の蓄積を示しています。緑、赤と青のボックスは、ブレード、小舌とシースのサンプルについて、顕微解剖のために選択した領域を示しています。左側の漫画は、すべての細胞層のLMを示しています。右側の漫画は、唯一の向軸表皮のLMを示しています。広告：向軸表皮、アブ：背軸表皮、CPM：百万あたりのカウントは、アスタリスクは、2つのドメイン間の有意差を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
"SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 55004 / 55004fig8.jpg "/>
図8： 漫画は架空のDE遺伝子の数を読んでどのように説明するには、顕微解剖のために選択された正確な地域によって異なります。 （A）小舌特異的発現による遺伝子。 （B）遺伝子は、小舌にし、血管組織で発現しました。 （C）遺伝子は、すべての細胞層ではなく、表皮におけるより高い発現と小舌の領域に特異的に発現しました。 （D）遺伝子は、小舌部位で発現、L2由来の細胞層のみ。漫画は、葉原基を介して長手方向の断面を表します。ダークブルーは、特定の遺伝子のための転写産物の蓄積を示しています。緑、赤と青のボックスは、ブレード、小舌とシースのサンプルについて、顕微解剖のために選択した領域を示しています。左側の漫画は、すべての細胞層のLMを示しています。右側の漫画は、唯一の向軸表皮のLMを示しています。広告：向軸表皮、アブ：背軸表皮、CPM：COU万人あたりNTS。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1：原始小舌でアップレギュレート選択された遺伝子。万人あたりのカウントは：BenjaminiおよびHochbergの方法に従って、偽発見率：百万総転写産物あたりのカウント数は、3つの複製、logFC =ログベース2倍の変化、FDR.BHの意味します。全ての層：すべての細胞層のLM。表皮：のみ向軸表皮のLM。この図は、参照6（植物生物学者の著作権協会）から変更されています。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
E 2 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 55004 / 55004tbl2.jpg "/>
表2：選択された遺伝子DE LG1-R 変異 体インチ万人あたりのカウントは：BenjaminiおよびHochbergの方法に従って、偽発見率：百万総転写産物あたりのカウント数は、3つの複製、logFC =ログベース2倍の変化、FDR.BHの意味します。この図は、参照6（植物生物学者の著作権協会）から変更されています。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
実験計画は、RNA-seqの実験において重要な要因です。重要な考慮事項は、正確なドメイン（複数可）および発生段階（複数可）を分析するために、どのような比較が行われるです。出力は、典型的には2つ以上の条件との間でDEされている遺伝子のリストであるので、比較の観点から考えることが重要です。すべての実験と同様に、一度に1つの変数を変更することが重要です。例えば、比較すべきであると同じ条件下で増殖させ、異なる葉のドメイン、同じ年齢や発達段階の葉を、比較します。
これらの実験の目的は、具体的に上方または野生型の葉の原基の小舌の領域にダウンレギュレートされる遺伝子を同定するために、野生型と比較してLG1-R変異体においてDEである遺伝子を同定することでした。私たちは、第1の現像葉原基の形態とLG1転写産物の蓄積のパターンを研究しました。これらの形態学的および分子のランドマークワットEREは、LM 14、15、16のための正確なドメインを選択するために使用されます。最初の実験では、小舌領域での転写産物の蓄積は、このように成長条件、遺伝的背景、発達段階、および植物ツープラント変動による差異をなくす、同じ葉原基の他の地域と比較しました。野生型と変異型を比較するために、どこで、いつ、目的の遺伝子が発現されるかを決定する必要があります。我々は、いずれかによって、in situハイブリダイゼーションまたは免疫学的に発現パターンを解析し、遺伝子発現のドメインを包含し、LMのための領域を選択することをお勧めします。同等のドメインが比較され、遺伝的背景は、変異体および野生型の両方で同じであることをされていることが重要です。
SU場合microdissectionsの精度は、関心のある領域に特異的に発現される遺伝子のための読み取り数をチェックすることによって確認することができますCH遺伝子が知られています。これは、配列決定のためのライブラリーを作製する前に、LM組織から抽出したRNAのRT-PCRを行うことによって行うことができます。ここに記載した実験では、LG1は小舌地域のLMの対照と、in situハイブリダイゼーション以来LG1式はPLBと新興小舌5、6に特異的であることを示していた分析。
そのような候補遺伝子（複数可）が既知でなければならないRT-qPCRのような方法とは異なり、RNA-配列は、所与の組織試料中の全ての転写物の蓄積を定量化します。従って、LM-RNA配列は、候補遺伝子を同定するための有用な方法です。この研究からの例ではGRMZM2G101682、印象的な小舌特異的な発現パターン（ 図6E）を持っている機能未知の遺伝子です。この研究はまた、先にLG1の下流の演技として関与していなかったbel14、などLG1-RにDE遺伝子を同定しました。 THIでsのインスタンス、（LG1-Rに野生型小舌領域とDEでアップレギュレート）複数のデータセットの比較は特に有益でした。遺伝子の発現パターンは、その機能を発揮しないことに留意することが重要である。その後の遺伝的および/または生化学的分析は、遺伝子機能を確立するために必要とされます。
差動ではっきりと簡単に描写されている小さな、離散発達ドメイン、に焦点を当てているトランスクリプトーム解析は、最も成功しています。 LMは、RNA配列は、このような分析のために適切な方法であり、多くの発達現象に適用される可能性を有しています。空間的発現パターン、または特定の構造の発達に影響を与える変異体が制限されている遺伝子の変異体において異なる遺伝子発現を同定するために特に適しています。それはまた、表皮または血管系などの特定および識別の細胞または組織で起こるプロセスに適用することができる、とに使用されていますトウモロコシのトランスクリプトーム解析頂端分裂組織（SAM）個体発生16を撮影。これは、遍在的に発現する遺伝子の機能を研究するか、全ての細胞において起こるプロセスにはあまり適切です。ここで紹介する方法は、正常植物種（トウモロコシ、 ソルガム 、Ocimum、 ハッカやキンギョソウ ）と構造（葉原基、分裂組織、根茎およびトリコーム）の様々に適用されています。
分析は、比較的大規模なドメインを含む場合、LMは必要ありません。実際、手切開または全臓器のRNA-、配列番号15は 、プラント14内のDE遺伝子を同定するために成功裏に使用されています。このアプローチは、より労働集約的であり、かつ組織学的技術との経験が必要とされないという利点を有します。しかし、手の解剖の精度には限界が手の解剖が早期Dの研究にあまり適していることを意味し、ありますevelopmentalプロセス。
成功LM RNA-seqが発達現象の分析のために、発育状況は十分に特徴付けされなければなりません。私たちは、実験を計画する前に、プロセスまたは対象のドメインの徹底的な組織学的検査を実施することをお勧めします。組織は未染色であり、被写界深度を提供するカバースリップでマウントされていないので、LMのための処理されたサンプルの組織学は、一般的に不良です。したがって、LMサンプルが（ 図1C、およびD）固定されているのと同時に、染色および観察のための別々の試料を固定するのに便利です。
LM材料から得られたRNAは、一般的に断片化され、総収量は8低いです。増幅工程は、ライブラリーの調製28のための十分なRNAを生成するために必要とされます。 RNA断片の長さが増幅後と前ライブラリー生成に評価されるべきです。 SEの平均断片長百veral塩基対は、一般的に500塩基対が優れており、良好であると考えられます。劣化によるRNアーゼへの汚染が発生した場合、またはパラフィンブロックが誤って保存されている場合、組織は、十分に固定されていない場合は悪いRNA収量が発生することがあります。非常に小さなドメインをmicrodissectingに多くの時間を捧げる前に、比較的大きな面積の試用LMを実施することにより固定した組織の品質をテストするために有用です。 LM細胞から得られたRNAを断片化し、オリゴdTプライマーを用いて増幅が強い3 'バイアスを導入し、この方法は、スプライス変異体などの代替の転写物を検出するのに適していない。ため小さなRNAを検出するのに適したLMです。
別の方法は、特定の組織又は細胞ドメインにおける転写産物の蓄積を（FACS）21蛍光活性化細胞選別によって分離された細胞のRNA-seqのされて定量化します。この方法は一般に、関心領域のための適切なマーカー遺伝子の同定を必要とします蛍光タグ化タンパク質とプロトプラストを発現するトランスジェニック植物の生成。マイクロアレイと結合FACSは、ルート22、23の細胞型特異的プロモーターを発現する細胞を分離することによりシロイヌナズナ根の発現マップを生成するために使用されています。シュート組織のFACSは、クロロフィルの自家蛍光24による根組織よりも困難です。 LMの制限は、目的のドメインが組織切片で識別可能でなければならないということです。 FACSは、適切なマーカー遺伝子が利用可能である場合には、より適切な方法でもよいです。細胞または組織を分離し、比較するかの選択は、いずれかのFACSまたはLMを使用するトランスクリプトーム解析で重要な考慮事項です。
ここに提示したデータは、LM（ 図3、 図8のために選択され、正確なドメインに応じて異なる結果が得られることを示します）。大きな組織のドメインを分析する際に、このようなNS1など、1つまたは少数の細胞で発現している遺伝子の転写産物は、希釈されます。全体の葉原基がサンプリングされた場合は、NS1転写物は検出されない可能性があります。 ZmPIN1aが大幅に刃と鞘表皮に比べて小舌にアップレギュレートされるが、すべての細胞層がサンプリングされている場合、この差は、血管の式によって混乱されます。表皮のみが（ 図8D）サンプリングされるとき逆に、唯一のL2由来の細胞層で発現している遺伝子は検出されません。この研究は、LM RNA-seqが形態形成の間に、遺伝子発現の差を検出するための強力なツールであるが、分析のために選択したドメインは、実験の成功に不可欠である、ことを示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
著者はコラボレーションを継続的かつ小舌開発について議論を刺激するためのS.メルルーサに感謝します。この作品は、国立科学財団助成MCB 1052051およびIOS-1848478によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 159220 | Used for RNase treatment of solutions |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| RNase Zap | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | RNase decontamination solution |
| Ethanol absolute 200 proof | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Acetic acid, glacial | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Glass vials - 22 ml | VWR | 470206-384 | |
| Xylenes, histological grade | Sigma-Aldrich | 534056-4L | |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | P3683-1KG | |
| Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | VWR | 15154-072 | |
| Embedding rings | VWR | 15154-303 | |
| Silica gel packets | Electron Microscopy Sciences | 71206-01 | Desiccant for storage of paraffin blocks |
| Oven | Fisher Scientific | 15-103-0503 | Oven must maintain temperature of 60 °C |
| Paraffin embedding station | Leica | EG1160 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Slide warmer | Electron Microscopy Sciences | 71317-10 | |
| Coplin jars | Electron Microscopy Sciences | 70316-02 | |
| Laser microdissector | Zeiss | ||
| KIMWIPES™ Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides |
| Membrane Slide 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9041-000 | Slides for laser microdissection |
| Adhesive Cap 200 opaque | Zeiss | 415190-9181-000 | Tubes for laser microdissection |
| PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 |
References
- Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
- Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
- Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
- Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
- Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
- Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
- Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).
- Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
- Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
- Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
- Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
- Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
- Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
- Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
- Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
- Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
- Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
- Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328 (2011).
- Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).
