El Método chip-exo: La identificación de las interacciones proteína-ADN con zona de Base Par de precisión
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) es una herramienta indispensable en el campo de la epigenética y la regulación de genes específicos que aísla las interacciones proteína-ADN. ChIP acoplado a la secuenciación de alto rendimiento de (ChIP-seq) se usa comúnmente para determinar la localización genómica de las proteínas que interactúan con la cromatina. Sin embargo, el chip-ss se ve obstaculizada por una resolución relativamente baja mapeo de varios cientos de pares de bases y alta señal de fondo. El método de chip-exo es una versión refinada de chip-ss que mejora sustancialmente cuando se produzca tanto la resolución y el ruido. La distinción clave de la metodología chip-exo es la incorporación de la digestión de exonucleasa lambda en el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca a la huella efectiva la izquierda y derecha 5 fronteras 'de ADN del sitio de entrecruzamiento de proteínas de ADN. Las bibliotecas de chip-exo se someten a secuenciación de alto rendimiento. Los datos resultantes se puede aprovechar para proporcionar una visión única y ultra-alta resolución en la organización funcional of genoma. A continuación, se describe el método de chip-exo que hemos optimizado y simplificado para los sistemas de mamíferos y de próxima generación de plataformas de secuenciación por síntesis.
Introduction
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es un método potente para estudiar los mecanismos de la regulación de genes por enriquecer selectivamente para fragmentos de ADN que interactúan con una proteína dada en las células vivas. Los métodos de detección de fragmentos de ADN chip enriquecida han evolucionado a medida que la tecnología mejora, desde la detección de un solo locus (estándar chip-qPCR) para la hibridación de microarrays de ADN (chip-chip) a secuenciación de alto rendimiento (chip-ss) 1. Aunque el chip-ss ha visto amplia aplicación, la heterogeneidad de la cromatina y las interacciones no específicas de ADN han obstaculizado calidad de los datos que conduce a falsos positivos y la cartografía imprecisa. Para sortear estas limitaciones, el Dr. Frank Pugh desarrolló el método de chip-exo 2. La característica sobresaliente de chip-exo es que incorpora un 5 'a 3' exonucleasa, footprinting efectivamente factor de transcripción sitios de unión. Como resultado, la metodología chip-exo logra una resolución más alta, mayor rango dinámico de detection, y un menor ruido de fondo.
Aunque el chip-exo es técnicamente más difícil de dominar que el chip-ss, que está siendo ampliamente adoptado como estudios apuntan a obtener una visión única de ultra alta resolución utilizando diversos sistemas biológicos 3-8. De hecho, el chip-exo se ha aplicado con éxito a bacterias, levaduras, ratón, rata, y los sistemas de células humanas. Como prueba de principio, chip-exo fue originalmente utilizado para identificar el motivo de unión precisa para un puñado de la transcripción de levadura Factores 2. La técnica también se utilizó en la levadura para estudiar la organización del complejo de pre-iniciación de la transcripción, y para descifrar estructura subnucleosomal de diversas histonas 9,10. Más recientemente, hemos aprovechado chip-exo para resolver TFIIB adyacente y Pol II promotores de eventos en humanos vinculante, y demostramos que surge de la transcripción divergente generalizada de los distintos complejos de iniciación 11.
El flujo de trabajo que aquí se presenta se optimiza y streamlined de mamíferos chip-exo (Figura 1). En primer lugar, las células vivas de cultivo primario o de tejidos se tratan con formaldehído para preservar en las interacciones proteína-ADN in vivo a través de una reticulación covalente. Las células se lisan y la cromatina esquiladas a ~ 100 – 500 pares de bases de tamaño de los fragmentos. ChIP entonces enriquece selectivamente fragmentos de ADN para reticular para la proteína de interés. En este punto, las bibliotecas ChIP-seq son típicamente preparados, lo que limita inherentemente la resolución de detección para el tamaño medio de fragmento de unos pocos cientos de pares de bases. Sin embargo, el chip-exo supera esta limitación por el recorte de la derecha 5 fronteras 'de ADN del sitio de entrecruzamiento de proteínas de ADN con exonucleasa lambda e izquierdo. bibliotecas de secuenciación entonces se construyen a partir de ADN digerido exonucleasa como se detalla a continuación. Los anidados 5 'fronteras resultantes representan una huella in vivo de la interacción proteína-ADN (Figura 1, paso 14), y se detectan mediante secuenciación de alto rendimiento. altHough la metodología chip-exo es más complicado que el chip-ss, las transiciones entre la mayoría de los pasos requiere el lavado del grano simple, lo que minimiza la pérdida de muestra y la variabilidad experimental. Es importante destacar que, desde el chip-exo es una versión refinada de chip-ss, cualquier muestra que tiene éxito con chip-ss también debe tener éxito con chip-exo.
La huella in vivo de las interacciones proteína-ADN con resultados chip-exo en una estructura de datos fundamentalmente distinto del chip-ss. A pesar de que las personas que llaman comunes chip-ss pueden aplicarse a los datos de chip-exo, para obtener las llamadas pico más precisas se recomienda la bioinformática herramientas diseñadas específicamente con la estructura única de datos chip-exo en mente. Estos incluyen Genex, GEM, MACE, Peakzilla, y ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un protocolo de genómica funcional para determinar la ubicación exacta de unión de la cromatina proteínas que interactúan de una manera imparcial, en todo el genoma a una resolución de pares de bases próximo. El paso más crítico para lograr la base cerca de una resolución de mapeo par es el tratamiento con exonucleasa de la ADN-chip enriquecido mientras que el inmunoprecipitado permanece en la resina magnética. Aparentemente, los complejos de proteínas potencialmente podrían bloquear la hu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
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