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Biology

Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/55016
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Abstract

Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) ist ein unverzichtbares Werkzeug in den Bereichen Epigenetik und Genregulation, die spezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen isoliert. ChIP gekoppelt Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird allgemein die genomische Lage von Proteinen zu bestimmen, die mit Chromatin in Wechselwirkung treten. Allerdings ChIP-seq wird durch eine relativ geringe Abbildungsauflösung von mehreren hundert Basenpaaren und hohen Hintergrundsignal behindert. Der Chip-exo-Methode ist eine verfeinerte Version von ChIP-seq, die auf sowohl Auflösung und Rauschen wesentlich verbessert. Der Hauptunterschied der ChIP-exo-Methodik ist die Einarbeitung von lambda-Exonuclease-Verdauung in der Bibliothek Vorbereitungsarbeitsablauf, um effektiv die linke Standfläche und rechts 5 'DNA-Grenzen des Protein-DNA-Vernetzungsstelle. Der Chip-exo-Bibliotheken werden dann einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Die resultierenden Daten können genutzt werden, um eine einzigartige und extrem hochauflösende Einblicke in die funktionelle Organisation of das Genom. Hier beschreiben wir die ChIP-exo-Methode, die wir optimiert und rationalisiert für Säugetier-Systeme der nächsten Generation Sequenzierung-durch-Synthese-Plattform.

Introduction

Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) ist eine leistungsfähige Methode Mechanismen der Genregulation zu untersuchen, indem selektiv für die DNA-Fragmente zu bereichern, die in lebenden Zellen mit einem bestimmten Protein in Wechselwirkung treten. Nachweisverfahren von ChIP angereicherte DNA - Fragmente haben sich weiterentwickelt , wie die Technologie verbessert, von der Erfassung eines einzelnen Locus (Standard ChIP-qPCR) zur Hybridisierung an Oligonukleotid - Mikroarrays (ChIP-Chip) auf Hochdurchsatz - Sequenzierung (ChIP-seq) 1. Obwohl ChIP-seq weit verbreitete Anwendung, Chromatin Heterogenität und unspezifischer DNA-Wechselwirkungen Datenqualität gesehen haben, was zu falsch-positive erschwert und ungenau Mapping. Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelte Dr. Frank Pugh dem Chip-exo - Methode 2. Das hervorstechendste Merkmal von ChIP-exo ist, dass es eine 5 'zu 3' Exonuklease enthält, effektiv Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen Footprinting. Im Ergebnis erreicht der Chip-exo-Methodik höhere Auflösung, größeren Dynamikbereich von detection und unteren Hintergrundgeräusche.

Obwohl ChIP-exo technisch schwer zu meistern ist als ChIP-seq ist es weithin angenommen wird , wie Studien einzigartige , ultrahochauflösende Einblicke mit verschiedenen biologischen Systemen 3-8 gewinnen wollen. Tatsächlich ChIP-exo wurde auf Bakterien, Hefe, Maus, Ratte und menschlichen Zellsysteme erfolgreich eingesetzt. Als Beweis für das Prinzip wurde ChIP-exo ursprünglich verwendet , um die genaue Bindungsmotiv für eine Handvoll von Hefe - Transkriptions zu identifizieren 2 Faktoren ab . Die Technik wurde auch in Hefe verwendet , um die Organisation des Transkriptions Präinitiationskomplex zu studieren, und subnucleosomal Struktur verschiedener Histone 9,10 zu dechiffrieren. In jüngerer Zeit, Leveraged wir ChIP-exo benachbarten TFIIB und Pol II an menschlichen Promotoren Bindungsereignisse zu lösen, und zeigte , dass weit verbreitete divergente Transkription entsteht aus verschiedenen Initiations 11 - Komplexe.

Der Workflow hier präsentiert wird optimiert und streamlined für Säugetier ChIP-exo (Abbildung 1). Erstens leben primäre oder Gewebekulturzellen mit Formaldehyd behandelt in vivo Protein-DNA - Wechselwirkungen durch eine kovalente Vernetzungs zu erhalten. Die Zellen werden lysiert und Chromatin abgeschert ~ 100-500 Basenpaar Größe Fragmente. ChIP dann reichert selektiv für DNA an das Protein von Interesse vernetzt Fragmente. An diesem Punkt ChIP-seq-Bibliotheken werden typischerweise hergestellt, die von Natur aus begrenzt die Detektionsauflösung auf die durchschnittliche Fragmentgröße von wenigen hundert Basenpaaren. Jedoch ChIP-exo überwindet diese Einschränkung durch die linken und rechten 5'-DNA Grenzen der Protein-DNA-Vernetzungsstelle mit Lambda-Exonuklease Trimmen. Sequencing Bibliotheken werden dann aus Exonuklease verdaut DNA konstruiert, wie unten beschrieben. Die resultierenden verschachtelten 5 'Grenzen stellen eine in vivo Footprint des Protein-DNA - Interaktion (Abbildung 1, Schritt 14) und werden durch Hochdurchsatz - Sequenzierung nachgewiesen. Although der Chip-exo-Methodik mehr beteiligt als ChIP-seq ist, Übergänge zwischen den meisten Schritten erfordert einfache Perle Waschen, die Probenverlust und experimentelle Variabilität minimiert. Wichtig ist, dass da ChIP-exo ist eine verfeinerte Version von ChIP-seq, jede Probe, die mit ChIP-seq sollte auch erfolgreich sein, mit ChIP-exo erfolgreich ist.

Die in - vivo - Fußabdrucks von Protein-DNA - Wechselwirkungen mit ChIP-exo Ergebnisse in einer grundlegend unterschiedliche Datenstruktur von ChIP-seq. Obwohl häufig vorkommend ChIP-seq Anrufern ChIP-exo-Daten angewendet werden kann, die präzisesten Spitzen Anrufe zu erhalten, empfehlen wir die Bioinformatik Tools, die speziell mit der einzigartigen Struktur von ChIP-exo-Daten im Auge behalten. Dazu gehören Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla und ExoProfiler 12-15.

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Protocol

Hinweis: Doppelt destilliertes H 2 O oder UPW Äquivalent für alle Puffer und Reaktionen Mischungen empfohlen.

Tag 0: Materialvorbereitung und Zellernte

1. Puffer Vorbereitung

  1. Bereiten Sie Lysepuffern 1-3 (Tabellen 1 - 3) und mit 100 & mgr; l vollständige Protease - Inhibitor Lager (CPI) auf 50 ml jeder Puffer unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten CPI Lager durch Auflösen einer Tablette in 1 ml UPW H 2 O.
  2. Bereiten Sie ChIP Puffer (Tabellen 4 - 7). 100 l CPI Lager zu 50 ml Blocking und RIPA-Puffer. Nicht CPI Tris und ChIP Elutionspuffer hinzufügen.

2. Ausglühen Adapter Oligonucleotides

Hinweis: Spezifische Oligonukleotid-Sequenzen können in Abschnitt Zusätzliche Informationen zu finden.

  1. Bereiten Sie Adapter Ausglühen Mischungen (Tabellen 8 - 9). Vortex mischen und kurzSpin-Röhren Inhalt zu sammeln. Aliquot 100 ul jeder Mischung in 0,5-ml-Röhrchen.
  2. Hybridisieren die Oligonukleotide durch das Programm (Tabelle 10) in dem Thermocycler ausgeführt wird .
    Store annelierten Oligonucleotiden bei -80 ° C.

3. In - vivo - Chromatin Crosslinking mit Formaldehyd

HINWEIS: Für einen typischen ChIP Experiment Ausgangsmaterial sollte etwa 50 Millionen Zellen enthalten.

  1. Fügen Sie frisches 37% Methanol-freies Formaldehyd-Stammlösung zu gepufferte Salzlösung Phosphat (PBS) gewaschen Zellkultur bis zu einer Endkonzentration von 1% (v / v), gründlich mischen, und lassen Sie sich für 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
    HINWEIS: Zum Beispiel, wir in der Regel addieren 1,4 ml 37% iges methanolfreies Formaldehyd zu Zellen in 50 ml PBS Raumtemperatur. Auch vermeiden Formaldehyd in Medien Vernetzungs da Proteine ​​in dem Medium wird ein Teil des Formaldehyds quenchen.
  2. Quench Vernetzungsreaktion durch Zugabe von 2,5 M Glycine für eine Endkonzentration von 125 mM. Gründlich durchmischen.
  3. Übertragen Zellen zu 50 ml Röhrchen auf Eis. Spin-Zellen 5 min bei 1000 × g bei 4 ° C. Überstand dekantieren.
  4. 1 ml eiskaltem 1x PBS auf Zellpellet resuspendieren durch Pipettieren. Transfer zum 1,5-ml-Röhrchen.
  5. Spin-Zellen für 3 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Überstand entfernen.
  6. blinken sofort Zellpellets in 1,5-ml-Röhrchen mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Bei -80 ° C. Vernetzte Zellen sind unbegrenzt stabil bei -80 ° C.

Tag 1: Zelllyse, Ultraschall-Behandlung, und ChIP

4. Zellyse

HINWEIS: Bei allen Zelllyse Abschnitte müssen die Proben auf Eis oder bei 4 ° C gehalten werden, vernetzen Umkehr zu minimieren.

  1. Kurz auftauen vernetzte Zellpellet. Gründlich resuspendieren jedes Pellet in 0,5 ml Lysis Buffer 1 und verbinden sich mit 4,5 ml Lysis-Puffer 1 in einem 15 ml Polystyrol-Röhrchen.
  2. Rock Röhrchen für 10 min bei 4 ° Cfür auf einer Schwingplattform. Spin für 4 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Überstand dekantieren.
  3. Gründlich resuspendieren jedes Pellet in 0,5 ml Lysispuffer 2 und fügen Sie 4,5 ml Lysispuffer 2 einmal suspendiert.
  4. Schaukeln für 5 min bei 4 ° C auf einem Schüttler. Spin für 5 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Dekantieren Überstand und klopfen Sie leicht Überschuss auf Papiertuch.
  5. Gründlich resuspendieren jedes Pellet in 0,5 ml Lysispuffer 3 und 1 ml Lysepuffer 3 einmal suspendiert. Halten Kern Lysaten auf Eis und sofort Beschallung gehen.

5. Ultraschall-Behandlung von Kern Lysate

HINWEIS: Bei allen Beschallungs Abschnitte müssen die Proben auf Eis gehalten werden, vernetzen Umkehrung zu minimieren. Das spezifische Modell der Beschallungsgerät in Verbindung mit dem verwendeten Protokoll unten kann in der Tabelle der Materialien gefunden werden. Einzelheiten über konkrete Beschallungsgerät Nutzung und Richtlinien für andere Instrumente können in Abschnitt Zusätzliche Informationen zu finden.

  1. PlAss Resonanz Adapter in 15 ml Polystyrolröhrchen Kernextrakten (die Metallstange sollte die Wand der Röhre nicht berühren).
  2. Beschallen Kern Lysate in einem eiskalten Wasserbad für 2 x 15 min Sitzungen mit 30 sec / 30 sec OFF bei mittlerer Leistung. Nur beschallen zwei 15-ml-Röhrchen zu einem Zeitpunkt. Diese Einstellungen arbeiten auf einem breiten Spektrum von Zelllinien und Primärzelltypen, aber weitere Optimierung kann erforderlich sein, wenn das Chromatin Scher unvollständig ist.
  3. Beschallungsergebnisse, den Transfer 2 x 10 & mgr; l-Proben von Lysat in 1,5-ml-Röhrchen zu überprüfen.
    1. Um Vernetzungen umkehren, kombinieren, um die ersten 10-ul-Aliquot mit 10 & mgr; l TE-RNase A und 0,2 ul Proteinase K bei 37 ° C für 30 min. In 4 ul 6x Xylol DNA-Farbstoff.
    2. Zur Erhaltung Vernetzungen, kombinieren die zweite 10-ul-Aliquot mit 2 ul 6x Xylol DNA-Farbstoff.
    3. Führen beide Proben auf einem 1,5% Agarosegel bei 140 V für etwa 30 - 45 min, bis der Bromphenol-Farbstoff in der Leiter i¾ der Weg nach unten das Gel.
  4. Wenn Beschallen erfolgreich war (die meisten DNA und 100 abgeschert fragments - 500 bp), Transfer beschallt Lysate bis 2-ml-Röhrchen, enthaltend 150 ul 10% Triton X-100. Vortex mischen.
  5. Zu pelletieren unlösliches Chromatin und Schutt, Spin beschallt Kern Lysat für 10 min bei 20.000 × g bei 4 ° C.
  6. Überstand in ein neues 2-ml-Tube. Fahren Sie direkt mit Chip- oder Lagerung von Proben bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit. Beschallt Extrakte sollten nicht mehr eingefroren und wieder aufgetaut werden, als einmal.

6. Kupplung Antikörper gegen Beads

HINWEIS: Niemals Wirbel oder Frost / Tau-magnetische Kügelchen, da sie zerspringen und Hintergrundsignal zu erhöhen.

  1. Nach gründlichem Mischen Lager, aliquoten Y ul Kügelchenaufschlämmung in 1,5-ml-Röhrchen, wobei Y = 1,1 x 2,5 ul x (Anzahl der Chip-Proben). Bindungskapazität für 2,5 ul Kügelchenaufschlämmung ist bis zu 13 & mgr; g IgG. Waschen Sie gepoolt Perlen 3x mit 1 ml BlockingPuffer.
  2. Für konsistentere Aliquotierung von Perlen nach Wäschen, resuspendieren Perlen in 10x ursprünglichen Schlammes Volumen (25 ul / Chip) mit Blocking-Puffer. Aliquot 25 ul pro Chip Probe in 1,5-ml-Röhrchen.
  3. In 5-10 ug Antikörper zu aliquote Menge von resuspendieren Perlen entspricht. Bringen endgültige Volumen von bis zu 250 & mgr; l mit Blockierungspuffer. Inkubieren Proben für 4 Stunden (alternativ über Nacht 16 h) auf einer rotierenden Plattform bei 4 ° C.
  4. Überstand entfernen. Um ungebundene oder überschüssige Antikörper zu entfernen, waschen Perlen einmal mit 1 ml Blockierungspuffer.
  5. Nach dem letzten Wasch Absaugen, fügen Sie sofort 50 Millionen Zelläquivalente von beschallten Extrakte (~ 1,6 ml) auf Antikörper: Perle-Konjugate. Wenn beschallten Extrakte nicht bereit sind, resuspendieren Perlen in 100 & mgr; l Blockierungspuffer, bis sie bereit sind. Es ist wichtig, niemals die Perlen trocknen lassen.

7. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)

  1. Für jeden Chip Probe kombinieren 1,5 ml beschallted Extrakte mit Antikörper: Perle-Konjugate in 1,5 ml oder 2 ml-Röhrchen.
  2. Röhrchen auf einem Mini-Rohr-Rotator über Nacht (etwa 16 Stunden) bei Geschwindigkeitseinstellung von 9 bei 4 ° C. Überprüfen Sie nach ein paar min Proben, um sicherzustellen, sind nicht undicht und mischen richtig.

Tag 2: ChIP Wäscht und On-Harz enzymatischer Reaktionen

8. ChIP Wäscht

HINWEIS: Kreuzkontamination zu minimieren, kurz drehen Röhren zwischen jedem Waschen. Für die erste Bestrebung, ändern Spitzen zwischen jeder Probe. Bei der anschließenden Wäschen kann die gleiche Spitze so lange verwendet werden, da es nicht die Perlen berührt hat. Siehe Weitere Informationen Abschnitt nach dem Weg zur richtigen ChIP Waschen.

  1. Sehr kurz Rohre Spin einer Mikrozentrifuge (~ 3 sec bei 500 xg) unter Verwendung von Flüssigkeit, die in Kapseln zu sammeln und für 1 min auf dem magnetischen Gestell schalten. Während noch auf dem Magnetträger, aspirieren Extrakt.
  2. Hinzufügen 0,75 ml RIPA-Puffer zu jedem Röhrchen. Entfernen Sie Rohre aus magnetischen Rackund mehrmals umdrehen zu mischen. Ersetzen Sie Rohre auf Magnet Rack und absaugen Überstand. Wiederholen Sie 7x.
  3. Hinzufügen 0,75 ml 10 mM Tris HCl (pH 7,5) zu jedem Röhrchen. Entfernen Sie Rohre aus magnetischen Rack und mehrmals umdrehen zu mischen. Ersetzen Sie Rohre auf Magnet Rack und absaugen Überstand. Repeat 2x.
  4. Nach dem Absaugen letzten Wäsche, gehen Sie zu Polieren.
    Hinweis: Nach jeder Inkubation Reaktion in den Abschnitten 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 und 15.3, Spin-Röhrchen kurz und Platz gegen Magnetträger für 1 min und absaugen Überstand. Waschen Sie 2x mit 0,75 ml RIPA-Puffer und 2x mit 0,75 ml Tris-HCl (pH 7,5).

9. Polieren Reaction

  1. Füllen Sie Polier Master - Mix Berechnungen (Tabelle 11). Machen Sie in 1,5 ml Röhrchen auf Eis Poliermischung. Pipettieren zu mischen.
  2. Unmittelbar nach dem letzten Wasch ChIP angesaugt wird, werden 50 & mgr; l jeder Probe Harz während immer noch auf dem magnetischen Gestell Poliermischung. Inkubiere die Proben für 30 min bei 3 xgbei 30 ° C in einem Thermomixer.
  3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu A-Tailing gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

10. A-Tailing-Reaktion

  1. Füllen Sie A-Tailing Master Mix Berechnungen (Tabelle 12). Make A-Tailing-Mix in einem 1,5-ml-Röhrchen auf Eis. Pipettieren zu mischen.
  2. Unmittelbar nach Abschnitt Polieren, werden 50 & mgr; l der A-Tailing-Mix Harz zu jeder Probe, während immer noch auf dem Magnet Rack. Inkubieren Proben für 30 min bei 3 × g bei 37 ° C in einem Thermomixer.
  3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu P7 Adaptorligation gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

11. P7 Adaptorligation Reaction

  1. Füllen Sie Ligatur Master - Mix Berechnungen (Tabelle 13). Machen Sie Ligatur in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipette zu mischen.
  2. Unmittelbar nach dem Abschnitt A-Tailing, fügen Sie 48 ul P7 Ligatur Master-Mix und 2 ul eines anderen Adapter Index to Jede Probe Harz während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 2 Stunden bei 3 · g bei 25 ° C in einem Thermomixer.
    Anmerkung: Die Verwendung unterschiedlicher Indizes für jede Probe ermöglicht, mehrere Proben in einer einzelnen Strömungszelle sequenziert werden.
  3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu Φ-29 Nick Repair gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

12. Phi-29 Nick Repair Reaction

  1. Füllen Sie Φ-29 Master - Mix Berechnungen (Tabelle 14). Machen Φ-29-Mix in 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Pipettieren zu mischen.
  2. Unmittelbar nach P7 Ligierung Abschnitt fügen 50 ul Φ-29 Mischung zu jeder Probe Harz während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 20 min bei 3 × g bei 30 ° C in einem Thermomixer.
  3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu Kinase-Reaktion gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

13. Kinase-Reaktions

  1. Füllen Sie Kinase Master-Mix Berechnungen (
  2. Unmittelbar nach Φ-29 Abschnitt fügen 50 ul Kinase zu jeder Probe Harz mischen, während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 20 min bei 3 × g bei 37 ° C in einem Thermomixer.
  3. Nach dem Absaugen letzten Waschen wie zu Lambda Exonukleasereaktion gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

14. Lambda Exonuclease Reaction

  1. Füllen Sie Lambda Exonuclease Master - Mix Berechnungen (Tabelle 16). Machen Lambda Exonuclease in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipettieren zu mischen.
  2. Unmittelbar nach Abschnitt Kinase, fügen 50 ul Lambda Exonuclease zu jeder Probe Harz mischen, während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 30 min bei 3 × g bei 37 ° C in einem Thermomixer.
  3. Nach dem Absaugen letzten Waschen wie zu RecJ f Reaktion gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

15. RecJ fNukleasereaktion

  1. Füllen Sie RecJ f Master - Mix Berechnungen (Tabelle 17). Machen Sie RecJ f Mix in 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Pipettieren zu mischen.
  2. Unmittelbar nach Lambda Exonuclease Abschnitt fügen 50 ul RecJ f mix Harz zu jeder Probe , während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 30 min bei 3 × g bei 37 ° C in einem Thermomixer.
  3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu ChIP Elution gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

16. Elution und Cross Reversal

  1. Vorbereitung Master Mix: Anzahl der Abtastwerte x 1,1 x (200 ul ChIP Elutionspuffer + 1 & mgr; l 20 mg / ml Proteinase K) in 1,5 ml Röhrchen. In 200 ul ChIP Elutionspuffer + Proteinase K Master-Mix zu jeder Probe Harz.
  2. Inkubieren Proben über Nacht (etwa 16 Stunden) bei 3 × g bei 65 ° C in einem Thermomixer mit einem beheizten Deckel Kondensation zu vermeiden.

Tag 3: DNA-ExtraktIon und Adaptorligation

17. Elution und Cross Reversal (Fortsetzung)

  1. Nach Inkubation über Nacht bei 65 ° C, Spin kurz Proben Kondensat zu sammeln. Prüfmuster auf Magnetträger für 1 min.
  2. Transfer 200 & mgr; l Überstand in neue 1,5 ml-Röhrchen, enthaltend 200 & mgr; l TE-Puffer (pH 7,5).

18. Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCIAA) Extraktion

  1. In 400 ul Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu jeder Probe. Vortex für 20 Sekunden zu mischen.
  2. Zentrifuge für 10 min bei 20.000 xg bei Raumtemperatur (RT). Transfer vorsichtig 325 ul der oberen wässrigen Schicht in ein frisches Röhrchen.
    Hinweis: Achten Sie darauf, dass keine der organischen (untere Schicht) zu übertragen in die neue Röhre.
  3. Hinzufügen 1/10 Volumen 3 M NaOAc (pH 5,5) und 1 ul 20 mg / ml Glykogen auf jede Probe. Bei mehreren Proben, bereiten einen Master-Mix.
  4. Hinzufügen 3 Volumen eiskaltem 100% igem Ethanol zu jeder Probe. Wirbelmischen. Inkubieren für 15 min bei -80 ° C.
  5. Zentrifuge für 15 Minuten bei 20.000 × g bei 4 ° C. umfüllen Überstand vorsichtig und achten Sie darauf, um nicht das Pellet stören.
  6. fügen Sie vorsichtig 500 ul frisch eiskaltem 70% Ethanol hergestellt, um sicherzustellen, um nicht das Pellet stören. Zentrifuge für 5 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Vorsichtig dekantieren Überstand.
  7. Trocknen des Pellets für ca. 20 min (oder bis es trocken ist) in einer Geschwindigkeit Vakuum bei 45 ° C.
    Hinweis: Dies ist eine Pause Punkt im Protokoll. Trockene DNA-Pellets können bei -20 ° C gelagert werden.
  8. Resuspendieren Pellets in 10 & mgr; l ddH 2 O. Pipettieren wiederholt über den Bereich , wo die DNA pelletiert, obwohl das getrocknete Pellet nicht gesehen werden kann.
  9. Übertragen Sie 10 ul jeder Probe in ein frisches 0,3 ml PCR-Röhrchen oder 8-Rack, je nach Anzahl der Proben.

19. P7 Primer-Verlängerungsreaktion

  1. Füllen Sie P7 Primer Erweiterung Master - Mix Berechnungen (Tabelle 18). Make-Erweiterung in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipettieren zu mischen.
  2. In 10 ul Extension Mix (minus Φ-29-Polymerase) zu je 10 & mgr; l Probe. Pipettieren zu mischen.
  3. Führen Proben im Thermocycler mit dem Programm (Tabelle 19) zu tempern Primers an die Matrize bis zum 30c "halten" Schritt.
  4. 1 & mgr; l Φ-29-Polymerase während der 30 ˚C "halten" Schritt im Programm. Pipettieren zu mischen. Fortsetzen der Rest des Programms (Tabelle 19).

20. A-Tailing-Reaktion

  1. Füllen Sie A-Tailing Master Mix Berechnungen (Tabelle 20). Make A-Tailing-Mix in einem 1,5-ml-Röhrchen auf Eis. Pipettieren zu mischen.
  2. In 10 ul des A-Tailing-Mix zu jeder Probe. Pipettieren zu mischen.
  3. In der Thermocycler, Inkubation Proben für 30 Minuten bei 37 ° C und dann für 20 min bei 75 ° C inaktivieren Wärme.

21. P5 Adaptorligation Reaktion

  1. Fill aus P5 Adaptorligation Master - Mix Berechnungen (Tabelle 21). Machen Sie Ligatur in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipettieren zu mischen.
  2. In 20 ul P5 Ligatur zu jeder Probe mischen. Pipettieren zu mischen.
  3. In der Thermocycler, Inkubation Proben für 2 Stunden bei 25 ° C.

22. Bead Aufräum

Hinweis: Bitte beachten Sie Abschnitt Materialien für Hersteller Details zu Wulst aufzuräumen.

  1. Bringen Sie jede 50 ul Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
  2. aufzuräumen resuspendieren Perlen auf einem Mini-Rohr Rotator bei Geschwindigkeitseinstellung von 15 für 15 min bei RT. Lassen Sie sich nicht Perlen vor dem Pipettieren begleichen.
  3. In 60 ul aufzuräumen Perlen auf Probe (1,2: 1 aufzuräumen Perlen Verhältnis zur Probe ist entscheidend DNA zu entfernen, die kürzer als 200 Basenpaare ist). Pipettieren für 20 Sekunden zu mischen.
  4. aufzuräumen resuspendieren Perlen auf einem Mini-Rohr Rotator bei Geschwindigkeitseinstellung von 15 für 3 min bei RT. Kurz Spin Röhren.
  5. Die Röhrchen auf dem Magnetträger für 1 min.Pipettieren aus und den Überstand verwerfen.
    HINWEIS: NICHT Vakuumaspiration in diesem Abschnitt verwendet werden, da es die Clean-up-Perlen saugen.
  6. In 400 ul frisch hergestellt RT 70% Ethanol zu jeder Probe, während sie auf magnetische Rack sind. Nicht vermischen. Überstand entfernen. Repeat 2x.
  7. Trocknen Sie die Clean-up-Perlen für 10 min bei RT. Die Farbe der Perlen werden dunkel bis hellbraun und sehr kleine Risse in der Harz-Pellet sichtbar sein, wenn Perlen trocken sind.
  8. Zum Eluieren DNA, dann werden 40 & mgr; l 10 mM Tris (pH 7,5). Gründlich pipettieren für 20 Sekunden zu mischen.
  9. Legen Sie die Proben auf dem Magnetträger für 1 min. pipettieren Langsam und übertragen direkt 36 ul Eluat bis 0,3 ml PCR-Röhrchen.
  10. Direkt in die PCR-Reaktion oder zu speichern Eluaten bei -20 ° C.

Tag 4: PCR und Gel-Analyse

23. PCR

  1. Füllen Sie PCR - Master - Mix Berechnungen (Tabelle 22). Machen Sie PCR-Mix. Pipettieren sehr sanft zu vermeiden, mischenBlasen.
  2. In 14 ul PCR zu jeder 36 & mgr; l DNA-Probe zu mischen. Pipettieren zu mischen. Halten Sie die Proben auf Eis, bis sie bereit in Thermocycler zu setzen.
  3. Für die positive PCR-Kontrolle umfassen eine zuvor vorbereitete Bibliothek. Für die negative PCR-Kontrolle umfassen Wasser. Führen Proben im Thermocycler unter Verwendung von PCR - Programm (Tabelle 23).

24. Gel Vorbereitung, DNA Excision und Visualisierung

  1. Gründlich reinigen und spülen Sie eine geeignete Größe Gel-Box mit entsalztem Wasser. Bereiten Sie eine 1,5% Agarose-Gel (enthaltend 0,5 mg / ml Ethidiumbromid) mit dicken, breiten gut kämmen, die 60 & mgr; l aufnehmen kann.
    HINWEIS: Ethidiumbromid (EtBr) ist ein Karzinogen und müssen mit Vorsicht behandelt werden.
  2. Spin down PCR Probenröhrchen kurz Kondensation zu sammeln.
  3. In 1/5 Volumen 6x Xylol DNA Farbstoff kombiniert Probe. Nicht Bromphenolblau in DNA-Farbstoff verwendet werden, da es an der gleichen Stelle wie die Probe DNA wandert.
  4. Laden gesamte Probe into jede Vertiefung, vorzugsweise mit leeren Brunnen in zwischen den Proben.
    Anmerkung: Die Bibliotheken mit den gleichen Indizes müssen nicht im selben Gel laufen gelassen werden.
  5. Last 7 & mgr; l 100 bp Leiter auf beiden Seiten der Proben. Führen Gel bei 140 V ca. 30-45 min für bis Bromphenol Farbstoff in Leiter ist ¾ Weg nach unten das Gel.
  6. Bild und Visualisierung von Gel auf einem Durchleuchtungs bei einer niedrigen UV-Einstellung. Auszuschneiden die Abschnitte aus Agarose enthaltenden DNA-Fragmente von 200 bis 500 bp. Seien Sie sehr vorsichtig Ausschneiden Adapter Dimerenbande zu vermeiden, die bei 125 bp läuft.
  7. Legen Sie jedes ausgeschnittenen Gelstück in einen 15-ml-Tube. Nehmen Nettogewicht jeder Gelschnitte. Schreiben Sie dieses Gewicht direkt auf dem Rohr.
  8. Bild, speichern und mit Anmerkungen versehen excised Gel richtige Größenbereich ausgewählt, um zu bestätigen.

25. Gel Purification

  1. Reinige DNA von exzidierten Gelstück entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen.
  2. Man löst das Gelstück durch Schaukelnbei RT auf der Plattform zu schaukeln. Es dauert ungefähr 20 Minuten aufzulösen nehmen.
  3. Um hochgereinigte DNA zu erhalten, waschen Säulen mit 0,5 ml Puffer QG nach gelösten Gel wurde durch die Säule geleitet.
  4. Nach Puffer PE waschen, lassen Sie Spalten für 2 bei RT sitzen - 5 min. Spin für 1 min bei 13.000 × g bei RT.
  5. Damit Raum für die PCR-Reaktion Master-Mix, elute Proben mit 40 ul EB-Puffer in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen.

26. DNA-Quantifizierung

  1. Vorbereiten Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 24). Messen Proben in bestimmten Instrument mit optischen Röhren.
  2. Sobald ChIP-exo - Bibliotheken quantifiziert werden, reichen für die Sequenzierung auf einer Plattform , die Sequenzierung-durch-Synthese verwendet Chemie 16 , die mit DNA - Adapter in diesem Protokoll kompatibel ist.
    HINWEIS: In der Regel 2 ul Probe ist ausreichend für die Quantifizierung, aber mehr können erforderlich sein, wenn die Probenkonzentration niedriger ist. DNA ergibt typischely Bereich zwischen 50 und 200 ng.
  3. Nach Quantifizierung Proben bei -20 ° C.

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Representative Results

Die folgenden Abbildungen zeigen repräsentative Ergebnisse aus dem Chip-exo-Protokoll hier vorgestellt. Im Gegensatz zu herkömmlichen ChIP-seq Methodologien mit wenigen enzymatischen Schritten, ChIP-exo erfordert elf sequentiell abhängigen enzymatischen Reaktionen (Abbildung 1). Somit muss darauf geachtet werden bei jedem Schritt unternommen werden, um sicherzustellen, dass jede Reaktionskomponente seiner jeweiligen Reaktions Mastermix zugesetzt wird. Wir empfehlen, eine formelhafte Tabellen Erzeugen von den Reaktions Tabellen basierend automatisch die Reaktions Mastermix Berechnungen durchzuführen, die sich daraus ergebenden Tabellen drucken, und dann jedes Element Abhaken, nachdem er dem Master-Mix hinzugefügt wird.

Wir beschäftigen eine Reihe von Maßnahmen zur Qualitätskontrolle während des gesamten Protokoll hoher Qualität Sequenzierungsergebnisse (Abbildung 2) zu gewährleisten. Jeder Chip Reaktion enthält drei grundlegende Komponenten: 1) beschallt Chromatin Extrakt aus Zellen von interest, 2) ein Antikörper gegen das Protein von Interesse gerichtet ist, und 3) ProteinG (oder ProteinA) Harz, das die Immunkomplexe präzipitiert zu immobilisieren. Hohe Qualität beschallt Gewinnung von Chromatin - Extrakte (2A) kann ziemlich schwierig sein , da Beschallungsbedingungen für jeden Zelltyp und Beschallungs Instrument optimiert werden müssen. Es ist viel Zeit lohnt sich, diesen Schritt zu optimieren , da die höchste Qualität Bibliotheken mit einem Beschallungs Ergebnis starten , die DNA - Fragmente zwischen 100 ergibt - 500 bp (2A, "+" Spur). Da Formaldehyd Vernetzungen labil sind und Formaldehyd selbst hat eine begrenzte Haltbarkeit, verwenden wir eine elektrophoretische Mobilitäts - Shift - Assays (2A, "-" Spur) , um sicherzustellen , dass die beschallten Extrakte intakte Protein-DNA - Vernetzungen, offensichtlich als Super-Shift enthalten von die DNA-Fragmente. Um zu beurteilen, Hintergrundsignal routinemäßig führen wir eine "mock" -Chip, die Antikörper aus der ChIP Reaktion lässt. Eine hohe Qualität ChIP-exo Bibliothek Vorbereitung wird sehr wenig, wenn überhaupt, Hintergrundsignal in der "mock" -Chip ( "-") in Bezug auf die spezifischen ChIP Antikörper, in diesem Fall gegen Pol II gerichtet. Wie in 2B zu sehen ist , traditionelle ChIP-seq Bibliotheken haben wesentlich mehr Hintergrundsignal als ChIP-exo. Schließlich wird vor der Sequenzierung, ChIP-exo - Bibliothek Qualität auf dem Bioanalyzer (2C - D) beurteilt. Analyse misst genau die Bibliothek Größenverteilung und erkennt verunreinigen Adapter Dimere (bezeichnet mit Pfeil), die bei 125 bp laufen. Wenn Adapter Dimere vorhanden sind, werden sie die Sequenzierung Bandbreite reduzieren. Daher empfehlen wir eine zusätzliche Perle Bereinigung, die effizient entfernen werden DNA-Fragmente von weniger als 200 bp.

ChIP-exo ist eine leistungsfähige funktionelle Genom Technik, weil es die einzige Methode der Lage, ortsauflösenden divergent, initiiert, machte eine Pause und verlängernden RNA-Polymerase II ona genomweiten Skala (Abbildung 3) 11. Da diese benachbarten Bindungsereignisse Zehnbasenpaare voneinander entfernt sind, ChIP-seq ist nicht in der Lage, diese Bindungsereignisse zu unterscheiden, mit Auflösungsvermögen von mehreren hundert Basenpaaren.

Abbildung 1
Abbildung 1: ChIP-exo Schematic. Nach ChIP wird der P7-Adapter an die Beschallungs Grenzen abgebunden. Lambda Exonuklease dann trimmt DNA 5 'zu 3' zu dem Vernetzungspunkt, wodurch die Interaktion von Protein-DNA-Footprinting. Nach der Elution und die Vernetzungsumkehr synthetisiert Primerverlängerung Duplex-DNA. Schließlich Ligation des Adapters P5 kennzeichnet die linken und rechten Grenzen Exonuclease und die resultierende Bibliothek wird auf Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Die Enden der Sequenz-Tags an das Bezugsgenom '5 Abbilden abgrenzt die Exonuklease Barriere und somit die genaue Stelle von Protein-DNAVernetzung. Abbildung modifiziert aus Rhee und Pugh 17. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: ChIP-exo Qualitätskontrollen. Panels AC repräsentative Ergebnisse von unabhängigen Experimenten. (A) Die Qualität des beschallten Chromatin - Extrakt (aus dem menschlichen HCC1806 Brustkrebs-Zelllinie) durch Agarose - Gelelektrophorese auf Extrakte mit bewertet wird (+) und ohne (-) die Vernetzungen umgekehrt. Intakte Vernetzungen werden Protein-DNA-Komplexe verursachen langsamer zu migrieren. Somit läuft Extrakt ohne Vernetzungen umgekehrt (-) erlaubt die Qualität der Vernetzungen Formaldehyd bewertet werden, die für eine erfolgreiche ChIP kritisch sind. (B) Vergleich eines Mock IP (-) einnd Pol II (+) -Chip-exo und ChIP-seq Bibliothek Präparate nach 21 Zyklen der PCR-Amplifikation. Nach der PCR-DNA-Fragmente von 200-500 bp (bezeichnet mit roten gehashten Box) und unter Verwendung eines Gelextraktionskit herausgeschnitten werden. (CD) In Feld C, die obere Kurve stellt eine ideale Spur aus einer gepoolten Bibliothek (P1) und die untere Kurve zeigt eine gepoolte Bibliothek (P2) , die Adapter - Dimere enthält. Tafel D zeigt das Diagramm DNA Dichte der Bibliothek P1-2 entsprechenden Spuren von Feld C (Pfeil bezeichnet Band-Adapter-Dimer). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: ChIP-exo Räumlich Behebt Distinct Bidirektionale Transkriptionsinitiationskomplexe. (A) geglättete Verteilung von strang separated ChIP-exo - Tag 5' - Enden für Pol II, TFIIB und TBP an der menschlichen rps12 Gen K562 - Zellen in wuchernden. (B) Gemittelt ChIP-exo - Muster um den nächsten RefSeq TSS. Peak-Paar-Tags an den TSS-Gen-für-Gen ausgerichtet waren, klassierten in nichtüberlappende 10bp Intervallen relativ zu dem TSS, dann ist die durchschnittliche Peak-Paar-Dichtewert über alle TFIIB besetzten (n = 6.511) -Gene wurde aufgetragen als ein Prozent der Gesamtkosten. Die "Spitzen" von TBP und TFIIB sind ununterscheidbar (vertikal in Einschub-Offset). (C) Modell basierend auf Platte B - Daten, zeigt , verschiedene Transkriptionsinitiationskomplexe gelöst durch ChIP-exo (schwarze Kurve). Pol II besetzt zwei separate auflösbaren Standorte, die mit Standorten unterschiedlicher Transkriptionsinitiations ( "Abweichende") und "Pause" Websites zusammenfiel. Diese klare räumliche Trennung von Pol II-Komplexe zeigt an, dass abweichende Transkripte aus verschiedenen Initiationskomplexe entstehen. Die überwiegende Mehrheit Pol II vernetzte abo ut 50 bp stromabwärts von der TSS in der "Pause" Ort, wo es erwartet wird, nachdem die Transkription zu unterbrechen. II Pol wurde am stärksten dezimierten 20-60 bp stromaufwärts von der TSS, wo die Präinitiationskomplex ( "PIC") bildet, was darauf hinweist, dass im Durchschnitt ist es wahrscheinlich weniger Zeit damit verbringt, dort als an den pausierten Standorten. Dies deutet darauf hin, dass in den meisten (aber nicht unbedingt allen) Fällen, einmal Pol II rekrutiert wird, löscht er schnell den Promotor und nimmt eine Pause-Zustand ca. 30 - 50 bp stromabwärts von der TSS, im Einklang mit der Beobachtung, dass Pol II Pause Mitteilung ist eine geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Transkription. Diese benachbarten Initiationskomplexe sind unauflösbar von ChIP-seq (dargestellt durch graue fill trace) seit ihrer Auflösung beschränkt sich auf ein paar hundert Basenpaaren. Abbildung geändert von Pugh und Venters 11. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Supplemental Datei . 1: Zusätzliche Informationen Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Reagens Volumen (ml) [Finale]
1 M HEPES-KOH (pH 7,5) 50 50 mM
5 M NaCl 28 140 mM
0,5 M EDTA 2 1 mM
100% Glycerol 100 10%
10% NP40 50 0,50%
10% Triton X100 25 0,25%
ddH 2 O Füllen Sie bis 1 L

Tabelle 1. Rezept für Lysepuffer 1. Filter mit 0,22 & mgr; m - Filter. Shop in 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C. 100 l CPI Lager bis 50 ml Puffer unmittelbar vor der Verwendung.

Reagens Volumen (ml) [Finale]
1 M Tris-HCl (pH 8) 10 10 mM
5 M NaCl 40 200 mM
0,5 M EDTA 2 1 mM
0,5 M EGTA 1 0,5 mM
ddH2 O Füllen Sie bis 1 L

Tabelle 2. Rezept für Lysepuffer 2. Filter mit 0,22 & mgr; m - Filter. Shop in 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C. 100 l CPI Lager bis 50 ml Puffer unmittelbar vor der Verwendung.

Reagens Volumen (ml) [Finale]
1 M Tris-HCl (pH 8) 10 10 mM
5 M NaCl 20 100 mM
0,5 M EDTA 2 1 mM
0,5 M EGTA 1 0,5 mM
10% Desoxycholat 10 0,10%
5 g 0,5% (w / v)
ddH 2 O Füllen Sie bis 1 L

Tabelle 3. Rezept für Lysepuffer 3. Filter mit 0,22 & mgr; m - Filter. Shop in 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C. 100 l CPI Lager bis 50 ml Puffer unmittelbar vor der Verwendung.

Reagens Volumen (ml) [Finale]
10x PBS 50 1x
Rinderserumalbumin 2,5 g 0,50%
ddH 2 O Füllen Sie bis 500

Tabelle 4. Rezept für Sperrung Puffer. Filter mit 0,22 & mgr; m-Filter. Shop in 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C. 100 l CPI Lager bis 50 ml Puffer unmittelbar vor der Verwendung.

Reagens Volumen (ml) [Finale]
1 M HEPES (pH 7,5) 25 50 mM
0,5 M EDTA (pH 8) 1 1 mM
10% Natriumdeoxycholat 35 0,70%
10% NP40 50 1%
1 M LiCl 250 500 mM
ddH 2 O Füllen Sie bis 500
Inhalt "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-mit-next.within-page =" always ">

Tabelle 5. Rezept für RIPA - Puffer. Filter mit 0,22 & mgr; m-Filter. Shop in 50-ml-Röhrchen bei 4 ° C. 100 l CPI Lager bis 50 ml Puffer unmittelbar vor der Verwendung.

Reagens Volumen (ml) [Finale]
1 M Tris-Cl (pH 7,5) 2.5 50 mM
0,5 M EDTA 1 10 mM
20% SDS 2.5 1%
ddH 2 O Füllen Sie bis 50

Tabelle 6. Rezept für ChIP Elutionspuffer. Filter mit 0,22 & mgr; m-Filter. Lagern Sie bei RT.

Reagens Volumen (ml) [Finale]
1 M Tris-Cl (pH 7,5) 0,5 10 mM
ddH 2 O Füllen Sie bis 50

Tabelle 7. Rezept für TE - Puffer. Filter mit 0,22 & mgr; m-Filter. Lagerung bei 4 ° C.

Volumen (ul) [Finale]
100 & mgr; M ExA2-iX 75 15 & mgr; M
100 & mgr; M ExA2-33 75 15 & mgr; M
1 M Tris (pH 7,5) 50 100 mM
5 M NaCl 5 50 mM
ddH 2 O 295 -
Volle Lautstärke 500

Tabelle 8. P7 Adapter Ausglühen Mix.

Tabelle 9. P5 Adapter Ausglühen Mix.

Volumen (ul) [Finale]
100 & mgr; M ExA1-58 75 15 & mgr; M
100 & mgr; M ExA1-13 75 15 & mgr; M
1 M Tris (pH 7,5) 50 100 mM
5 M NaCl 5 50 mM
ddH 2 O 295 -
Volle Lautstärke 500
Temp (° C) Zeit
95 5 Minuten
72 5 Minuten
65 auf 60 Rampe Rückgang 5 Minuten
55 auf 50 Rampe Rückgang 3 min
45 auf 40 Rampe Rückgang 3 min
30 3 min
20 3 min
10 3 min
4 Für immer

Tabelle 10. Adapter Ausglühen Programm.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 39.8
10x Reaktionspuffer 2 5 1x
100 uM ATP 0,5 1 mM
3 mM dNTPs 1.7 100 & mgr; M
3 U / ul T4-Polymerase 1 3 U
5 U / ul Klenow 1 5 U
10 U / ul T4 Polynukleotidkinase 1 10 U
Die gesamte Reaktionsvolumen 50

Tabelle 11. Polieren Master - Mix.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 42.3
10x Reaktionspuffer 2 5 1x
3 mM dATP 1.7 100 & mgr; M
5 U / ul Klenow 3'-5'-Exo-minus 1 5 U
Die gesamte Reaktionsvolumen 50

Tabelle 12 A-Tailing Master Mix.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 41
100 mM ATP 0,5 1 mM
10x Reaktionspuffer 2 5 1x
400 U / ul T4-DNA-Ligase 1.5 600 U
Die Reaktionsmischung Volumen 48
15 mM Index Adapter 2 30 Picomol
Die gesamte Reaktionsvolumen 50

Tabelle 13. P7 Adaptorligation Master - Mix.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 41
10x Φ-29 Puffer 5 1x
3 mM dNTPs 2.5 150 & mgr; M
10 U / ul Φ-29-Polymerase 1.5 15 U
Die gesamte Reaktionsvolumen 50

Tabelle 14. Φ-29 Nick Repair Master Mix.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 43,5
100 mM ATP 0,5 1 mM
10x Reaktionspuffer 2 5 1x
10 U / ul T4 Polynukleotidkinase 1 10 U
Die gesamte Reaktionsvolumen 50

Tabelle 15. Kinase - Reaktions Master - Mix.

1x (&# 956; l) [Finale]
ddH 2 O 43
10x Lambda-Puffer 5 1x
5 U / ul Lambda Exonuklease 2 10 U
Die gesamte Reaktionsvolumen 50

Tabelle 16. Lambda Exonukleasereaktion Master - Mix.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 44
10x Reaktionspuffer 2 5 1x
30 U / ul RecJ f Exonuklease 1 30 U
Die gesamte Reaktions volume 50

Tabelle 17. RecJ f Nukleasereaktion Master - Mix.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 6,45
10x Φ-29 Puffer 2 1x
3 mM dNTP 1.3 200 & mgr; M
20 & mgr; M P7 Primer 0,25 0,25 & mgr; M
Die Reaktionsmischung Volumen 10
EtOH gefällte Probe 10
Die gesamte Reaktionsvolumen 20

Tabelle 18. P7Primer-Extension-Reaktion Master-Mix.

Temp (° C) Zeit
95 5 Minuten
65 5 Minuten
30 2 Minuten
30 Halten bis Φ-29 hinzugefügt wird
30 20 Minuten
65 10 Minuten
4 Für immer

Tabelle 19. P7 Primer Extension Program.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 5
3 1x
3 mM dATP 1 0,1 mM
5 U / ul Klenow 3 'bis 5' Exo minus 1 5 U
Die Reaktionsmischung Volumen 10
Primer verlängerte Probe 20
Die gesamte Reaktionsvolumen 30

Tabelle 20 A-Tailing Master Mix.

1x (ul) [Finale]
ddH 2 O 11.5
10x T4 Ligasepuffer 5 1x
15 & mgr; M ExA1-58 /13 Adapter 2 30 Picomol
400 U / & mgr; l T4 DNA Ligase 1.5 600 U
Die Reaktionsmischung Volumen 20
A-tailed Probe 30
Die gesamte Reaktionsvolumen 50

Tabelle 21. P5 Adaptorligation Master - Mix.

1x (ul) [Finale]
5x PCR-Puffer 10 1x (2 mM MgCl 2)
10 mM jedes dNTP 1 200 uM jeweils
20 & mgr; M P1.3 Primer 1,25 0,5 & mgr; M
20 & mgr; M P2.1 Primer 1,25 0,5 & mgr; M
2 U / ul Hot Start Polymerase 0,5 1 U
Die Reaktionsmischung Volumen 14
Bead eluierten Probe 36
Die gesamte Reaktionsvolumen 50

Tabelle 22. PCR.

<tr>
Temp (° C) Zeit Fahrräder
98 30 sec 1
98 10 sec 15-21 (je nach ChIP Effizienz)
52 30 sec
72 20 sec
72 2 Minuten 1
4 Für immer Halten

Tabelle 23. PCR - Programm.

Per DNA - Standard (ul) Pro Probe (ul)
1: 200 verdünnt Puffer / Farbstoff-Mischung 190 198
DNA-Standards 10
ChIP-exo-Bibliothek 2
Volle Lautstärke 200 200

Tabelle 24. Quantifizierung.

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Discussion

Wir präsentieren eine funktionelle Genom Protokoll die genaue Bindungsstelle für Chromatin-interagierende Proteine ​​in einer unvoreingenommenen, genomweite Weise in der Nähe von Basenpaar-Auflösung zu bestimmen. Der wichtigste Schritt in der Nähe von Basenpaar Abbildungsauflösung zu erreichen, ist die Exonuclease-Behandlung des ChIP angereicherte DNA während der Immunopräzipitat auf dem magnetischen Harz bleibt. Vordergründig könnte Proteinkomplexe möglicherweise blockieren in vivo Fußabdrucks eines beliebigen Untereinheit (zB Chromatin - Remodeling - Komplexe oder die Nukleosomen Kernteilchen). Wie zuvor 10 jedoch berichtet, da Formaldehyd ein ineffizienter Vernetzers ist, wird es zunehmend unwahrscheinlich , daß mehrere Untereinheiten eines Komplexes mit DNA und einander in der gleichen Zelle bei der gleichen Locus vernetzen würde. Somit ist in vivo footprinting einzelner Untereinheiten eines Proteinkomplexes, wie einzelne Histon - Untereinheiten einer Nukleosomen, möglich ChIP-exo.

t "> Die wichtigsten Vorteile von ChIP-exo sind seine in der Nähe von Basenpaar-Auflösung und niedrigen Hintergrund. Die extrem hohe Auflösung ermöglicht detaillierte strukturelle und räumliche Einblicke in einer genomweiten Maßstab gemacht werden, die derzeit nicht möglich, mit jedem anderen Verfahren sind dar . Andererseits seits~~POS=HEADCOMP ist die Hauptbeschränkung von ChIP-exo , dass es ein technisch anspruchs Molekularbiologie Methodik ist. Zusätzlich zu beherrschen, auch die allgemeinen Grenzen der ChIP Schritt ChIP-exo (beispielsweise kommerzielle Antikörper Verfügbarkeit und Spezifität gelten Epitop Zugänglichkeit und relativ große Anzahl von Zellen erforderlich). Häufige Probleme schlechte Qualität beschallt Extrakte enthalten, eine nicht-ChIP Grade-Antikörper verwendet, und Proben auf Eis nicht so viel wie möglich zu halten. so Beschallungsbedingungen sorgfältig optimiert werden müssen und jeder Antikörper validiert , wie zuvor beschrieben 18 die schädlichen Auswirkungen diese Parameter zu vermeiden , können auf dem experimentellen Ergebnis.

So weit wieSequenzierungstiefe für einen Transkriptionsfaktor Ziel wollen wir typischerweise etwa 20 Millionen eindeutig ausgerichtet liest. Da Pol II und Histon-Modifikationen mehr sind breit verteilt, streben wir für 30-50000000 liest. Es ist wichtig zu beachten, dass, da ChIP-exo wesentlich weniger als Hintergrund ChIP-seq hat, werden weniger liest erforderlich ähnliche Sequenzierungstiefe zu erreichen.

Der Chip-exo - Technologie wird heute weithin trotz seiner technischen Herausforderungen angenommen, wie robust Variationen des ursprünglichen Protokoll weiterhin 17,19,20 veröffentlicht werden. Insbesondere ist eine Variante , die für schwer zerspanbaren Proteine nützlich erweisen wird ChIP-Nexus genannt, die einen einzelnen Ligationsschritt verwendet 20 die effizient der Bibliothek Vorbereitung zu erhöhen. Zusammengefasst ChIP-exo ist eine zunehmend eingesetzt und leistungsfähige Methodik für ultra-hochauflösenden Abbildung von Chromatin interagierende Proteine ​​auf globaler Ebene. Da die Liste der im Handel erhältlichen ChIP-Grade-Ameiseibodies weiter, zukünftige Anwendungen der ChIP-exo-Methodik wachsen wird bei Mapping unerforschten Gen regulatorische Netzwerke gerichtet werden, um die molekulare Schaltung der Zelle in ultrahoher Auflösung zu verstehen. Darüber hinaus wird ChIP-exo wahrscheinlich weiter verfeinert und angepasst in vivo Protein-RNA - Wechselwirkungen an in der Nähe von Basenpaar - Auflösung Stellfläche.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules ThermoFisher Scientific 28908 Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) Roche Life Science 11873580001 Sections 4, 8
Bioruptor sonicator Diagenode UCD200 Section 5
15 ml polystyrene tubes BD Falcon 352095 Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads GE Healthcare 28-9670-66 Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack Invitrogen 12321D Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 05-450-127 Sections 7, 22
T4 DNA Polymerase New England BioLabs M0203 Section 9
DNA Polymerase I, Klenow New England BioLabs M0210 Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) New England BioLabs B7002 Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C Eppendorf 5382 Sections 9-16
ATP Roche Life Science 010419979001 Sections 9, 11, 13
dNTPs New England BioLabs N0447 Sections 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201 Sections 9, 13
dATP New England BioLabs N0440 Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus New England BioLabs M0212 Sections 10, 20
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202 Sections 11, 21
Φ-29 DNA Polymerase New England BioLabs M0269 Sections 12, 19
10x Φ-29 Buffer New England BioLabs B0269 Sections 12, 19
Lambda Exonuclease New England BioLabs M0262 Section 14
10x Lambda Buffer New England BioLabs B0262 Section 14
RecJf Exonuclease New England BioLabs M0264 Section 15
Proteinase K Roche Life Science 03115828001 Section 16
Glycogen Roche Life Science 010901393001 Section 18
10x T4 Ligase Buffer New England BioLabs B0202 Section 21
AMPure XP (clean up) beads  Beckman Coulter A63881 Section 22
Q5 Hot Start DNA Polymerase  New England BioLabs M0493 Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) New England BioLabs B9027 Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Section 25
Qubit Fluorometer Invitrogen Q33216 Section 26
Optical Clear Qubit tubes  Invitrogen Q32856 Section 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit Invitrogen Q32851 Section 26

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Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision
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Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. J. Vis. Exp. (118), e55016, doi:10.3791/55016 (2016).

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