Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

أسلوب الشذرة إكسو: تحديد التفاعلات البروتين الحمض النووي مع قرب قاعدة زوج الدقة

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/55016
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Abstract

الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة لا غنى عنها في مجالات علم التخلق وتنظيم الجين الذي يعزل تفاعلات البروتين-DNA محددة. يستخدم رقاقة بالإضافة إلى التسلسل إنتاجية عالية (رقاقة وما يليها) عادة لتحديد الموقع الجيني من البروتينات التي تتفاعل مع لونين. ومع ذلك، ويعوق رقاقة وما يليها من قبل منخفضة نسبيا قرار رسم الخرائط من عدة مئات من أزواج قاعدة وعالية إشارة الخلفية. طريقة الشذرة إكسو هو نسخة منقحة من رقاقة وما يليها أن تحسن بشكل كبير على كل من قرار والضوضاء. والفرق الرئيسي للمنهجية الشذرة إكسو هو إدماج الهضم امدا نوكلياز خارجية في سير العمل إعداد مكتبة للبصمة فعال اليسار واليمين 5 الحدود "الحمض النووي للموقع تشعبي البروتين الحمض النووي. ثم يتعرض للمكتبات رقاقة إكسو إلى ارتفاع التسلسل الإنتاجية. يمكن الاستفادة من البيانات الناتجة لتقديم رؤى فريدة وفائقة الدقة في التنظيم س الوظيفيو الجينوم. هنا، نحن تصف طريقة الشذرة إكسو أن لدينا الأمثل وتبسيط نظم الثدييات والجيل القادم من منصة التسلسل عن طريق التوليف.

Introduction

الكروماتين مناعي (رقاقة) هو وسيلة قوية لدراسة آليات تنظيم الجينات من خلال إثراء انتقائي لشظايا الحمض النووي التي تتفاعل مع بروتين معين في الخلايا الحية. وقد تطورت أساليب اكتشاف شظايا الحمض النووي المخصب الشذرة كما يحسن التكنولوجيا، من الكشف عن مكان واحد (معيار الشذرة QPCR) إلى التهجين على ميكروأرس النوكليوتيد (رقاقة رقاقة) إلى التسلسل الإنتاجية العالية (رقاقة وما يليها) 1. على الرغم من رقاقة وما يليها شهدت تطبيق على نطاق واسع، والتباين لونين والتفاعلات الحمض النووي غير محددة أعاقت نوعية البيانات التي تؤدي إلى المغلوطة ورسم الخرائط غير دقيقة. وللتغلب على هذه القيود، طور الدكتور فرانك بف طريقة الشذرة إكسو 2. والسمة البارزة لالشذرة إكسو هو أنه يشتمل على 5 'إلى 3' نوكلياز خارجية، البصمة بشكل فعال عامل النسخ المواقع ملزمة. ونتيجة لذلك، فإن منهجية الشذرة إكسو تحقق دقة أعلى، أكبر مجموعة ديناميكية من detectioن، وانخفاض الضوضاء في الخلفية.

على الرغم من أن الشذرة إكسو هو أكثر تحديا من الناحية الفنية لسيده من رقاقة وما يليها، واعتمادها على نطاق واسع بأنها تهدف الدراسات للحصول على أفكار ذات دقة عالية جدا فريدة من نوعها باستخدام النظم البيولوجية المتنوعة 3-8. في الواقع، تم تطبيق الشذرة إكسو بنجاح إلى البكتيريا والخميرة والجرذان والفئران، ونظم خلايا الإنسان. وكدليل على المبدأ، تم استخدام رقاقة-إكسو في الأصل لتحديد عزر ملزم دقيق لعدد قليل من الخميرة النسخ عوامل 2. وقد استخدمت هذه التقنية أيضا في الخميرة لدراسة تنظيم النسخ مجمع قبل البدء، وإلى فك هيكل subnucleosomal من مختلف الهستونات 9،10. وفي الآونة الأخيرة، ونحن الاستدانة الشذرة إكسو لحل TFIIB المجاورة وبول الثاني الأحداث في المروجين الإنسان ملزمة، وأظهرت أن النسخ متباينة على نطاق واسع ينشأ من بدء متميزة مجمعات 11.

تم تحسين سير العمل المعروضة هنا والصورةtreamlined لالثدييات الشذرة إكسو (الشكل 1). أولا، يتم التعامل مع الخلايا الحية ثقافة الأولية أو الأنسجة مع الفورمالدهايد للحفاظ على الجسم الحي في تفاعلات البروتين الحمض النووي من خلال تشعبي التساهمية. وهي lysed الخلايا ولونين المنفصمة إلى ~ 100-500 زوج قاعدة شظايا الحجم. رقاقة ثم يغني بشكل انتقائي لشظايا الحمض النووي crosslinked للبروتين من الفائدة. عند هذه النقطة، يتم إعداد مكتبات رقاقة وما يليها عادة، مما يحد بطبيعتها القرار كشف أن متوسط ​​حجم جزء من بضع مئات من أزواج قاعدة. ومع ذلك، الشذرة إكسو يتغلب على هذا التحديد عن طريق تقليم اليسار واليمين 5 الحدود "الحمض النووي للموقع تشعبي البروتين الحمض النووي مع نوكلياز خارجية امدا. ثم يتم إنشاء مكتبات التسلسل من نوكلياز خارجية الحمض النووي يهضم كما هو موضح أدناه. تمثل المتداخلة 5 الحدود الناتجة 'بصمة في الجسم الحي للتفاعل البروتين الحمض النووي (الشكل 1، الخطوة 14)، ويتم الكشف عنها بواسطة عالية التسلسل الإنتاجية. بديلهوغ منهجية الشذرة إكسو هي أكثر انخراطا من رقاقة وما يليها، والتحولات بين معظم الخطوات تتطلب غسل حبة بسيط، الذي يقلل من فقدان العينة وتقلب التجريبية. الأهم من ذلك، منذ الشذرة إكسو هو نسخة منقحة من رقاقة وما يليها، أي عينة غير ناجحة مع رقاقة وما يليها ينبغي أيضا أن تكون ناجحة مع رقاقة-إكسو.

في الجسم الحي البصمة للتفاعلات البروتين الحمض النووي مع النتائج الشذرة إكسو في بنية بيانات متميزة جوهريا عن رقاقة وما يليها. على الرغم من المتصلين رقاقة وما يليها المشترك يمكن تطبيقها على البيانات الشذرة إكسو، للحصول على مكالمات الذروة أدق نوصي المعلوماتية الحيوية الأدوات المصممة خصيصا مع بنية فريدة من نوعها من البيانات الشذرة إكسو في الاعتبار. وتشمل هذه Genetrack، GEM، صولجان، Peakzilla، وExoProfiler 12-15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: مزدوج المقطر H 2 O أو الجزيئي يعادل الصف يوصى به لجميع المخازن وردود الفعل يمزج.

اليوم 0: إعداد المواد وخلية الحصاد

1. إعداد العازلة

  1. إعداد تحلل المخازن 1-3 (الجداول 1-3)، وإضافة 100 ميكرولتر كامل الأسهم مثبط البروتياز (CPI) إلى 50 مل من كل العازلة فقط قبل استخدامها. إعداد الأوراق المالية مؤشر أسعار المستهلكين عن طريق إذابة قرص واحد في 1 مل الصف الجزيئية H 2 O.
  2. إعداد الشذرة المخازن (الجداول 4-7). إضافة 100 ميكرولتر الأسهم مؤشر أسعار المستهلك إلى 50 مل من الحجب ومخازن المعهد الملكي. لا تضيف مؤشر أسعار المستهلك إلى تريس ورقاقة شطف المخازن.

2. التليين من محول أليغنوكليوتيد]

ملاحظة: يمكن الاطلاع على متواليات النوكليوتيد محددة في الإضافي قسم المعلومات.

  1. إعداد يمزج محول التليين (الجداول 8-9). دوامة خلط لفترة وجيزةتدور أنابيب لجمع محتويات. قسامة 100 ميكرولتر من كل مزيج إلى 0.5 مل أنابيب.
  2. هجن [أليغنوكليوتيد عن طريق تشغيل برنامج (الجدول 10) في Thermocycler.
    متجر مطوع أليغنوكليوتيد] في -80 درجة مئوية.

3. في فيفو لونين يشابك مع الفورمالديهايد

ملاحظة: للحصول على تجربة الشذرة نموذجية، ينبغي أن يتضمن مادة البداية ما يقرب من 50 مليون خلية.

  1. إضافة جديدة 37٪ خالية من الميثانول حل الأسهم الفورمالديهايد لالفوسفات مخزنة المالحة (PBS) غسلها زراعة الخلايا إلى تركيز النهائي من 1٪ (ت / ت)، تخلط جيدا، وترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: على سبيل المثال، ونحن عادة إضافة 1.4 مل من 37٪ الفورمالديهايد خالية من الميثانول إلى خلايا في 50 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. أيضا، وتجنب الفورمالديهايد يشابك في وسائل الإعلام منذ البروتينات في وسائل الإعلام وإرواء بعض الفورمالديهايد.
  2. إخماد يشابك رد فعل عن طريق إضافة 2.5 M glycinه لتركيز النهائي من 125 ملم. تخلط جيدا.
  3. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل على الجليد. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 1000 x ج في 4 درجات مئوية. طاف صب.
  4. إضافة 1 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X إلى الخلية بيليه و resuspend من قبل pipetting. نقل إلى 1.5 مل أنبوب.
  5. تدور الخلايا لمدة 3 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. نضح طاف.
  6. فلاش على الفور تجميد الكريات خلية في 1.5 مل أنابيب مع النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية. خلايا Crosslinked مستقرة إلى أجل غير مسمى في -80 درجة مئوية.

يوم 1: تحلل الخلايا، صوتنة، والشذرة

4. تحلل الخلايا

ملاحظة: خلال جميع أقسام خلية تحلل، يجب أن تبقى العينات على الجليد أو على 4 درجات مئوية للحد من انعكاس تشعبي.

  1. ذوبان الجليد لفترة وجيزة بيليه خلية crosslinked. تماما resuspend كل بيليه في 0.5 مل الاحتياطي تحلل 1 و تتحد مع 4.5 مل الاحتياطي تحلل 1 في أنبوب البوليسترين 15 مل.
  2. أنابيب الصخور لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئويةلعلى منصة هزاز. تدور لمدة 4 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. طاف صب.
  3. تماما resuspend كل بيليه في 0.5 مل الاحتياطي تحلل 2 وإضافة 4.5 مل الاحتياطي تحلل 2 مرة معلق.
  4. موسيقى الروك لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية على منصة هزاز. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 x ج في 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف استفادة من فائض على منشفة ورقية.
  5. تماما resuspend كل بيليه في 0.5 مل الاحتياطي تحلل 3 وإضافة 1 مل الاحتياطي تحلل 3 مرة معلق. الحفاظ لست] النووية على الجليد والشروع فورا في صوتنة.

5. صوتنة من لست] النووية

ملاحظة: خلال جميع أقسام صوتنة، يجب أن تبقى العينات على الجليد للحد من انعكاس تشعبي. ويمكن الاطلاع على نموذج معين من sonicator تستخدم في بالاشتراك مع بروتوكول أدناه في الجدول المواد. ويمكن الاطلاع على التفاصيل حول استخدام sonicator محددة ومبادئ توجيهية لغيرها من الصكوك في الإضافي قسم المعلومات.

  1. ررمحولات بالرنين الآس في 15 مل أنابيب البوليسترين تتضمن مقتطفات النووية (يجب أن شريط معدني لا تلمس جدار الأنبوب).
  2. لست] النووية يصوتن في حمام الماء البارد الثلج لمدة 2 × 15 جلسات دقيقة مع 30 ثانية ON / OFF 30 ثانية في قوة متوسطة. يصوتن سوى اثنين من 15 مل أنابيب في المرة الواحدة. وتعمل هذه الإعدادات على مجموعة واسعة من خطوط الخلايا وأنواع الخلايا الأولية، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين إذا القص لونين غير كامل.
  3. للتحقق النتائج صوتنة، ونقل 2 × 10 عينات ميكرولتر من المحللة إلى 1.5 مل أنابيب.
    1. لعكس crosslinks، والجمع بين أول قسامة 10 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر TE-ريبونوكلياز وو 0.2 ميكرولتر من بروتين ك احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إضافة 4 6X ميكرولتر صبغة زيلين الحمض النووي.
    2. للحفاظ على crosslinks، والجمع بين الثانية قسامة 10 ميكرولتر مع 2 6X ميكرولتر صبغة زيلين الحمض النووي.
    3. تشغيل كل من العينات على هلام الاغاروز 1.5٪ عند 140 V لحوالي 30 - 45 دقيقة حتى الصبغة برموفينول في سلم طالصورة ¾ من الطريق هلام.
  4. إذا كان صوتنة الناجحة (معظم شظايا الحمض النووي المنفصمة إلى 100-500 بي بي)، ونقل sonicated لست] إلى 2 مل أنابيب تحتوي على 150 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100. دوامة لخلط.
  5. لتكوير لونين غير قابلة للذوبان والحطام، sonicated تدور المحللة النووي لمدة 10 دقيقة في 20000 x ج في 4 درجات مئوية.
  6. نقل طاف لأنبوب 2 مل الجديد. الشروع فورا في الشذرة أو تخزين العينات في -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. يجب مقتطفات Sonicated لا يتم تجميد وإذابة أكثر من مرة.

6. اقتران الأجسام المضادة لالخرز

ملاحظة: لا يوجد دوامة أو تجميد / ذوبان الجليد حبات مغناطيسية لأنها سوف تتحطم وزيادة إشارة الخلفية.

  1. بعد خلط دقيق الأوراق المالية، قسامة Y ميكرولتر الطين حبة إلى 1.5 مل أنبوب، حيث Y = 1.1 × 2.5 ميكرولتر س (عدد العينات رقاقة). قدرة ملزمة 2.5 ميكرولتر حبة الطين تصل إلى 13 ميكروغرام مفتش. تغسل حبات المجمعة 3X مع 1 مل حجبالعازلة.
  2. لaliquotting أكثر اتساقا من الخرز يغسل بعد، والخرز resuspend في 10X حجم الطين الأصلي (25 ميكرولتر / رقاقة) مع عازلة تمنع. قسامة 25 ميكرولتر لكل عينة الشذرة إلى 1.5 مل أنابيب.
  3. إضافة 5-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة لقسامة من Resuspend الخرز المقابلة. جلب الحجم النهائي إلى 250 ميكرولتر مع عازلة تمنع. احتضان العينات لمدة 4 ساعة (بدلا من ذلك، بين عشية وضحاها لمدة 16 ساعة) على منصة دوارة في 4 درجات مئوية.
  4. نضح طاف. لإزالة الأجسام المضادة غير منضم أو الزائد، وغسل حبات مرة واحدة مع 1 مل عازلة تمنع.
  5. بعد الشفط غسل الماضي، إضافة على الفور 50 مليون حكمه خلية مقتطفات sonicated (~ 1.6 مل) إلى الأجسام المضادة: تقارن حبة. إذا مقتطفات sonicated ليست مستعدة، والخرز resuspend في 100 ميكرولتر عازلة تمنع حتى تكون جاهزة. فمن الأهمية بمكان أن لا تجعل حبات جافة.

7. لونين مناعي (رقاقة)

  1. لكل عينة الشذرة، والجمع بين 1.5 مل من يصوتنمقتطفات د مع الأجسام المضادة: تقارن حبة في 1.5 مل أو 2 مل أنابيب.
  2. احتضان الأنابيب على محور دوار صغير أنبوب بين عشية وضحاها (حوالي 16 ساعة) في تحديد السرعة من 9 في 4 ج. تحقق بعد دقائق قليلة لضمان العينات لا يتم تسريب والاختلاط بشكل صحيح.

يوم 2: الشذرة يغسل وعلى الراتنج التفاعلات الأنزيمية

8. رقاقة يغسل

ملاحظة: للحد من التلوث، لفترة وجيزة تدور الأنابيب بين كل غسل. لطموح الأول، تغيير نصائح بين كل عينة. خلال يغسل اللاحقة، وهو نفس طرف يمكن استخدام طويلة كما لم يتطرق الخرز. رؤية إضافية القسم معلومات عن الاتجاهات في غسل رقاقة السليم.

  1. جدا تدور لفترة وجيزة الأنابيب باستخدام microcentrifuge ل(~ 3 ثانية في 500 x ج) لجمع السائل في مباراة دولية ووضع على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. في حين لا تزال على الرف المغناطيسي، واستخراج نضح.
  2. إضافة 0.75 مل RIPA العازلة إلى كل أنبوب. إزالة الأنابيب من رف المغناطيسيوعكس عدة مرات لخلط. استبدال أنابيب على الرف المغناطيسي وطاف نضح. كرر 7X.
  3. إضافة 0.75 مل 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) إلى كل أنبوب. إزالة الأنابيب من رف المغناطيسي وعكس عدة مرات لخلط. استبدال أنابيب على الرف المغناطيسي وطاف نضح. كرر 2X.
  4. بعد الشفط غسل الماضي، انتقل إلى تلميع.
    ملاحظة: بعد كل رد فعل حضانة في أقسام 9.3، 10.3، 11.3، 12.3، 13.3، 14.3، و 15.3، وأنابيب تدور لفترة وجيزة ومكان ضد حامل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة وطاف نضح. غسل 2X مع 0.75 مل RIPA العازلة و 2x مع 0.75 مل تريس حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة).

9. تلميع رد الفعل

  1. ملء تلميع الحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 11). جعل تلميع المزيج في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد ويستنشق آخر غسل رقاقة، إضافة 50 ميكرولتر من تلميع المزيج إلى كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان هذه العينات لمدة 30 دقيقة في 3 x جفي 30 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى A-المخلفات.

10. A-المخلفات رد الفعل

  1. ملء-المخلفات والحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 12). جعل A-المخلفات المزيج في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد تلميع القسم، إضافة 50 ميكرولتر من A-المخلفات المزيج إلى كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 3 x ج في 37 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى P7 محول ربط.

11. P7 محول من ربط رد الفعل

  1. ملء الحسابات مزيج من ربط الرئيسي (الجدول 13). جعل من ربط خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. ماصة لخلط.
  2. فور A-المخلفات القسم، إضافة 48 ميكرولتر مزيج الرئيسي P7 من ربط و 2 ميكرولتر من مختلف ر مؤشر محولس كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 2 ساعة في 3 x ج في 25 مئوية في thermomixer.
    ملاحظة: سيتم استخدام مؤشرات مختلفة لكل عينة يسمح مزيد من العينات لتكون متسلسلة في خلية تدفق واحدة.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى Φ 29 إصلاح نيك.

12. فاي-29 نيك إصلاح رد الفعل

  1. ملء Φ 29 حسابات مزيج الرئيسي (الجدول 14). جعل Φ 29 المزيج في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد القسم P7 الربط، إضافة 50 ميكرولتر من Φ 29 مزيج من كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في 3 x ج 30 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى رد فعل كيناز.

13. كيناز رد الفعل

  1. ملء كيناز الحسابات مزيج الرئيسي (
  2. مباشرة بعد Φ 29 قسم، إضافة 50 ميكرولتر من كيناز مزيج من كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في 3 x ج في 37 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى رد فعل لامبدا نوكلياز خارجية.

14. امدا نوكلياز خارجية ردود الفعل

  1. ملء امدا نوكلياز خارجية الحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 16). جعل امدا نوكلياز خارجية خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد القسم كيناز، إضافة 50 ميكرولتر من امدا نوكلياز خارجية مزيج من كل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 3 x ج في 37 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى RecJ رد فعل و.

15. RecJ ورد الفعل نوكلياز

  1. ملء الحسابات مزيج RecJ و الرئيسي (الجدول 17). جعل مزيج و RecJ في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. مباشرة بعد القسم امدا نوكلياز خارجية، إضافة 50 ميكرولتر من مزيج و RecJ لكل الراتنج عينة في حين لا تزال على الرف المغناطيسي. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 3 x ج في 37 مئوية في thermomixer.
  3. بعد الشفط غسل الماضي كما هو موضح في المذكرة بعد القسم 8.4، انتقل إلى رقاقة شطف.

16. شطف وتشعبي عكس

  1. تحضير مزيج الرئيسي: عدد العينات س 1.1 س (200 ميكرولتر الشذرة الاحتياطي شطف + 1 ميكرولتر 20 ملغ / مل بروتين كاف) في أنبوب 1.5 مل. إضافة 200 ميكرولتر مزيج الرئيسي رقاقة الاحتياطي شطف + بروتين كاف لكل الراتنج العينة.
  2. احتضان عينات بين عشية وضحاها (حوالي 16 ساعة) في 3 x ج ب 65 ج في thermomixer مع غطاء ساخنة لمنع التكثيف.

يوم 3: استخراج الحمض النوويأيون ومحول من ربط

17. شطف وتشعبي عكس (تابع)

  1. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها في 65 ج، وتدور لفترة وجيزة عينات لجمع المكثفات. مكان العينات على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
  2. نقل 200 ميكرولتر طاف لأنبوب جديد 1.5 مل تحتوي على 200 ميكرولتر TE العازلة (7.5 درجة الحموضة).

18. الفينول الكلوروفورم كحول أيزو أميلي (PCIAA) استخلاص

  1. إضافة 400 ميكرولتر الفينول الكلوروفورم كحول أيزو أميلي لكل عينة. دوامة لخلط لمدة 20 ثانية.
  2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 20000 x ج في درجة حرارة الغرفة (RT). نقل بعناية 325 ميكرولتر من الطبقة المائية العليا لأنبوب جديد.
    ملاحظة: احرص على عدم نقل أي من العضوية (الطبقة السفلى) في أنبوب جديد.
  3. إضافة 10/01 حجم 3 M NaOAc (5.5 درجة الحموضة) و 1 ميكرولتر 20 ملغ / مل الجليكوجين إلى كل عينة. للحصول على عينات متعددة، وإعداد مزيج الرئيسي.
  4. إضافة 3 مجلدات من الجليد البارد الإيثانول بنسبة 100٪ على كل عينة. دوامةلخلط. احتضان لمدة 15 دقيقة في -80 مئوية.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 20000 x ج في 4 ج. بعناية صب طاف، مع التأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
  6. إضافة بلطف 500 ميكرولتر تقدم طازجة الجليد الباردة الايثانول 70٪، مع التأكد من عدم تعكير صفو بيليه. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 20000 x ج في 4 ج. صب بعناية طاف.
  7. بيليه الجافة لحوالي 20 دقيقة (أو حتى الجافة) في فراغ سرعة 45 مئوية.
    ملاحظة: هذه نقطة توقف في البروتوكول. ويمكن تخزين الكريات DNA الجافة في -20 مئوية.
  8. الكريات Resuspend في 10 ميكرولتر ده 2 O. الماصة مرارا فوق المنطقة حيث الحمض النووي مكعبات، على الرغم من أن بيليه المجففة لا يمكن أن ينظر إليه.
  9. نقل 10 ميكرولتر من كل عينة إلى الطازجة 0.3 مل أنبوب PCR أو 8-رف، اعتمادا على عدد من العينات.

19. P7 التمهيدي تمديد رد الفعل

  1. ملء P7 التمهيدي تمديد الحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 18). جعل التمديد خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج ملحق (ناقص Φ 29 البلمرة) لكل عينة 10 ميكرولتر. الماصة إلى المزيج.
  3. عينات تشغيل في Thermocycler باستخدام برنامج (الجدول 19) لالتمهيدي يصلب إلى القالب حتى 30 ج "عقد" خطوة.
  4. إضافة 1 ميكرولتر Φ 29 البلمرة أثناء ج 30 "عقد" خطوة في البرنامج. الماصة إلى المزيج. استئناف ما تبقى من البرنامج (الجدول 19).

20. A-المخلفات رد الفعل

  1. ملء-المخلفات والحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 20). جعل A-المخلفات المزيج في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من A-المخلفات مزيج لكل عينة. الماصة إلى المزيج.
  3. في Thermocycler، احتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 C، ثم تسخين تعطيل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 75 مئوية.

21. P5 محول من ربط رد الفعل

  1. فيللتر من P5 محول من ربط الحسابات مزيج الرئيسي (الجدول 21). جعل من ربط خلط في أنبوب 1.5 مل على الجليد. الماصة إلى المزيج.
  2. إضافة 20 ميكرولتر من P5 من ربط مزيج لكل عينة. الماصة إلى المزيج.
  3. في Thermocycler، احتضان عينات لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية.

22. حبة النظيفة المتابعة

ملاحظة: يرجى الاطلاع على قسم المواد للحصول على تفاصيل الشركة المصنعة على حبة تنظيف.

  1. نقل كل عينة 50 ميكرولتر لأنبوب 1.5 مل جديد.
  2. و resuspend تنظيف الخرز على محور دوار مصغرة أنبوب في تحديد سرعة 15 لمدة 15 دقيقة في RT. لا تدع حبات تسوية قبل pipetting ل.
  3. إضافة 60 ميكرولتر تنظيف الخرز لأخذ عينات (1.2: 1 تنظيف حبات لعينة نسبة أمر بالغ الأهمية لإزالة الحمض النووي الذي هو أقصر من 200 زوج قاعدي). الماصة لخلط لمدة 20 ثانية.
  4. و resuspend تنظيف الخرز على محور دوار مصغرة أنبوب في تحديد سرعة 15 لمدة 3 دقائق على RT. تدور لفترة وجيزة الأنابيب.
  5. وضع أنابيب على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.الماصة قبالة وتجاهل طاف.
    ملاحظة: لا تستخدم الشفط في هذا القسم لأنها سوف تمتص حبات التنظيف.
  6. إضافة 400 ميكرولتر من تقدم طازجة RT 70٪ من الإيثانول على كل عينة أثناء وجودهم على الرف المغناطيسي. لا تخلط. نضح طاف. كرر 2X.
  7. تجف حبات تنظيف لمدة 10 دقيقة في RT. وهذا اللون من الخرز بدوره الظلام إلى الشقوق البني والصغيرة جدا الخفيفة ستكون مرئية في بيليه الراتنج عندما حبات جافة.
  8. إلى أزل الحمض النووي، وإضافة 40 ميكرولتر 10MM تريس (7.5 درجة الحموضة). الماصة جيدا لخلط لمدة 20 ثانية.
  9. وضع العينات على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. ببطء الماصة ونقل 36 ميكرولتر شطافة مباشرة إلى 0.3 مل أنابيب PCR.
  10. الانتقال مباشرة إلى تفاعل PCR أو تخزين eluates في -20 مئوية.

يوم 4: PCR وجل تحليل

23. PCR

  1. ملء الحسابات مزيج الرئيسي PCR (الجدول 22). جعل مزيج PCR. الماصة بلطف جدا لخلط لتجنبفقاعات.
  2. إضافة 14 ميكرولتر من PCR مزيج لكل عينة DNA 36 ميكرولتر. الماصة إلى المزيج. الحفاظ على عينات على الجليد حتى جاهزة للوضع في Thermocycler.
  3. لمراقبة إيجابية PCR، وتشمل مكتبة معدة مسبقا. للسيطرة PCR سلبية، وتشمل المياه. عينات تشغيل في Thermocycler باستخدام برنامج PCR (الجدول 23).

24. جل إعداد والحمض النووي الختان، والتخيل

  1. تماما نظيفة وشطف مربع هلام حجم مناسب مع الماء منزوع الأيونات. إعداد agarose هلام 1.5٪ (التي تحتوي على 0.5 ملغ / مل إيثيديوم بروميد) مع سميكة مشط، في جميع أنحاء البئر التي يمكن أن تعقد 60 ميكرولتر.
    ملاحظة: بروميد إيثيديوم (EtBr) هي مادة مسرطنة ويجب التعامل معها بحذر.
  2. تدور باستمرار PCR أنابيب العينات لفترة وجيزة لجمع التكثيف.
  3. إضافة 1/5 حجم 6X صبغ زيلين الحمض النووي لعينة مجتمعة. لا تستخدم برموفينول الأزرق في صبغ الحمض النووي لأنه يهاجر في نفس الموقع مثل الحمض النووي عينة.
  4. تحميل كامل عينة كثافة العملياتس كل بئر، ويفضل أن يكون مع الآبار الفارغة بين العينات.
    يجب عدم تشغيل المكتبات بنفس الأرقام القياسية في نفس هلام: مذكرة.
  5. تحميل 7 ميكرولتر 100 سلم غليان على جانبي العينات. تشغيل هلام في 140 V لحوالي 30-45 دقيقة حتى صبغ برموفينول في سلم هو ¾ الطريق هلام.
  6. صورة وتصور هلام على نقل transilluminator في إعداد الأشعة فوق البنفسجية منخفضة. استئصال أجزاء من الاغاروز تحتوي على شظايا الحمض النووي 200-500 نقطة أساس. كن حذرا جدا لتجنب الاستغناء عن الفرقة محول ديمر الذي يمتد على 125 سنة مضت.
  7. وضع كل شريحة هلام رفعه في أنبوب 15 مل. رقم قياسي الوزن الصافي من كل شريحة هلام. أكتب هذا الوزن مباشرة على أنبوب.
  8. الصورة، حفظ، والحواشي هلام المستأصل لتأكيد الصحيح نطاق حجم المحدد.

25. جل تنقية

  1. تنقية الحمض النووي من شريحة هلام رفعه وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، مع إجراء التعديلات التالية.
  2. حل شريحة هلام بواسطة هزازفي RT على منصة هزاز. وسوف يستغرق حوالي 20 دقيقة إلى حل.
  3. للحصول على الحمض النووي عالي النقاء، وغسل الأعمدة مع 0.5 مل العازلة QG هلام بعد حل مر العمود.
  4. بعد غسل العازلة المؤسسة العامة، وترك الأعمدة الجلوس على RT لمدة 2-5 دقيقة. تدور لمدة 1 دقيقة في 13000 x ج في RT.
  5. للسماح للغرفة لمزيج الرئيسي تفاعل PCR، وعينات أزل مع 40 ميكرولتر EB العازلة في أنبوب 1.5 مل الطازجة.

26. الحمض النووي الكمي

  1. إعداد العينات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الجدول 24). عينات قياس في أداة المحدد مع أنابيب البصرية.
  2. بمجرد كميا المكتبات الشذرة إكسو، تقديم لتسلسل على منصة يستخدم التسلسل عن طريق التوليف الكيمياء 16 متوافق مع محولات الحمض النووي في هذا البروتوكول.
    ملاحظة: عادة، 2 ميكرولتر من عينة كافية لتقدير، ولكن أكثر قد يكون ضروريا إذا تركيز العينة أقل. الحمض النووي ينتج نموذجيمجموعة لاي بين 50 و 200 نانوغرام.
  3. بعد الكمي، وعينات مخزن في -20 مئوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتوضح الأرقام التالية نتائج ممثلة من بروتوكول الشذرة إكسو المقدمة هنا. وعلى النقيض من المنهجيات التقليدية رقاقة وما يليها مع بضع خطوات الأنزيمية، الشذرة إكسو يتطلب أحد عشر التفاعلات الأنزيمية التي تعتمد بشكل تسلسلي (الشكل 1). وبالتالي، يجب توخي الحذر في كل خطوة لضمان أن تتم إضافة كل عنصر رد فعل على مزيج رد فعل الماجستير الخاصة به. نوصي بإنشاء جدول صيغية تعتمد على الجداول رد فعل لأداء العمليات الحسابية مزيج رد فعل سيد تلقائيا، طباعة الجداول الناتجة، ومن ثم التحقق من كل بند بعد إضافته إلى مزيج الرئيسي.

نحن نوظف عددا من التدابير لمراقبة الجودة في جميع أنحاء بروتوكول لضمان الجودة العالية نتائج التسلسل (الشكل 2). كل رد فعل الشذرة يحتوي على ثلاثة عناصر أساسية هي: 1) sonicated استخراج لونين من خلايا intereش، 2) الأجسام المضادة الموجهة ضد البروتين من الفائدة، و3) ProteinG (أو ProteinA) الراتنج لشل حركة المركبات المناعية عجل. يمكن الحصول على جودة عالية sonicated مقتطفات لونين (الشكل 2A) تكون صعبة للغاية منذ يجب أن يكون الأمثل الظروف صوتنة لكل نوع من الخلايا وأداة صوتنة. ومن الجدير قضاء بعض الوقت لتحسين هذه الخطوة لأعلى المكتبات الجودة تبدأ نتيجة صوتنة أن ينتج شظايا الحمض النووي بين 100-500 سنة مضت (الشكل 2A، "+" حارة). منذ crosslinks الفورمالديهايد هي عطوب والفورمالديهايد نفسه لديه محدودة الجرف الحياة، ونحن استخدام الكهربي التحول التنقل فحص (الشكل 2A، "-" حارة) للتحقق من أن مستخلصات sonicated تحتوي سليمة crosslinks البروتين الحمض النووي، واضح كما فائقة تحول شظايا الحمض النووي. لتقييم إشارة الخلفية نقوم بشكل روتيني "وهمية" الشذرة أن يغفل الضد من رد فعل رقاقة. وذات جودة عالية رقاقة السابقينوس إعداد مكتبة لديها القليل جدا، إن وجدت، إشارة الخلفية في رقاقة "وهمية" ( "-") بالنسبة إلى الأجسام المضادة شرائح محددة، في هذه الحالة موجهة ضد بول الثاني. كما رأينا في الشكل 2B، المكتبات التقليدية رقاقة وما يليها يكون أكبر بكثير إشارة الخلفية من الشذرة إكسو. وأخيرا، قبل التسلسل، الشذرة إكسو جودة مكتبة يتم تقييمها على bioanalyzer (الشكل 2C - D). تحليل يقيس بدقة حجم التوزيع مكتبة وبالكشف عن تلويث dimers محول (الرمز بواسطة السهم) التي تعمل في 125 نقطة أساس. إذا dimers محول موجودة، إلا أنها تقلل من عرض النطاق الترددي التسلسل. ولذلك، فإننا نوصي تنظيف حبة إضافية من شأنها ان تزيل بكفاءة الحمض النووي شظايا أقل من 200 نقطة أساس.

الشذرة إكسو هي قوية وظيفية تقنية الجينومية لأنه هو الأسلوب الوحيد القادر على حل مكانيا متباينة، وبدء وتوقف، والتمطيط RNA البلمرة الثاني سنا على نطاق واسع الجينوم (الشكل 3) 11. منذ هذه الأحداث ملزمة المجاورة هي عشرات من أزواج القواعد على حدة، رقاقة وما يليها غير قادر على التمييز بين هذه الأحداث ملزمة بحل السلطة من عدة مئات من أزواج قاعدة.

شكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي-إكسو رقاقة. بعد الشذرة، هو ligated محول P7 إلى حدود صوتنة. امدا نوكلياز خارجية ثم الديكورات الحمض النووي 5 'إلى 3' إلى نقطة تشعبي، وبالتالي البصمة التفاعل البروتين الحمض النووي. بعد شطف وتشعبي عكس، تمديد التمهيدي يجمع الحمض النووي على الوجهين. وأخيرا، ربط محول P5 علامات الحدود نوكلياز خارجية اليسرى واليمنى ويخضع المكتبة مما أدى إلى التسلسل الإنتاجية العالية. رسم خرائط ينتهي 5 'من تسلسل العبارات التي الجينوم مرجعية ترسم حاجز نوكلياز خارجية، وبالتالي الموقع الدقيق البروتينات والحمض النووييشابك. الرقم تعديل من ري وبف 17. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الشذرة إكسو ضبط الجودة. لوحات AC تظهر نتائج ممثلة من التجارب غير ذات صلة. (أ) يتم تقييم نوعية للاستخراج لونين sonicated (من خط الخلايا السرطانية HCC1806 الثدي البشري) من قبل الكهربائي للهلام الاغاروز على مقتطفات مع (+) وبدون (-) للcrosslinks عكسه. سوف crosslinks سليمة يسبب البروتين المجمعات الحمض النووي للهجرة أبطأ. وبالتالي، تشغيل استخراج دون crosslinks عكس (-) يسمح للجودة crosslinks الفورمالديهايد على أن يقسم، التي تعتبر بالغة الأهمية لرقاقة ناجحة. (ب) مقارنة بين الملكية الفكرية وهمية (-) لالثانية بول الثاني (+) الشذرة إكسو ورقاقة وما يليها الاستعدادات المكتبة بعد 21 دورات PCR التضخيم. بعد PCR، شظايا الحمض النووي يتم استئصال 200-500 سنة مضت (الرمز بواسطة مربع المجزأة الأحمر) وتنقيته باستخدام مجموعة استخراج الهلام. (CD) في لوحة C، يمثل أثر كبير على أثر المثالي من مكتبة المجمعة (P1)، ويظهر أثر السفلي مكتبة المجمعة (P2) الذي يحتوي على dimers محول. يظهر لوحة D مؤامرة كثافة الحمض النووي المقابلة لآثار مكتبة P1-2 من لوحة C (السهم يدل على الفرقة ديمر محول). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): الشذرة إكسو اطلاعه مكانيا مميز ثنائي الاتجاه النسخ بدء المجمعات. (أ) توزيع ممهدة من حبلا separatإد الشذرة إكسو بطاقة 5 'ينتهي لبول الثاني، TFIIB، وTBP في الجين RPS12 البشري في المتكاثرة K562 الخلايا. (ب) بلغ متوسط أنماط الشذرة إكسو حول أقرب TSS RefSeq. تم محاذاة علامات ذروة-الزوج إلى TSS الجينات بواسطة الجينات، اهمال في عدم تداخل فترات 10bp النسبية لخدمات الدعم التقني، ومن ثم متوسط ​​ذروة زوج قيمة الكثافة في جميع TFIIB المحتلة (ن = 6511) وتآمر الجينات كما في المئة من المجموع. و"المسامير" من TBP وTFIIB هي غير مدرك (إزاحة رأسية في الشكل). (ج) نموذج استنادا إلى بيانات لوحة B، توضح المجمعات بدء النسخ متميزة حلها عن طريق رقاقة-إكسو (تتبع السوداء). بول الثاني احتل موقعين للحل المنفصلة التي تزامنت مع مواقع متباينة بدء النسخ ( "متباعد") والمواقع "وقفة". هذا الانفصال المكاني واضح للبول المجمعات الثاني يشير إلى أن النصوص المتباينة تنشأ من المجمعات بدء متميزة. غالبية بول واسعة الثاني أبو crosslinked التحرير 50 ​​نقطة المصب من خدمات الدعم التقني في موقع "وقفة"، حيث من المتوقع أن نتوقف بعد بدء النسخ. بول الثاني كان الأكثر استنزاف 20-60 سنة مضت المنبع من خدمات الدعم التقني حيث قبل بدء معقدة ( "PIC") أشكال، تشير إلى أنه في المتوسط ​​من المحتمل يقضي وقتا أقل هناك من في مواقع متوقفة مؤقتا. وهذا يشير إلى أنه في معظم (ولكن ليس بالضرورة جميع) حالات، مرة واحدة يتم تجنيده بول الثاني، فإنه يزيل بسرعة المروج ويفترض توقف للدولة ما يقرب من 30 - 50 بي بي المصب من خدمات الدعم التقني، بما يتفق مع ملاحظة أن الإفراج بول الثاني وقفة هو والحد من معدل خطوة في النسخ. هذه المجمعات بدء المجاورة هي غير القابلة للحل عن طريق رقاقة وما يليها (يتضح من أثر ملء الرمادي) منذ قرارها يقتصر على بضع مئات من أزواج قاعدة. الرقم تعديل من بف وVenters 11. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ontent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> التكميلي ملف 1: معلومات إضافية الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

كاشف الحجم (مل) [نهائي]
1 M HEPES-KOH (7.5 درجة الحموضة) 50 50 ملي
5 M كلوريد الصوديوم 28 140 ملي
0.5 M EDTA 2 1 ملم
100٪ الجلسرين 100 10٪
10٪ NP40 50 0.50٪
10٪ تريتون X100 25 0.25٪
ده 2 O ملء إلى 1 L

الجدول 1. وصفة لالاحتياطي تحلل 1. تصفية باستخدام 0.22 ميكرون فلتر. متجر في 50 مل أنابيب في 4 ج. إضافة 100 ميكرولتر الأسهم مؤشر أسعار المستهلك إلى 50 مل من العازلة فقط قبل استخدامها.

كاشف الحجم (مل) [نهائي]
1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8) 10 10 ملي
5 M كلوريد الصوديوم 40 200 ملي
0.5 M EDTA 2 1 ملم
0.5 M EGTA 1 0.5 ملم
ده2 O ملء إلى 1 L

الجدول 2. وصفة للتحلل العازلة 2. تصفية باستخدام 0.22 ميكرون فلتر. متجر في 50 مل أنابيب في 4 ج. إضافة 100 ميكرولتر الأسهم مؤشر أسعار المستهلك إلى 50 مل من العازلة فقط قبل استخدامها.

كاشف الحجم (مل) [نهائي]
1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8) 10 10 ملي
5 M كلوريد الصوديوم 20 100 ملي
0.5 M EDTA 2 1 ملم
0.5 M EGTA 1 0.5 ملم
10٪ Deoxycholate 10 0.10٪
5 ز 0.5٪ (ث / ت)
ده 2 O ملء إلى 1 L

الجدول 3. وصفة لالاحتياطي تحلل 3. تصفية باستخدام 0.22 ميكرون فلتر. متجر في 50 مل أنابيب في 4 ج. إضافة 100 ميكرولتر الأسهم مؤشر أسعار المستهلك إلى 50 مل من العازلة فقط قبل استخدامها.

كاشف الحجم (مل) [نهائي]
10X برنامج تلفزيوني 50 1X
ألبومين المصل البقري 2.5 غرام 0.50٪
ده 2 O ملء 500

الجدول 4. وصفة لحجب العازلة. تصفية باستخدام 0.22 ميكرون فلتر. متجر في 50 مل أنابيب في 4 ج. إضافة 100 ميكرولتر الأسهم مؤشر أسعار المستهلك إلى 50 مل من العازلة فقط قبل استخدامها.

كاشف الحجم (مل) [نهائي]
1 M HEPES (7.5 درجة الحموضة) 25 50 ملي
0.5 M EDTA (درجة الحموضة 8) 1 1 ملم
10٪ الصوديوم Deoxycholate 35 0.70٪
10٪ NP40 50 1٪
1 M LiCl 250 500 ملي
ده 2 O ملء 500
محتوى "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "FO: المحافظة على مع next.within صفحة =" دائما ">

الجدول 5. وصفة لRIPA العازلة. تصفية باستخدام 0.22 ميكرون فلتر. متجر في 50 مل أنابيب في 4 ج. إضافة 100 ميكرولتر الأسهم مؤشر أسعار المستهلك إلى 50 مل من العازلة فقط قبل استخدامها.

كاشف الحجم (مل) [نهائي]
1 M تريس الكلورين (7.5 درجة الحموضة) 2.5 50 ملي
0.5 M EDTA 1 10 ملي
20٪ SDS 2.5 1٪
ده 2 O ملء 50

الجدول 6. وصفة لرقاقة شطف العازلة. تصفية باستخدام 0.22 ميكرون فلتر. تخزين في RT.

. في غضون الصفحات = "1" FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">
كاشف الحجم (مل) [نهائي]
1 M تريس الكلورين (7.5 درجة الحموضة) 0.5 10 ملي
ده 2 O ملء 50

الجدول 7. وصفة لTE العازلة. تصفية باستخدام 0.22 ميكرون فلتر. تخزين في 4 ج.

الحجم (ميكرولتر) [نهائي]
100 ميكرومتر ExA2 إلى التاسع 75 15 ميكرومتر
100 ميكرومتر ExA2-33 75 15 ميكرومتر
1 M تريس (7.5 درجة الحموضة) 50 100 ملي
5 M كلوريد الصوديوم 5 50 ملي
ده 2 O 295 -
الحجم الكلي 500

الجدول 8. مزيج P7 محول التليين.

الجدول 9. مزيج P5 محول التليين.

الحجم (ميكرولتر) [نهائي]
100 ميكرومتر ExA1-58 75 15 ميكرومتر
100 ميكرومتر ExA1-13 75 15 ميكرومتر
1 M تريس (7.5 درجة الحموضة) 50 100 ملي
5 M كلوريد الصوديوم 5 50 ملي
ده 2 O 295 -
الحجم الكلي 500
درجة الحرارة (C) مرة
95 5 دقائق
72 5 دقائق
65-60 انخفاض المنحدر 5 دقائق
55-50 انخفاض المنحدر 3 دقيقة
45-40 انخفاض المنحدر 3 دقيقة
30 3 دقيقة
20 3 دقيقة
10 3 دقيقة
4 إلى الأبد

الجدول 10. محول برنامج التليين.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 39.8
10X العازلة رد فعل 2 5 1X
100 ميكرومتر ATP 0.5 1 ملم
3 ملي dNTPs 1.7 100 ميكرومتر
3 U / ميكرولتر بوليميريز T4 1 3 U
5 U / ميكرولتر Klenow 1 5 U
10 U / ميكرولتر T4 كيناز عديد النوكليوتيد 1 10 U
إجمالي حجم رد الفعل 50

الجدول مزيج الرئيسي 11. تلميع.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 42.3
10X العازلة رد فعل 2 5 1X
3 ملي dATP 1.7 100 ميكرومتر
5 U / ميكرولتر Klenow 3'-5 "ناقص إكسو 1 5 U
إجمالي حجم رد الفعل 50

الجدول 12. A-المخلفات مزيج الرئيسي.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 41
100 ملي اعبي التنس المحترفين 0.5 1 ملم
10X العازلة رد فعل 2 5 1X
400 U / ميكرولتر T4 DNA الممتازبورصة عمان 1.5 600 U
حجم مزيج رد فعل 48
15 محول مؤشر ملي 2 30 picomoles
إجمالي حجم رد الفعل 50

الجدول 13. مزيج الرئيسي P7 محول ربط.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 41
10X Φ 29 العازلة 5 1X
3 ملي dNTPs 2.5 150 ميكرومتر
10 U / ميكرولتر Φ 29 البلمرة 1.5 15 U
إجمالي حجم رد الفعل 50

الجدول 14. Φ 29 نيك مزيج إصلاح الرئيسي.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 43.5
100 ملي اعبي التنس المحترفين 0.5 1 ملم
10X العازلة رد فعل 2 5 1X
10 U / ميكرولتر T4 كيناز عديد النوكليوتيد 1 10 U
إجمالي حجم رد الفعل 50

الجدول 15. كيناز مزيج رد الفعل الرئيسي.

1X (&# 956؛ ل) [نهائي]
ده 2 O 43
10X امدا العازلة 5 1X
5 U / ميكرولتر امدا نوكلياز خارجية 2 10 U
إجمالي حجم رد الفعل 50

الجدول 16. امدا نوكلياز خارجية ردود الفعل مزيج الرئيسي.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 44
10X العازلة رد فعل 2 5 1X
30 U / ميكرولتر RecJ و نوكلياز خارجية 1 30 U
مجموع رد فعل ضدolume 50

الجدول 17. RecJ و نوكلياز مزيج رد الفعل الرئيسي.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 6.45
10X Φ 29 العازلة 2 1X
3 ملي dNTP 1.3 200 ميكرومتر
20 ميكرومتر P7 التمهيدي 0.25 0.25 ميكرومتر
حجم مزيج رد فعل 10
ETOH عينة عجلت 10
إجمالي حجم رد الفعل 20

الجدول 18. P7التمهيدي مزيج الرئيسي تمديد رد الفعل.

درجة الحرارة (C) مرة
95 5 دقائق
65 5 دقائق
30 2 دقيقة
30 عقد حتى يضاف Φ 29
30 20 دقيقة
65 10 دقائق
4 إلى الأبد

الجدول 19. برنامج P7 التمهيدي التمديد.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 5
3 1X
3 ملي dATP 1 0.1 ملم
5 U / ميكرولتر Klenow 3 'إلى 5' إكسو ناقص 1 5 U
حجم مزيج رد فعل 10
عينة طويلة التمهيدي 20
إجمالي حجم رد الفعل 30

الجدول 20. A-المخلفات مزيج الرئيسي.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
ده 2 O 11.5
10X T4 يغاز العازلة 5 1X
15 ميكرومتر ExA1-58 /13 محول 2 30 picomoles
400 U / ميكرولتر T4 DNA يغاز 1.5 600 U
حجم مزيج رد فعل 20
A-الذيل عينة 30
إجمالي حجم رد الفعل 50

الجدول 21. مزيج الرئيسي P5 محول ربط.

1X (ميكرولتر) [نهائي]
5X PCR العازلة 10 1X (2 مم MgCl 2)
10 ملم من كل dNTP 1 200 ميكرومتر كل
20 ميكرومتر P1.3 التمهيدي 1.25 0.5 ميكرومتر
20 ميكرومتر P2.1 التمهيدي 1.25 0.5 ميكرومتر
البلمرة 2 U / ميكرولتر بداية ساخنة 0.5 1 U
حجم مزيج رد فعل 14
حبة عينة مزال 36
إجمالي حجم رد الفعل 50

الجدول 22. PCR.

<TR>
درجة الحرارة (C) مرة دورات
98 30 ثانية 1
98 10 ثانية 15-21 (اعتمادا على كفاءة رقاقة)
52 30 ثانية
72 20 ثانية
72 2 دقيقة 1
4 إلى الأبد عقد

الجدول 23. برنامج PCR.

في الحمض النووي قياسي (ميكرولتر) لكل عينة (ميكرولتر)
1: 200 المخفف عازلة / مزيج صبغ 190 198
معايير الحمض النووي 10
مكتبة الشذرة إكسو 2
الحجم الكلي 200 200

الجدول 24. الكمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم بروتوكول الجيني وظيفية لتحديد موقع ملزم دقيق لونين تتفاعل البروتينات بطريقة غير متحيزة، على نطاق الجينوم في القريب قرار الزوج القاعدة. الخطوة الأكثر أهمية لتحقيق قرب قاعدة قرار التعيين الزوج هو العلاج نوكلياز خارجية من الحمض النووي المخصب الشذرة في حين لا يزال immunoprecipitate على الراتنج المغناطيسي. ظاهريا، يمكن أن بروتين المجمعات يحتمل أن يعثرا في الجسم الحي البصمة من أي فرعية معينة (على سبيل المثال، المجمعات إعادة عرض لونين أو الجسيمات الأساسية النيوكليوسومات). لكن، وكما ذكرت سابقا 10، منذ الفورمالديهايد هو crosslinker غير فعالة، يصبح من المرجح بشكل متزايد أن مفارز متعددة من مجمع أن تشعبي إلى الحمض النووي وبعضها البعض في نفس الخلية في نفس الموضع. وهكذا، في البصمة فيفو مفارز الفردية للمجمع البروتين، مثل مفارز هيستون الفردية لجسيم نووي، غير ممكن مع رقاقة-إكسو.

ر "> ومن أهم ميزات من الشذرة إكسو هي قرارها الزوج بالقرب من قاعدة وخلفية منخفضة. ويسمح فائقة الدقة رؤى الهيكلية والمكانية مفصلة ليكون على نطاق الجينوم واسعة ليست حاليا ممكن مع أي وسيلة أخرى ومن ناحية أخرى، فإن الحد الأساسي من الشذرة إكسو هو أنه منهجية البيولوجيا الجزيئية تحديا تقنيا لإتقان. وبالإضافة إلى ذلك، تنطبق القيود العامة للخطوة الشذرة أيضا إلى الشذرة إكسو (على سبيل المثال، توفر الأجسام المضادة التجاري وخصوصية ، حاتمة الوصول، وعدد كبير نسبيا من الخلايا المطلوبة). تشمل المخاطر الشائعة سوء نوعية مقتطفات sonicated، وذلك باستخدام الصف الأجسام المضادة غير رقاقة، وليس الاحتفاظ بعينات على الجليد قدر الإمكان. وهكذا، وظروف صوتنة يجب أن يكون الأمثل بعناية وكل الأجسام المضادة التحقق من صحتها كما سبق وصفها 18 إلى تجنب الآثار الضارة هذه المعايير يمكن أن تترتب على نتائج تجريبية.

بقدر ما أو إلى هذا الحدعمق التسلسل لهدف عامل النسخ، ونحن نهدف عادة لحوالي 20 مليون الانحياز فريد يقرأ. حيث توزع بول الثاني والتعديلات هيستون على نطاق أوسع، ونحن نهدف ل30-50٬000٬000 يقرأ. ومن المهم أن نلاحظ أنه منذ الشذرة إكسو ديه خلفية أقل بكثير من رقاقة وما يليها، أقل يقرأ المطلوبة لتحقيق عمق تسلسل مماثل.

ويجري الآن اعتمدت تكنولوجيا رقاقة-إكسو على نطاق واسع على الرغم من التحديات التقنية، كما لا تزال تنشر 17،19،20 اختلافات قوية على البروتوكول الأصلي. على وجه الخصوص، وتسمى إحدى الأشكال التي قد تكون مفيدة للالصعب البروتينات رقاقة الشذرة العلاقة، والذي يستخدم خطوة ربط واحدة لزيادة كفاءة إعداد مكتبة 20. وباختصار، الشذرة إكسو هو المنهجية المستخدمة وقوية على نحو متزايد لرسم الخرائط قرار فائقة من البروتينات الكروماتين التفاعل على نطاق عالمي. وبما أن قائمة المتاحة تجاريا النمل رقاقة الصفتواصل ibodies في النمو، وسيتم توجيه التطبيقات المستقبلية لمنهجية الشذرة إكسو في شبكات الجينات التنظيمية مجهولة رسم الخرائط لفهم دوائر الجزيئية للخلية في فائقة الدقة. وبالإضافة إلى ذلك، من المرجح أن تكون الشذرة إكسو مزيد من الصقل وتكييفها مع البصمة في الجسم الحي تفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي في القريب قرار الزوج القاعدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules ThermoFisher Scientific 28908 Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) Roche Life Science 11873580001 Sections 4, 8
Bioruptor sonicator Diagenode UCD200 Section 5
15 ml polystyrene tubes BD Falcon 352095 Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads GE Healthcare 28-9670-66 Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack Invitrogen 12321D Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 05-450-127 Sections 7, 22
T4 DNA Polymerase New England BioLabs M0203 Section 9
DNA Polymerase I, Klenow New England BioLabs M0210 Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) New England BioLabs B7002 Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C Eppendorf 5382 Sections 9-16
ATP Roche Life Science 010419979001 Sections 9, 11, 13
dNTPs New England BioLabs N0447 Sections 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201 Sections 9, 13
dATP New England BioLabs N0440 Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus New England BioLabs M0212 Sections 10, 20
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202 Sections 11, 21
Φ-29 DNA Polymerase New England BioLabs M0269 Sections 12, 19
10x Φ-29 Buffer New England BioLabs B0269 Sections 12, 19
Lambda Exonuclease New England BioLabs M0262 Section 14
10x Lambda Buffer New England BioLabs B0262 Section 14
RecJf Exonuclease New England BioLabs M0264 Section 15
Proteinase K Roche Life Science 03115828001 Section 16
Glycogen Roche Life Science 010901393001 Section 18
10x T4 Ligase Buffer New England BioLabs B0202 Section 21
AMPure XP (clean up) beads  Beckman Coulter A63881 Section 22
Q5 Hot Start DNA Polymerase  New England BioLabs M0493 Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) New England BioLabs B9027 Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Section 25
Qubit Fluorometer Invitrogen Q33216 Section 26
Optical Clear Qubit tubes  Invitrogen Q32856 Section 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit Invitrogen Q32851 Section 26

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 118، الشذرة إكسو، رقاقة وما يليها، رقاقة، النسخ، تنظيم الجينات، لونين، علم التخلق، عوامل النسخ، والبيولوجيا الجزيئية
أسلوب الشذرة إكسو: تحديد التفاعلات البروتين الحمض النووي مع قرب قاعدة زوج الدقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perreault, A. A., Venters, B. J. The … More

Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. J. Vis. Exp. (118), e55016, doi:10.3791/55016 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter