Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/55016
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Abstract

Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) epigenetik ve spesifik protein-DNA etkileşimlerini izolatlarının gen regülasyonu alanlarında vazgeçilmez bir araçtır. Yüksek verimli sekanslama (Chip seq) bağlı ChIP yaygın kromatin etkileşim proteinlerin genomik konumunu belirlemek için kullanılır. Ancak, ChIP-seq birkaç yüz baz çifti nispeten düşük haritalama çözünürlük ve yüksek arka plan sinyali tarafından engellenmektedir. ChIP-ekzo yöntemi esas çözünürlük ve gürültü hem geliştirir ChIP-seq bir rafine versiyonu. ChIP-ekzo metodolojisinin kilit ayrım etkili bir sol ayak izini kütüphane hazırlık iş akışında lambda eksonükleaz sindirim birleşme ve protein-DNA çapraz sitenin sağ 5 'DNA sınırları olduğunu. ChIP-ekso diziler daha sonra, yüksek sekanslama tabi tutulur. Elde edilen veriler fonksiyonel organizasyon o içine eşsiz ve ultra-yüksek çözünürlüklü bir anlayış sağlamak için kaldıraçlı olabilirgenom f. Burada, biz optimize edilmiş ve memeli sistemlerinde ve yeni nesil dizileme-by-sentez platformu için aerodinamik olan ChIP-exo yöntem açıklanmaktadır.

Introduction

Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) seçici canlı hücreler belirli bir protein ile etkileşime DNA fragmanlarının için zenginleştirerek gen regülasyonu mekanizmaları incelemek için güçlü bir yöntemdir. Teknolojisi, yüksek verimlilik sıralaması (ChIP-seq) 1 ila oligonükleotid array (ChIP-chip) üzerine melezleşme tek bir lokus (standart ChIP-qPCR) tespiti itibaren, iyileştikçe ChIP zenginleştirilmiş DNA parçalarının tespit yöntemleri geliştirmişlerdir. ChIP-seq yaygın bir uygulama, kromatin heterojeniteyi ve nonspesifik DNA etkileşimleri gördü rağmen yanlış pozitif ve kesin olmayan eşleme önde gelen veri kalitesi engel olmuştur. Bu sınırlamaları aşmak için, Dr. Frank Pugh ChIP-ekzo yöntemi 2 geliştirdi. ChIP-ekso belirgin özelliği etkin yerleri bağlayıcı transkripsiyon faktörü ayak izi, ekzonükleaz 'ila 3' 5 sahip olmasıdır. Sonuç olarak, ChIP-exo metodolojisi daha yüksek çözünürlük, gözetleme daha dinamik aralık elden ve alt arka plan gürültü.

ChIP-exo daha teknik açıdan zor ChIP-seq daha usta olmasına rağmen çalışmalar çeşitli biyolojik sistemler 3-8 kullanarak benzersiz ultra yüksek çözünürlüklü anlayışlar kazanmak amacı olarak, yaygın olarak kabul ediliyor. Gerçekten de, yonga-ekso başarılı bakteri, maya, fare, sıçan ve insan hücre sistemlerine uygulanmıştır. Prensip kanıtı olarak, ChIP-exo başlangıçta maya transkripsiyon bir avuç 2 faktörleri için kesin bağlayıcı motifi tanımlamak için kullanıldı. Bu teknik aynı zamanda, transkripsiyon, ön başlatma kompleksinin organizasyonunu çalışma ve çeşitli histon 9,10 subnucleosomal yapısını çözmek için maya kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, insan rehberleri etkinliklerde bağlama bitişik TFIIB ve Pol II gidermek için ChIP-exo kaldıraçlı ve farklı başlangıç 11 kompleksleri gelen yaygın farklı transkripsiyon ortaya gösterdi.

Burada sunulan iş akışı optimize ve sMemeli ChIP-ekso (Şekil 1) için treamlined. İlk olarak, canlı birincil ya da doku kültürü hücreleri, bir kovalent çapraz bağlanırlar in vivo protein-DNA etkileşim bölgesindeki korumak için formaldehit ile muamele edilir. Hücreler parçalanır ve kromatin ~ 100 makaslanmış - 500 baz çifti boyutu fragmanları. ChIP sonra seçici ilgili protein çapraz bağlanmış DNA parçaları için zenginleştirir. Bu noktada, yonga-DİZİ kütüphaneler doğal birkaç yüz baz çifti ortalama fragman büyüklüğü algılama çözünürlüğünü sınırlar hazırlanır. Ancak, ChIP-exo sol ve lambda eksonükleaz ile protein-DNA çapraz sitenin sağ 5 'DNA sınırları kırparak bu sınırlama üstesinden gelir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Ardışık kütüphaneleri eksonükleaz ile sindirilmiş DNA inşa edilir. Elde edilen iç içe geçmiş 5 'sınırları protein-DNA etkileşim (Şekil 1, aşama 14), bir in vivo ayak izi temsil eder ve yüksek sekanslama ile tespit edilir. Although ChIP-ekzo metodolojisi ChIP-seq daha katılır, çoğu adımlar arasındaki geçişler örnek kaybı ve deneysel değişkenliği en aza indirir basit boncuk yıkama gerektirir. Önemlisi, ChIP-ekzo ChIP-seq, aynı zamanda ChIP-exo başarılı olmalıdır ChIP-seq ile başarılı herhangi bir örnek bir rafine versiyonu beri.

ChIP-seq bir temelde farklı bir veri yapısında ChIP-ekzo sonuçları ile protein-DNA etkileşimleri in vivo ayak izi. Ortak ChIP-seq arayanlar en hassas zirve aramaları elde etmek için, ChIP-ekzo verilerine tatbik edilebilir ancak biz özellikle akılda ChIP-ekzo verilerin benzersiz yapısı ile tasarlanmış biyoinformatik araçlar öneriyoruz. Bunlar Genetrack, GEM, OKVO, Peakzilla ve ExoProfiler 12-15 arasındadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Çift distile H 2 O veya moleküler sınıf eşdeğer tüm tamponlar ve reaksiyonlar karışımları için tavsiye edilir.

Gün 0: Malzeme Hazırlama ve Hücre Hasat

1. Tampon Hazırlama

  1. 3 (Tablo 1 - 3 -) Lizis Tampon 1 hazırlanması ve kullanımdan hemen önce, her tampon, 50 ml 100 ul tam proteaz inhibitör stokları (CPI) ekleyin. Bir tablet 1 mL moleküler sınıf H 2 O eriterek TÜFE stok hazırlayın
  2. ChIP Tamponlar (- 7 Tablo 4) hazırlayın. Engelleme ve RIPA tampon, 50 ml 100 ul CPI stok ekleyin. Tris ve ChIP Elüsyon tamponlar TÜFE katmayın.

Adaptör oligonükleotid 2. Tavlama

Not: Belirli oligonükleotid dizileri Ek Bilgiler Bölümünde bulunabilir.

  1. Adaptör Tavlama karışımları (- 9 Tablo 8) hazırlayın. karıştırmak için girdap ve kısacaiçeriğini toplamak için tüpler dönerler. Kısım 0.5 ml tüpler her bir karışımı, 100 ul.
  2. Termosikler programı (Tablo 10) çalıştırarak oligonükleotitleri melezleşme.
    Mağaza -80 ° C oligonükleotidler tavlanmış.

Formaldehit ile Vivo Kromatin çapraz bağlama 3.

Not: Tipik ChIP deneme için, başlangıç ​​malzemesi, yaklaşık 50.000.000 hücre içermelidir.

  1. tamponlu salin fosfat taze% 37 metanol-serbest formaldehid hazır solüsyonu (PBS),% 1 (h / h), iyice karıştırın ve 10 dakika için oda sıcaklığında bekletin bir son konsantrasyona kadar hücre kültürü yıkanmıştır.
    Not: Örneğin, tipik olarak oda sıcaklığında 50 ml PBS hücrelere 1.4 mi,% 37 metanol-serbest formaldehit ekleyin. medyada proteinler formaldehit bazı gidermek beri Ayrıca, medyada çapraz bağlama formaldehit kaçının.
  2. 2.5 M glisinin eklenmesi ile bağlanma reaksiyonunu söndürün125 mM'lik bir son konsantrasyon elde e. İyice karıştırın.
  3. Buz üzerinde 50 ml tüp hücreleri aktarın. 4 ° C'de 1000 x g'de 5 dakika boyunca hücreler dönerler. Decant süpernatant.
  4. pipetleme hücre peleti tekrar süspansiyon 1 mi buz gibi soğuk 1 x PBS ekleyin. 1.5 ml tüp aktarın.
  5. 4 ° C'de 2,000 x g'de 3 dakika boyunca hücreler dönerler. Süpernatant aspire.
  6. Hemen sıvı nitrojen ile 1.5 ml tüpler içinde hücre pelletleri dondurmak yanıp söner. -80 ° C'de saklayın. Çapraz bağlı hücreler, -80 ° C'de süresiz stabildir.

1. Gün: Hücre Lizis, Sonication ve ChIP

4. Hücre Liziz

NOT: Tüm hücre parçalama bölümleri sırasında numuneler çapraz ters en aza indirmek için buz üzerinde veya 4 ° C'de muhafaza GEREKIR.

  1. Kısaca çapraz hücre pelet Çözülme. İyice 0.5 ml lisiz tamponu 1 her pelet tekrar süspansiyon ve 15 ml polistiren bir tüp içinde 4.5 ml lisiz tamponu 1 ile birleştirir.
  2. 4 ° C'de 10 dakika süre ile kaya borularsallanan bir platform üzerinde için. 4 ° C'de 2,000 x g'de, 4 dakika boyunca spin. Decant süpernatant.
  3. İyice 0.5 ml lisiz tamponu 2 her pelet tekrar süspansiyon ve 4.5 ml lisiz tamponu 2 kez yeniden süspansiyon haline ekleyin.
  4. sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de 5 dakika boyunca sallayın. 4 ° C'de 2,000 x g'de 5 dakika boyunca spin. kağıt havlu üzerine aşırı dokunun yavaşça süpernatant süzün ve.
  5. İyice 0.5 ml Lizis Tampon 3 her pelletini ve 1 ml Lizis Tampon 3 kez yeniden süspanse ekleyin. buz üzerinde nükleer lizatları tutmak ve hemen sonikasyon geçin.

Nükleer Lisatlar 5. Sonikasyon

NOT: Tüm sonikasyon bölümleri sırasında numuneler çapraz ters en aza indirmek için buz üzerinde tutulmalıdır. Aşağıdaki protokol ile birlikte kullanılan sonikatör belirli bir modeli Malzeme Tablo bulunabilir. Belirli sonikatör kullanımı ve diğer enstrümanlar için kılavuzlar ilgili ayrıntılar Ek Bilgiler Bölümünde bulunabilir.

  1. plNükleer özleri içeren 15 ml polistiren tüplerde ace rezonans adaptörleri (metalik çubuk tüp duvar temas etmemelidir).
  2. orta güçte / 30 sn KAPALI AÇIK 30 saniye ile 2 x 15 dakika oturumları için bir buz soğuk su banyosunda sonikasyon nükleer lizatları. Sadece bir seferde iki 15 ml tüpler ses dalgalarına maruz. Bu ayarlar, hücre hatları ve primer hücre tiplerinin geniş bir aralığı üzerinde çalışır, ancak kromatin kesme eksik olduğu takdirde daha fazla optimizasyon ihtiyacı olabilir.
  3. 1.5 ml tüpler içine lizat sonikasyon sonuçlarını transfer 2 x 10 ul örnekleri kontrol etmek için.
    1. çapraz bağlantılar tersine çevirmek için, 10 ul TE-RNaz A ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe Proteinaz K 0.2 ul ilk 10 ul tablet birleştirir. 4 ul 6x iksilen DNA boyası ekleyin.
    2. çapraz bağlantılar korumak için, 2 ul 6x ksilen DNA boyası ile ikinci 10 ul tablet birleştirir.
    3. Yaklaşık 30 140 V% 1.5 agaroz jel üzerinde hem örnekleri çalıştırmak - merdiveni Bromophenol boya kadar 45 dakika ijel yol aşağı s ¾.
  4. sonikasyon Başarılı (100 kesilmiş çok DNA fragmanları - 500 bp) ise, aktarımı% 10 Triton X-100 150 ul ihtiva eden 2 ml tüplere lizatları sonike edilmiştir. Vortex karıştırın.
  5. çözünmeyen kromatin ve yıkıntıları pelet haline getirildi sıkma 4 ° C'de 20,000 x g'de 10 dakika süre ile, nükleer lizat sonike.
  6. Yeni 2 ml tüp süpernatant aktarın. süresiz -80 ° C'de ChIP veya mağaza örneklerinin hemen geçin. Sonikasyon ekstreleri dondurulmuş ve bir kereden fazla çözülmüş olmamalıdır.

Boncuk 6. Kavrama Antikor

NOT: paramparça ve arka plan sinyali artacaktır çünkü asla girdap ya da donma / manyetik boncuklar Çözülme.

  1. iyice 1.5 ml tüp içine boncuk bulamaç ul stok, kısım Y karıştırdıktan sonra burada Y = 1.1 x 2.5 ul x (ChIP örnek sayısı). 2.5 ul boncuk bulamaç için bağlama kapasitesi 13 ug IgG kadardır. toplanmış boncuklar 1 mi engelleme ile 3 kez yıkayınTampon.
  2. yıkamadan sonra boncuklar daha tutarlı aliquotting için Tamponu Engelleme 10x orijinal bulamaç hacminin (25 ul / ChIP) içinde tekrar süspansiyon boncuk. Kısım 1.5 ml tüpler içine ChIP numune başına 25 ul.
  3. tekrar süspansiyon boncuk kısım tekabül eden antikor 10 ug - 5 ekleyin. Bloklama Tamponu ile 250 ul son hacim getirin. 4 ° C'de (gece boyunca 16 saat, alternatif olarak) dönüşlü bir platform üstünde 4 saat inkübe edin.
  4. Süpernatant aspire. Bağlanmamış veya fazla antikorları ayıklamak için Bloklama Tamponu bir kez 1 mL boncuk yıkayın.
  5. Boncuk konjugatların: Son yıkama aspire hemen sonra, antikoru Sonikasyon ekstreleri (~ 1.6 mi) 50.000.000 hücre eşdeğerinin eklenmesi. sonike özler hazır değilseniz, Bloklama Tamponu 100 ul tekrar süspansiyon boncuk onlar hazır olana kadar. Boncuk, kuru asla izin için kritik öneme sahiptir.

7. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP)

  1. Her çips numunesi için, sonikasyon 1.5 mL kombined antikorla özler: boncuk konjugatları 1.5 ml veya 2 ml tüpler.
  2. 4 ° C'de 9 hız ayarında bir gecede (yaklaşık 16 saat) bir mini tüp rotator üzerinde inkübe edin. Numuneler sızıntı değildir ve düzgün karıştırma emin olmak için bir kaç dakika sonra kontrol edin.

2. Gün: ChIP yıkar ve enzimatik reaksiyonların On-reçine

8. ChIP yıkar

NOT: kısaca, çapraz kontaminasyonu minimize her yıkama arasında tüpleri döndürün. birinci aspirasyon için, her numune arasında ipuçları değişir. sonraki yıkama sırasında, aynı ucu o boncuk dokunmadı sürece kullanılabilir. Doğru ChIP yıkama ile ilgili talimatlar için Ek Bilgiler bölümüne bakınız.

  1. Çok kısa bir süre mıkro kullanarak tüpleri dönmeye (~ 500 xg'de 3 sn) kapaklar sıvıyı toplamak ve 1 dakika boyunca manyetik rafa koyun. Hala manyetik raf, aspirat özü üzerinde iken.
  2. Her tüpe 0.75 mL RIPA tamponu ekleyin. manyetik rafa tüpleri çıkarınve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Manyetik raf ve aspirat süpernatant tüpler değiştirin. 7x tekrarlayın.
  3. Her tüpe 0.75 mi, 10 mM Tris HCl (pH 7.5) eklenir. manyetik rafa tüpleri çıkarın ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Manyetik raf ve aspirat süpernatant tüpler değiştirin. 2x tekrarlayın.
  4. Son yıkama aspire sonra, Parlatma geçin.
    Not: 1 dakika ve aspirat süpernatant için manyetik raf karşı her inkübasyon bölümleri 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 reaksiyon ve 15,3, spin tüpler kısaca yer ve sonra. 0.75 ml Tris HCI (pH 7.5) ile 0.75 mL RIPA tamponu ve 2x yıkayın 2x.

9. Cila Tepki

  1. Master miks hesaplamaları (Tablo 11) Parlatma doldurun. Buz üzerinde 1.5 ml tüp karışımı parlatma olun. Pipet karıştırın.
  2. Geçen ChIP yıkama aspire hemen sonra, hala manyetik rafa iken her bir örnek reçine karışımı Parlatma 50 ul ekleyin. 3 x g'de 30 dakika boyunca inkübe edinBir Thermomixer 30 ° C'de.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, A-atık geçin.

10. Reaksiyon A-atık

  1. A-atık master miks hesaplamaları (Tablo 12) doldurun. buz üzerinde 1.5 ml tüp A-atık karışımı olun. Pipet karıştırın.
  2. Hemen bölümü Polisaj sonra, manyetik rafa iken hala her numune reçine A-atık karışımı 50 ul ekleyin. Bir Thermomixer 37 ° C'de 3 x g'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, P7 Adaptör Ligasyonu geçin.

11. P7 Adaptör ligasyon reaksiyonu

  1. Ligasyon master miks hesaplamaları (Tablo 13) doldurun. Ligasyonu buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırmak için.
  2. Hemen bölümü A-atık sonra, 48 ul P7 bağlama ustası karışımı ve farklı Adaptör Endeksi t 2 ulo Her numune reçine manyetik rafa hala iken. Bir Thermomixer 25 ° C'de 3 x g'de 2 saat inkübe edin.
    Not: her bir örnek için, farklı indeksleri daha fazla numune tek akış hücresi sekanslanacak sağlayacaktır.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, Φ-29 Nick Repair geçin.

12. Phi-29 Nick Onarım Tepki

  1. Φ-29 master miks hesaplamaları (Tablo 14) doldurun. Buz üzerinde 1.5 ml tüp Φ-29 karışımı olun. Pipet karıştırın.
  2. Hemen P7 ligasyonu bölümünden sonra manyetik rafa hala yaparken, her bir örnek reçine Φ-29 karışımı 50 ul ekleyin. Bir Thermomixer 30 ° C'de 3 x g'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, Kinaz reaksiyonu geçin.

13. Kinaz Reaksiyonu

  1. (Kinaz master miks hesaplamaları doldurun
  2. Hemen Φ-29 bölümünden sonra, manyetik rafa hala yaparken Kinaz 50 ul her örnek reçine karıştırın ekleyin. Bir Thermomixer 37 ° C'de 3 x g'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, Lambda Ekzonükleaz reaksiyonu geçin.

14. Lambda Ekzonükleaz Reaksiyonu

  1. Doldurun Lambda Ekzonükleaz master karışım hesaplamaları (Tablo 16). Lambda Ekzonükleaz buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırın.
  2. Hemen Kinaz bölümünden sonra, manyetik rafa hala yaparken Lambda ekzonükleazının 50 ul her örnek reçine karıştırın ekleyin. Bir Thermomixer 37 ° C'de 3 x g'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, RecJ f reaksiyonuna geçin.

15. RecJ fNükleazlar Reaksiyon

  1. RecJ f master miks hesaplamaları (Tablo 17) doldurun. Buz üzerinde 1.5 ml tüp RecJ f karışımı olun. Pipet karıştırın.
  2. Manyetik rafa hala yaparken hemen Lambda Ekzonükleaz bölümünden sonra, her numune reçine RecJ f karışımı 50 ul ekleyin. Bir Thermomixer 37 ° C'de 3 x g'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bölüm 8.4 sonra notta açıklandığı gibi son yıkama aspire sonra, ChIP Tasfiye geçin.

16. Elüsyon ve Crosslink Ters

  1. ana karışımı hazırlayın: numune sayısı 1.5 ml tüp içinde x 1,1 x (200 ul ChIP Elüsyon Tamponu + 1 ul 20 mg / ml proteinaz K). Her numune reçine 200 ul ChIP Elüsyon Tampon + Proteinaz K ana karışımı ekleyin.
  2. yoğuşmayı önlemek için ısıtılmış kapak ile, bir Thermomixer 65 ° C'de 3 x g'de gece boyunca (yaklaşık 16 saat) inkübe edin.

3. Gün: DNA Özüiyon ve Adaptör ligasyonu

17. Elüsyon ve Crosslink Ters (devamı)

  1. 65 ° C'de gece boyunca inkübe edildikten sonra, kısa bir süre için kondensatı toplanması için numune dönerler. 1 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin örnekleri.
  2. 200 ul TE tampon maddesi (pH 7.5) ihtiva eden yeni bir 1.5 ml'lik tübe yüzer ul transfer 200.

18. Fenol Kloroform izoamil Alkol (PCIAA) Ekstraksiyon

  1. Her bir örnek için izoamil alkol 400 ul fenol kloroform ekleyin. Vortex 20 saniye karıştırın.
  2. Oda sıcaklığında 20.000 xg (RT) 10 dakika süre ile santrifüjlenir. Dikkatli bir şekilde yeni bir tüp, üst sulu tabaka 325 ul transfer.
    Not: yeni bir tüp içine organik (alt katmanın) herhangi aktarmak özen gösterin.
  3. Her bir örnek için 3 M NaOAc (pH 5.5) ve 1 ul 20 mg / ml glikojen 1/10 hacim. Birden fazla numuneler için, bir ana karışımı hazırlayın.
  4. Her bir örnek için buz gibi% 100 etanol 3 cilt. girdapkarıştırmak. -80 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  5. 4 ° C'de 20,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj. Dikkatle pelet rahatsız değil emin olarak süpernatant süzün.
  6. Yavaşça pelet rahatsız değil emin olun, taze buz soğuk% 70 etanol yapılan 500 ul ekleyin. 4 ° C'de 20,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı dikkatlice süzün.
  7. 45 ° C'de bir hızlı vakumda yaklaşık 20 dakika boyunca (ya da kuru kadar) için kuru pelet.
    NOT: Bu protokolde bir duraklama noktasıdır. Kuru DNA pelletleri -20 ° C'de saklanabilir.
  8. Arka arkaya, DNA pelet, kurutuldu pelet görülemez halde alanı üzerinde 10 ul GKD 2 O Pipet pelet tekrar.
  9. örneklerin sayısına bağlı olarak, yeni bir 0.3 ml PCR tüpü ya da 8-raf için her numune 10 ul aktarın.

19. P7 primer uzama reaksiyonuyla

  1. Doldurun P7 Primer Uzatma master karışım hesaplamaları (Tablo 18). Uzatma buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırın.
  2. Her 10 ul örnek Uzatma karışımı 10 ul (eksi Φ-29 polimeraz) ekleyin. Pipet karıştırın.
  3. 30 ˚C kadar şablona tavlama astar programı (Tablo 19) kullanılarak termosikler çalıştırmak numuneler adım "tutun".
  4. 30 ˚C sırasında 1 ul Φ-29 polimeraz ekle programında adım "hold". Pipet karıştırın. Program (Tablo 19) geri kalan kısmını devam edin.

20. Reaksiyon A-atık

  1. A-atık master miks hesaplamaları (Tablo 20) doldurun. buz üzerinde 1.5 ml tüp A-atık karışımı olun. Pipet karıştırın.
  2. Her bir numune için A-atık karışımı 10 ul ekleyin. Pipet karıştırın.
  3. PCR, 75 ° C'de 20 dakika süre ile inaktive ısı, daha sonra 37 ° C'de 30 dakika boyunca numune inkübe ve.

21. P5 Adaptör ligasyon reaksiyonu

  1. fill dışarı P5 Adaptör ligasyonu master karışım hesaplamaları (Tablo 21). Ligasyonu buz üzerinde 1.5 ml tüp içinde karıştırın emin olun. Pipet karıştırın.
  2. P5 Ligasyonu 20 ul her bir örnek için karıştırın ekleyin. Pipet karıştırın.
  3. PCR, 25 ° C'de 2 saat boyunca örnekleri inkübe edin.

22. Boncuk Temizlik-up

Not: temizlemek boncuk üzerinde üretici ayrıntılar için malzemeler bölümüne bakınız.

  1. yeni bir 1.5 ml'lik tübe her biri 50 ul örnek aktarın.
  2. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 15 hız ayarında küçük bir tüp rotator boncuk temizlemek yeniden süspanse edin. boncuk pipetleme önce yerleşmek izin vermeyin.
  3. örnek 60 ul temizlemek boncuk ekleyin (1.2: oranını örnek boncuk temizlemek 1 kısa 200'den baz çifti olan DNA kaldırmak için kritik öneme sahiptir). Pipet 20 saniye karıştırın.
  4. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 15 hız ayarında bir mini tüp rotator boncuk temizlemek tekrar süspansiyon. Kısaca tüpler dönerler.
  5. 1 dakika boyunca manyetik rafa tüpler yerleştirin.kapalı pipetlemeyin ve supernatant atın.
    NOT: temiz-up boncuk kadar emmek çünkü bu bölümde vakum aspirasyonu kullanmayın.
  6. onlar manyetik rafa ise her bir örnek taze yapılmış RT% 70 etanol 400 ul ekleyin. Karıştırma. Süpernatant aspire. 2x tekrarlayın.
  7. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca temizlik boncuk kurutun. boncuk renk boncuk kuru olduğunda reçine pelet görünür olacak açık kahverengi ve çok küçük çatlaklar koyu dönecek.
  8. DNA elüte etmek için, 40 ul 10 mM Tris (pH 7.5) ilave edilir. İyice 20 saniye karıştırın pipetlemeyin.
  9. 1 dakika boyunca manyetik rafa örnekleri yerleştirin. Yavaşça pipetlemeyin ve 0.3 ml PCR tüplerine 36 ul eluat doğrudan aktarmak.
  10. -20 ° C'de PCR reaksiyonu veya mağaza elüsyonların doğrudan geçin.

4. Gün: PCR ve Jel Analiz

23. PCR

  1. PCR master mix hesaplamaları (Tablo 22) doldurun. PCR karışımı olun. Pipet çok yavaşça önlemek için karıştırmak içinkabarcıklar.
  2. PCR 14 ul her 36 ul DNA örneği için karıştırın ekleyin. Pipet karıştırın. Termosikler koymak için hazır olana kadar buz üzerinde örnekleri tutun.
  3. Pozitif PCR kontrolü için, önceden hazırlanmış kütüphane yer almaktadır. PCR negatif kontrolü için, su içerir. PCR programı (Tablo 23) kullanarak termosikler çalıştırın örnekler.

24. Jel hazırlanması, DNA eksizyonu ve Görselleştirme

  1. İyice temiz ve deiyonize su ile uygun bir boyut jel kutusunu durulayın. % 1.5 agaroz jeli Hazırlama 60 ul tutabilir kalınlığında çok oyuklu bir tarakla (ihtiva eden 0.5 mg / ml etidyum bromid).
    NOT: Etidyum bromür (EtBr) kanserojen ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.
  2. yoğunlaşmayı toplamak için kısaca PCR örnek tüplerini aşağı doğru döndürün.
  3. Kombine örnek 6x ksilen, DNA boya 1/5 hacim ekleyin. numune DNA ile aynı yerde göç beri DNA boyada Bromophenol maviyi kullanmayın.
  4. Tüm örnek int Yüko her bir kuyunun, tercihen örnekler arasında boş kuyular ile.
    Not: Aynı dizin ile Kütüphaneler aynı jel çalıştırmak OLMAMALIDIR.
  5. Yük 7 ul numuneler her iki yanı üzerinde, 100 bp'lik bir basamağı ifade. Yaklaşık 30-45 dakika süreyle 140 V de jel çalıştırın merdiveni Bromophenol boya ¾ yolu jel aşağı kadar.
  6. Görüntü bir düşük UV ayarında bir transilluminator'de üzerinde jel görselleştirmek ve. 500 bp - DNA fragmanlarını 200 içeren agaroz bölümleri tüketim. 125 bp çalışır adaptör dimer bandı kesmek önlemek için çok dikkatli olun.
  7. 15 ml'lik bir tüp içine, her kesilmiş jel dilim yerleştirin. Her jel diliminin rekor net ağırlığı. tüp doğrudan bu ağırlık yaz.
  8. Görüntü, kaydetmek ve doğru boyutu aralığı seçilmiş onaylamak için eksize jel açıklama.

25. Jel saflaştırma

  1. aşağıdaki değişikliklerle, üreticinin talimatlarına uygun olarak, çıkarılan jel dilimine DNA saflaştınlır.
  2. sallanan tarafından jel dilim çözülürplatformu sallanan üzerinde oda sıcaklığında. Bu çözmek için yaklaşık 20 dakika sürer.
  3. yüksek ölçüde saflaştırılmış DNA elde etmek için, kolon içinden geçtikten 0.5 mi Tampon QG sonra çözünür jel ile sütun yıkayın.
  4. 5 dakika - Tampon PE yıkamadan sonra, sütun 2 RT'de bekletin. Oda sıcaklığında 13.000 xg'de 1 dakika için Spin.
  5. Taze 1.5 ml tüp içine PCR reaksiyon ana karışımı, 40 ul EB Tampon ile uzaklaştırma numuneler için oda izin vermek için.

26. DNA Niceleme

  1. Üreticinin talimatlarına (Tablo 24) 'e göre numune hazırlayın. optik tüpler ile belirtilen enstrüman Ölçü örnekleri.
  2. ChIP-ekzo kütüphaneleri sayısal sonra, sıralama-by-sentez Bu protokolde, DNA adaptörleri ile uyumludur kimya 16 kullanan bir platform üzerinde sıralama için gönderin.
    Not: Genellikle, örneğin 2 ul miktarının için yeterli olmakla birlikte, daha fazla örnek konsantrasyonu düşük ise, gerekli olabilir. DNA, tipik verimler50 ile 200 ng arasında ly aralığı.
  3. ölçümü sonrasında, mağaza örnekleri -20 ° C'de.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aşağıdaki şekiller Burada sunulan ChIP-exo protokol temsili sonuçlar göstermektedir. Birkaç enzimatik adımda bilinen bir çipin seq metodolojilere aksine, yonga-ekso on ardışık göre enzimatik reaksiyonları (Şekil 1) gerekmektedir. Bu nedenle, bakım, her reaksiyon bileşeni, ilgili reaksiyon ana karışıma ilave edilir sağlamak için her adımda alınmalıdır. Biz ortaya çıkan tablo baskı, otomatik olarak reaksiyon master miks hesaplamaları gerçekleştirmek için reaksiyon Tablolar dayalı bir kalıplaşmış bir e-tablo üreten ve ana karışımı eklendikten sonra daha sonra her bir öğeyi kapalı atmanızı öneririz.

Biz kaliteli sıralama sonuçlarını (Şekil 2) sağlamak için protokol boyunca kalite kontrol önlemleri bir dizi kullanır. Her ChIP reaksiyon üç temel bileşenleri içerir: 1) intere hücrelerinden kromatin özü sonikeSt ilgi proteine ​​yönelik, 2) bir antikor, ve 3) Proteing (veya ProteinA) reçinesi çökelen immün kompleksleri hareketsiz hale getirmek için. Sonication koşulları her hücre tipine ve sonikasyon enstrüman için optimize edilmelidir yana kaliteli sonicated kromatin özleri (Şekil 2A) elde edilmesi oldukça zor olabilir. 500 bp (Şekil 2A, "+" şerit) - en yüksek kalite kütüphaneleri 100 arasında DNA parçalarını veren bir sonikasyon sonucu ile başlar, çünkü bu adımı optimize etmek için vakit değer. Sonike özler belirgin süper vardiya olarak bozulmamış protein-DNA çapraz bağlantılar içeren doğrulamak için - formaldehit çapraz bağlarının dayanıksız ve formaldehit kendisi sınırlı bir raf ömrüne sahiptir yana, biz bir elektroforetik mobilite kayma deneyi (şerit "" Şekil 2A) kullanın DNA fragmanları. Arka plan sinyalini değerlendirmek için rutin ChIP reaksiyondan antikoru atlar bir "sahte" ChIP gerçekleştirin. Yüksek kaliteli bir ChIP-exBu durumda belirli ChIP antikora göre, Pol II yöneltilen - o kütüphane hazırlığı "sahte" ChIP arka plan sinyali ( ""), eğer varsa, çok az olacaktır. Şekil 2B'de görüldüğü gibi, bilinen bir çipin seq kütüphaneleri ChIP-ekso önemli ölçüde daha fazla bir arka plan sinyali vardır. Son olarak, sıralama, ChIP-exo kütüphane kalitesi öncesinde Bioanalyzer (- D Şekil 2C) değerlendirilir. Analiz doğru kütüphane boyutu dağılımını ölçen ve 125 bp çalıştırmak (okla gösterilen) kirletici adaptör dimerleri algılar. adaptör dimerleri varsa, bunlar sıralama bant genişliğini azaltır. Bu nedenle, biz verimli DNA az 200 bp fragmanları kaldıracak ek bir boncuk temizleme önerilir.

mekansal başlatarak, farklı çözme tek yöntem yeteneğine sahiptir, çünkü ChIP-exo durdurulmuş ve RNA polimeraz II o uzayan, güçlü bir fonksiyonel genomik tekniktirna genom çaplı (Şekil 3) 11. Bu komşu bağlayıcı olayların dışında baz çiftlerinin onlarca olduğundan, ChIP-seq birkaç yüz baz çifti gücünü çözme bu bağlayıcı olayları ayırt edemiyor.

Şekil 1
Şekil 1: ChIP-exo şematik. ChIP sonra, P7 adaptör sonication sınırlarına bağlanır. Lambda ekzonükleaz, daha sonra bir protein-DNA etkileşim ayak izi, çapraz bağlama noktasına 'ila 3' DNA 5 keser. elüsyon ve çapraz bağ ters sonra, primer uzatma dubleks DNA sentezler. Son olarak, P5 adaptörün ligasyonu sol ve sağ eksonükleaz sınırları işaretler ve elde edilen kütüphane, yüksek verimli sekanslama tabi tutulur. referans genom, sekans etiketlerinin ait 5 'uçları eşlenmesi ve böylece ekzonükleaz bariyer ve protein-DNA kesin Alanı çizmektedirçapraz bağlama. Şekil Rhee ve Pugh 17 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: ChIP-ekzo Kalite Kontrolleri. Paneller, AC ilgisiz deneyler temsilcisi sonuçlarını gösterir. (A), (insan HCC1806 göğüs kanseri hücre çizgisinden) sonike kromatin özü kalitesinde (+) ve ekstreler üzerinde agaroz jel elektroforezi yolu ile değerlendirilir (-) çapraz bağlar ters. Bozulmamış çapraz bağlarının daha yavaş göç protein-DNA kompleksleri neden olur. Böylece, ters çapraz bağlar olmadan çalışan ekstresi (-) Başarılı bir ChIP için kritik değerlendirilmesi gereken formaldehit çapraz bağların, kalitesi sağlar. Sahte IP (B) Karşılaştırma (-) and Pol II (+) ChIP-exo ve PCR amplifikasyonu 21 döngüsünden sonra ChIP-seq kütüphane hazırlıkları. PCR'den sonra 200-500 bp'lik kesilmiş DNA fragmanları (kırmızı, müzakere kutusu ile gösterilen) ve bir jel özütleme kiti kullanılarak saflaştırılır. Panel C (CD), üst iz havuza alınmış bir kitaplık (P1) ideal bir iz temsil eder ve alt iz adaptör dimerleri içeren bir havuza kitaplığı (P2) gösterir. Panel D Panel C P1-2 kütüphane izleri (ok adaptör dimer bandı belirtir) tekabül eden DNA yoğunluk grafiğini göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: ChIP-exo Mekansal Farklı İki yönlü Transkripsiyon Başlatma Kompleksler giderir. (A) iplik-separat arasında Düzgünleştirilmiş dağılımıed ChIP-exo etiketi 5 'Pol II biter, K562 hücreleri çoğalan insan rps12 geni de TFIIB ve TBP. (B) en yakın RefSeq TSS etrafında ChIP-ekzo desenleri Ortalamalı. Tüm TFIIB işgal karşısında Tepe çifti etiketleri TSS göre, ve daha sonra ortalama pik çifti yoğunluk değeri 10bp aralıkları örtüşmeyen içinde binned, TSS geni-gen hizalanmış (n = 6511) genler olarak çizilmiştir • toplamın bir yüzdesi. TBP ve TFIIB ve "sivri" (dikey içerlek ofset) indiscernible vardır. (C) Model ChIP-ekzo (siyah iz) tarafından çözüldü farklı transkripsiyon başlatma kompleksleri gösteren, panel B verilerine dayanarak. Pol II farklı transkripsiyon başlatma ( "Iraksak") ve "Bekle" siteler siteleri ile çakıştı iki ayrı çözülebilir yerleri işgal etti. Pol II komplekslerinin bu açık mekansal ayrılık farklı transkript farklı başlatma kompleksleri kaynaklandığına işaret eder. büyük çoğunluğu Pol II çapraz Abo o transkripsiyonu başlattıktan sonra duraklama bekleniyor "Bekle" sitesinde, TSS aşağı ut 50 bp. pre-inisiyasyon kompleksi ( "PIC") formları, ortalama muhtemelen duraklatılmış sitelerde daha orada daha az zaman harcıyor belirten TSS yukarı 60 bp - Pol II en fazla 20 tükenmiş. Bu da gösteriyor ki Pol II işe sonra çoğu (ama mutlaka tüm) olguda, hızla promoter temizler ve yaklaşık 30 duraklatılmış-devlet varsayar içinde - Pol II duraklama sürümüdür gözlem ile tutarlı TSS 50 bp aşağı, transkripsiyon bir hız sınırlayıcı bir adımdır. çözünürlüğü birkaç yüz baz çifti sınırlı olduğundan bu komşu başlatma kompleksler (gri dolgu iz ile gösterilen) ChIP-seq tarafından çözümlenemeyen vardır. Şekil Pugh ve Venters 11 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Yan Dosya 1:. Ek Bilgiler Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

reaktif Hacim (ml) [Final]
1 M HEPES-KOH (pH 7.5) 50 50 mM
5 M NaCI 28 140 mM
0.5 M EDTA 2 1 mM
% 100 Gliserol 100 % 10
% 10 NP40 50 % 0,50
% 10 Triton X100 25 % 0.25
GKD 2 O 1 L doldurun

0.22 mikron filtre kullanılarak Lizis Tampon 1. Filtre Tablo 1. Reçete. 4 ° C'de 50 ml tüpler saklayın. kullanımdan hemen önce, tampon, 50 ml 100 ul CPI stok ekleyin.

reaktif Hacim (ml) [Final]
1 M Tris-HCl (pH 8) 10 10 mM
5 M NaCI 40 200 mM
0.5 M EDTA 2 1 mM
0.5 M EGTA 1 0.5 mM
GKD2 O 1 L doldurun

0.22 mikron filtre kullanılarak Lizis Tampon 2. Filtre Tablo 2. Reçete. 4 ° C'de 50 ml tüpler saklayın. kullanımdan hemen önce, tampon, 50 ml 100 ul CPI stok ekleyin.

reaktif Hacim (ml) [Final]
1 M Tris-HCl (pH 8) 10 10 mM
5 M NaCI 20 100 mM
0.5 M EDTA 2 1 mM
0.5 M EGTA 1 0.5 mM
% 10 Deoksikolat 10 % 0.10
5 g % 0.5 (ağırlık / hacim)
GKD 2 O 1 L doldurun

0.22 mikron filtre kullanılarak Lizis Tampon 3. Filtre Tablo 3. Reçete. 4 ° C'de 50 ml tüpler saklayın. kullanımdan hemen önce, tampon, 50 ml 100 ul CPI stok ekleyin.

reaktif Hacim (ml) [Final]
10x PBS 50 1x
Sığır serum albumini 2.5 gr % 0,50
GKD 2 O 500 doldurun

Engelleme Tablo 4. Reçete Tampon. 0.22 mikron filtre kullanarak filtre. 4 ° C'de 50 ml tüpler saklayın. kullanımdan hemen önce, tampon, 50 ml 100 ul CPI stok ekleyin.

reaktif Hacim (ml) [Final]
1 M HEPES (pH 7.5) 25 50 mM
0.5 M EDTA (pH 8) 1 1 mM
% 10 Sodyum Deoksikolat 35 0.70%
% 10 NP40 50 % 1
1 M LiCI 250 500 mM
GKD 2 O 500 doldurun
1 "fo: keep-ile-next.within-page =" always ">:" keep-together.within sayfa = fo "içerik

RIPA Tampon için Tablo 5. Reçete. 0.22 mikron filtre kullanarak filtre. 4 ° C'de 50 ml tüpler saklayın. kullanımdan hemen önce, tampon, 50 ml 100 ul CPI stok ekleyin.

reaktif Hacim (ml) [Final]
1 M Tris-CI (pH 7.5) 2.5 50 mM
0.5 M EDTA 1 10 mM
% 20 SDS 2.5 % 1
GKD 2 O 50 doldurun

ChIP Elüsyon Tampon için Tablo 6. Reçete. 0.22 mikron filtre kullanarak filtre. Oda sıcaklığında saklayın.

reaktif Hacim (ml) [Final]
1 M Tris-CI (pH 7.5) 0.5 10 mM
GKD 2 O 50 doldurun

TE Tampon için Tablo 7. Reçete. 0.22 mikron filtre kullanarak filtre. 4 ° C'de saklayın.

Hacim (ul) [Final]
100 uM ExA2-IX 75 15 uM
100 uM ExA2-33 75 15 uM
1 M Tris (pH 7.5) 50 100 mM
5 M NaCI 5 50 mM
GKD 2 O 295 -
Toplam ses 500

Tablo 8. P7 Adaptör Tavlama karışımı.

Tablo 9. P5 Adaptör Tavlama karışımı.

Hacim (ul) [Final]
100 uM ExA1-58 75 15 uM
100 uM ExA1-13 75 15 uM
1 M Tris (pH 7.5) 50 100 mM
5 M NaCI 5 50 mM
GKD 2 O 295 -
Toplam ses 500
Sıcaklık (° C) Zaman
95 5 dakika
72 5 dakika
65 60 rampa düşüş 5 dakika
55 50 rampa düşüş 3 dakika
45 40 rampa düşüş 3 dakika
30 3 dakika
20 3 dakika
10 3 dakika
4 Sonsuza dek

Tablo 10. Adaptör Tavlama Programı.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 39.8
10x reaksiyon tamponu 2 5 1x
100 uM ATP 0.5 1 mM
3 mM dNTP'ler 1.7 100 uM
3 U / ul T4 polimeraz 1 3 U
5 U / ul Klenow 1 5 U
10 U / ul T4 polinükleotid kinaz 1 10 u
Toplam reaksiyon hacmi 50

Tablo 11. Cila ustası karışımı.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 42.3
10x reaksiyon tamponu 2 5 1x
3 mM dATP 1.7 100 uM
5 U / ul Klenow 3'-5 'ekzo eksi 1 5 U
Toplam reaksiyon hacmi 50

Tablo 12. ana karışımı A-atık.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 41
100 mM ATP 0.5 1 mM
10x reaksiyon tamponu 2 5 1x
400 U / ul T4 DNA Ligase 1.5 600 U
Reaksiyon karışımı hacminin 48
15 mM Endeksi Adaptörü 2 30 pikomol
Toplam reaksiyon hacmi 50

Tablo 13. P7 Adaptörü Ligasyonu master karışım.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 41
10x Φ-29 Tampon 5 1x
3 mM dNTP'ler 2.5 150 uM
10 U / ul Φ-29 polimeraz 1.5 15 U
Toplam reaksiyon hacmi 50

Tablo 14. Φ-29 Nick Onarım ana karışımı.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 43.5
100 mM ATP 0.5 1 mM
10x reaksiyon tamponu 2 5 1x
10 U / ul T4 polinükleotid kinaz 1 10 u
Toplam reaksiyon hacmi 50

Tablo 15. Kinaz Reaksiyon ana karışımı.

1x (&956. l) [Final]
GKD 2 O 43
10x Lambda Tampon 5 1x
5 U / ul Lambda ekzonükleaz 2 10 u
Toplam reaksiyon hacmi 50

Tablo 16. Lambda Ekzonükleaz Reaksiyon ana karışımı.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 44
10x reaksiyon tamponu 2 5 1x
30 U / ul RecJ F ekzonükleaz 1 30 u
Toplam reaksiyon volume 50

Tablo 17. RecJ f Nükleazlar Reaksiyon ana karışımı.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 6.45
10x Φ-29 Tampon 2 1x
3 mM dNTP 1.3 200 uM
20 uM P7 Astar 0.25 0.25 uM
Reaksiyon karışımı hacminin 10
EtOH çökelmiş numune 10
Toplam reaksiyon hacmi 20

Tablo 18. P7Primer Uzatma Tepki ana karışımı.

Sıcaklık (° C) Zaman
95 5 dakika
65 5 dakika
30 2 dakika
30 Φ-29 eklenene kadar basılı tutun
30 20 dakika
65 10 dk
4 Sonsuza dek

Tablo 19. P7 Primer Uzatma programı.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 5
3 1x
3 mM dATP 1 0.1 mM
5 U / ul Klenow 3 'ila 5' ekzo eksi 1 5 U
Reaksiyon karışımı hacminin 10
Astar genişletilmiş örnek 20
Toplam reaksiyon hacmi 30

Tablo 20. ana karışımı A-atık.

1x (ul) [Final]
GKD 2 O 11.5
10x T4 ligaz tamponu 5 1x
15 uM ExA1-58 /13 adaptör 2 30 pikomol
400 U / ul T4 DNA ligazı 1.5 600 U
Reaksiyon karışımı hacminin 20
A kuyruklu örnek 30
Toplam reaksiyon hacmi 50

Tablo 21. P5 Adaptörü Ligasyonu master karışım.

1x (ul) [Final]
5x PCR Tampon 10 1x (2 mM MgCI2)
her dNTP, 10 mM 1 200 uM
20 uM P1.3 Astar 1.25 0.5 uM
20 uM P2.1 Astar 1.25 0.5 uM
2 U / ul Sıcak Başlangıç ​​polimeraz 0.5 1 u
Reaksiyon karışımı hacminin 14
Boncuk edilen örnek 36
Toplam reaksiyon hacmi 50

Tablo 22. PCR.

<tr>
Sıcaklık (° C) Zaman Bisikletler
98 30 sn 1
98 10 sn 15-21 (ChIP verimliliğine bağlı)
52 30 sn
72 20 sn
72 2 dakika 1
4 Sonsuza dek Ambar

Tablo 23. PCR programı.

DNA her bir standart (ul) Numune başına (ul)
1: 200 oranında seyreltilmiş tampon / boya karışımı 190 198
DNA standartları 10
ChIP-ekso kütüphanesi 2
Toplam ses 200 200

Tablo 24. belirlenmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz kromatin yakın baz çifti çözünürlükte bir tarafsız, genom şekilde proteinlerin etkileşim için kesin bağlayıcı konumunu belirlemek için fonksiyonel genomik protokol mevcut. İmmüno manyetik reçine kalırken yakın baz çifti haritalama çözünürlük elde etmek için en kritik adım ChIP zenginleştirilmiş DNA eksonükleaz tedavi yöntemidir. Görünüşte, protein kompleksleri potansiyel herhangi bir alt birimi (örn kromatin remodeling kompleksleri veya nükleozom çekirdek parçacık) in vivo ayak izi engelleyebilir. Formaldehid etkisiz çapraz bağlayıcı olduğu Ancak, daha önce 10 rapor, bu giderek artan bir şekilde karmaşık birden fazla alt birimler DNA çapraz pek olası aynı lokusta, aynı hücre içinde birbirlerine olur. Bu durumda, böyle bir nükleozom münferit histon alt birimleri gibi bir protein kompleksinin tek tek alt ünitelerle birlikte, in vivo ayak izi olarak, yonga-ekso mümkündür.

t "> ChIP-exo en önemli avantajları yakın baz çifti çözünürlüğü ve düşük arka plan vardır. ultra-yüksek çözünürlüklü başka bir yöntemle birlikte şu anda mümkün değil, bir genom ölçekte yapılacak ayrıntılı yapısal ve mekansal anlayışlar izin . Öte yandan, ChIP-exo birincil sınırlaması usta bir teknik olarak oldukça zor moleküler biyoloji metodolojisi olmasıdır. Buna ek olarak, ChIP adımı genel sınırlamalar da ChIP-ekzo (örneğin, ticari antikor kullanılabilirliği ve özgünlüğü için geçerlidir hücre epitop erişilebilirlik ve nispeten çok sayıda nedenle, sonikasyon koşulları dikkatli bir şekilde optimize edilmesi gerekmektedir. Genel tuzaklar olmayan bir çipli sınıf antikor kullanılarak ve mümkün olduğu kadar buz üzerinde saklandığı olup, kalitesiz sonikasyon ekstreleri bulunmaktadır.) gerekli ve her bir Daha önce olduğu gibi onaylanmış antikor bu parametrelerin deneysel sonucu üzerinde olabilir zararlı etkilerini önlemek için 18 nitelendirdi.

Kadarıylayaklaşık 20 milyon benzersiz hizalanmış okur için bir transkripsiyon faktörü hedef için sıralama derinliği, biz genellikle hedefliyoruz. Pol II ve histon modifikasyonları daha geniş dağıtılır beri, 30 okur 50 milyon hedefliyoruz. ChIP-ekzo ChIP-seq önemli ölçüde daha az bir geçmişe sahiptir, çünkü daha az benzer sıralama derinliği elde etmek için gerekli olan okuma dikkat etmek önemlidir.

Orijinal protokol üzerinde sağlam varyasyonlar 17,19,20 yayınlanacak devam ettikçe ChIP-ekzo teknolojisi günümüzde yaygın, teknik zorluklara rağmen kabul ediliyor. Özellikle, yonga proteinleri zor gelmesi sağlanmaktadır bir varyasyon kütüphanesi Preparasyon 20'nin verimli geliştirmek için tek bir bağlanma adımı kullanır ChIP-bağ, olarak adlandırılır. Özetle, ChIP-exo küresel ölçekte kromatin etkileşim proteinlerin ultra yüksek çözünürlüklü haritalama giderek çalışan ve güçlü yöntemdir. piyasada mevcut ChIP dereceli karıncanın listesindeibodies büyümeye devam ediyor, ChIP-exo metodolojisinin gelecekteki uygulamalar ultra yüksek çözünürlükte hücrenin moleküler devresini anlamak için haritalama keşfedilmemiş gen düzenleyici ağlar yönelik olacaktır. Buna ek olarak, ChIP-exo olasılıkla daha rafine olması ve yakın baz çifti çözünürlükte in vivo protein-RNA etkileşimleri ayak izini adapte olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules ThermoFisher Scientific 28908 Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) Roche Life Science 11873580001 Sections 4, 8
Bioruptor sonicator Diagenode UCD200 Section 5
15 ml polystyrene tubes BD Falcon 352095 Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads GE Healthcare 28-9670-66 Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack Invitrogen 12321D Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 05-450-127 Sections 7, 22
T4 DNA Polymerase New England BioLabs M0203 Section 9
DNA Polymerase I, Klenow New England BioLabs M0210 Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) New England BioLabs B7002 Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C Eppendorf 5382 Sections 9-16
ATP Roche Life Science 010419979001 Sections 9, 11, 13
dNTPs New England BioLabs N0447 Sections 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201 Sections 9, 13
dATP New England BioLabs N0440 Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus New England BioLabs M0212 Sections 10, 20
T4 DNA ligase  New England BioLabs M0202 Sections 11, 21
Φ-29 DNA Polymerase New England BioLabs M0269 Sections 12, 19
10x Φ-29 Buffer New England BioLabs B0269 Sections 12, 19
Lambda Exonuclease New England BioLabs M0262 Section 14
10x Lambda Buffer New England BioLabs B0262 Section 14
RecJf Exonuclease New England BioLabs M0264 Section 15
Proteinase K Roche Life Science 03115828001 Section 16
Glycogen Roche Life Science 010901393001 Section 18
10x T4 Ligase Buffer New England BioLabs B0202 Section 21
AMPure XP (clean up) beads  Beckman Coulter A63881 Section 22
Q5 Hot Start DNA Polymerase  New England BioLabs M0493 Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) New England BioLabs B9027 Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Section 25
Qubit Fluorometer Invitrogen Q33216 Section 26
Optical Clear Qubit tubes  Invitrogen Q32856 Section 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit Invitrogen Q32851 Section 26

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
  2. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
  5. Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
  6. Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
  7. Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
  8. Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
  10. Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
  11. Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
  12. Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
  13. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
  14. Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
  15. Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
  16. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  17. Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
  18. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
  19. Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
  20. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).

Tags

Biyokimya Sayı 118 ChIP-exo ChIP-seq ChIP transkripsiyon gen regülasyonu kromatin epigenetik transkripsiyon faktörleri moleküler biyoloji
ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perreault, A. A., Venters, B. J. The … More

Perreault, A. A., Venters, B. J. The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision. J. Vis. Exp. (118), e55016, doi:10.3791/55016 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter