Medicine

拡張食道内視鏡的粘膜下層切開後に狭窄を防止するためのADSC-シート移植

Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/55018

Guillaume Perrod^1,2,3, Laetitia Pidial³, Sophie Camilleri^1,4, Alexandre Bellucci^1,3,5, Amaury Casanova³, Thomas Viel³, Bertrand Tavitian^1,3,5, Chirstophe Cellier^1,2, Olivier Clément^1,3,5, Gabriel Rahmi^1,2,3

¹Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Université Paris Descartes Sorbonne Paris Cité, ²Department of Gastroenterology, Hôpital Européen Georges Pompidou, ³UMR-S970, Université Paris Descartes Sorbonne Paris Cité, ⁴Department of Pathology, Hôpital Européen Georges Pompidou, ⁵Department of Radiology, Hôpital Européen Georges Pompidou

Summary

この研究は、ブタモデルに拡張された内視鏡的粘膜下層剥離術（ESD）後の食道狭窄予防のためのβシート移植の内視鏡的脂肪組織由来間質細胞（ADSC）の成功した方法を報告します。

Abstract

過去数年間において、細胞シート構築物は、特に再建手術の手順については、再生医療の幅広い関心に拍車をかけました。様々な生体材料と脂肪組織由来間質細胞（ADSCを）を組み合わせ多様な技術の開発は、骨、軟骨、およびげっ歯類、ブタ、またはヒトのADSCからの脂肪組織などの組織工学代用、多数のタイプの建設につながっています。拡張食道内視鏡的粘膜下層剥離術（ESD）は、食道狭窄形成を担当しています。狭窄の予防は利用できませ効率的な治療法と、依然として厳しいです。以前の研究では、イヌのモデルおよびヒトにおいて粘膜細胞シート移植の有効性を報告しました。 ADSCを間葉系と非間葉系統に抗炎症性、局所免疫調節作用、血管新生の誘導、および分化能力を起因しています。この最初の研究では、内視鏡TRAを説明します豚のモデルに食道狭窄を防ぐために、ADSCの組織工学構築物のnsplantation。 ADSC構築物は、紙支持膜上に互いの上に積層2同種ADSCシートから構成されました。 ADSCを、プローブベースの共焦点レーザーendomicroscopy（PCLE）監視できるようにPKH67蛍光色素で標識しました。移植の日に、5-CMおよび食道狭窄を誘導することが知られている半円周ESDを行いました。動物はすぐに内視鏡4 ADSC構築物で移植しました。 ADSC構築物の完全な接着が穏やかアプリケーションの10分後に得ました。動物は、すべての動物が正常に移植された28日目に屠殺しました。移植は正PCLE評価で3日目に確認されました。移植された動物と比較して、対照動物には、主要な線維性組織の発達と、より頻繁に消化トラブル重度狭窄を発症し、体重増加を減少させました。 allogeniの我々のモデルでは、移植C二重細胞シートで組織のADSCは、拡張ESD後に成功したと強く下部食道狭窄率に関連付けられていました。

Introduction

表在食道腫瘍の管理は、新しい内視鏡技術の開発と変更されました。今日では、内視鏡的切除が第一選択治療です。実際に、同等の腫瘍学的結果を^{^{^{^{^1、2、3}}}}で手術より低い罹患率および死亡率と関連しています。内視鏡的粘膜切除術（EMR）と内視鏡的粘膜下層切除（ESD）は、最も広く使用されている技術です。拡張された表在性腫瘍の場合には、ESDが好ましいです。 EMRに比べて、ESDに関わらず、病変の大きさの、 ブロック切除専用でき^{^{^{^{^、4、5、6}}}を}形作ります。 ESDの主な遅延合併症は、一般的切除後1および2週間の間に発生する食道狭窄形成、です。最近公表された研究は、狭窄形成が相関することを示しています切除のサイズ。日本内視鏡学会は、それらが例の90％以上に狭窄の開発に関連付けられており、厳しい送りトラブルや生活の質の主要な劣化を担当されているので、食道周囲の3/4よりも大きなサイズのESDを回避することをお勧めします。

食道狭窄の予防は依然として厳しいです。狭窄の形成に関与する機構は、部分的にしか知られています。狭窄形成つの異なるメカニズムの会合に起因すると思われる：（1）プロ炎症性細胞の動員、（2）過剰な線維症の開発^7。いくつかの予防的治療法が提案されています。しかし、結果は、ほとんど利益と重篤な副作用^{^{^8,9}}と、不十分でした。最近、日本のチーム、大木ら。、esophに自己口腔粘膜細胞の単層細胞シートを移植することを提案ageal傷跡。移植はESD ^{^{^10、11}}の直後に行きました。彼らは、最初のイヌのモデルにした後、患者に、この革新的なアプローチの有効性を実証しました。

脂肪組織由来間質細胞（ADSCを）は、再生医療に期待されています。いくつかの分野におけるそれらのアプリケーションは、特に創傷治癒過程で、興味深い結果を示しています。細胞は、容易に分離され、間葉系と非間葉系統^{^{^{^{^12、13、14}}}}への抗炎症性、局所免疫調節作用、血管新生の誘導、および分化能力に関連付けられているためADSC療法は、いくつかの利点を提供しています。

以前の研究では、我々のチームは、食道狭窄prevをダブルADSC-シート内視鏡移植の有効性を実証しました豚モデル¹⁵内の拡張ESD後ention。この記事では、ADSC-枚構成と内視鏡的移植技術のレポートが提示されています。

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Protocol

全ての動物は、動物実験倫理委員会（農業のフランスの省のガイドライン）に従って処理しました。プロトコルは、パリデカルト大学の動物実験法のために公認の地元の倫理委員会の承認を受けた（登録番号MESR 2035.02を、医学パリデカルト、パリ、フランスの学部）。

1. ADSC文化とラベリング

民間金融機関から確認されたADSCを取得します。 10％胎児仔牛血清および1％抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含むアルファ最小必須培地で37℃、5％CO ₂で培養同種のADSC。
標準的な細胞増殖手順を用いて、動物あたり約24×10 ⁶のADSC（37℃、5％CO _2）を取得_します。標準のトリプシン溶液（T150皿のための10ミリリットル）を使用したADSCを収穫。血球計数器を用いて細胞計数を行います。
セルPKH67染色PRを使用して、移植前日にラベル付けを行いますocedure以下に説明しました。
注：染色手順の目標は、移植後の細胞追跡を可能にすることです。
1. 2×10 ⁶のADSCを標識するためには、溶液Aを調製し、B液（希釈液Cを1mLとPKH67の4μL）（100希釈液CのμLで2×10 ⁶細胞）。
2. 2分間溶液AとBをインキュベートします。その後、1分間の胎児仔牛血清の100μLを追加します。
3. 5分間1500×gで300クエン酸RPMIのμL（RPMIとクエン酸の1.5μLの298.5μL）、遠心分離で溶液を洗浄します。この操作を2回繰り返します。標識細胞を維持し、シート建設まで光から保護。

2.ダブルADSCシート構築物

当日は、移植前に、PKH標識の前に、上記の細胞培養培地のウェル当たり4 mLを、12ウェルの温度応答性細胞培養皿を準備します。 1.5×10 ⁶ PKH-labeleで皿をシードウェルD細胞と12時間（37℃、5％CO _2）インキュベートします。
移植の日に、30分間室温で皿をインキュベートすることにより集密細胞シートを取り外します。
静かにピペットで1 ADSCシートを吸引し、疎水性紙（1.5 cmの直径）の上に層。支持膜として、この用紙を使用してください。
別のADSCシートをつかみ、静かに二層構造物を得るために、他の1の上に堆積させます。
（動物当たり4）必要な数のADSC-シート構造を得るために、これらの手順を繰り返します。

3.食道内視鏡的粘膜下層切開（ESD）

移植の日に、10 mgを筋肉内ケタミン/ kgので動物を事前に薬で治療および静脈内プロポフォールの8ミリグラム/キログラムでそれらを誘導します。その後、気管内挿管を行い、イソフルラン2.5％の吸入で麻酔を維持します。
動物は全身麻酔下になると、gastroscでESDを行いますOPE、ビデオスコープ、および電気手術装置。
1. 40センチメートルから歯列弓〜45 cmの範囲の半周背マークを取得するために、内視鏡ナイフとソフト凝固を使用してください。
2. 筋層から粘膜層の分離のための粘膜下層へのインジゴカルミン染料を含有するグリセロール溶液を注入します。
3. 周切開を得るためにendocutのIモードで内視鏡ナイフを使用してください。
4. 遠位の切り込みに近位切開部から移動し、粘膜下層剥離術を実行するために強制凝固モードでの内視鏡ナイフを使用してください。
ESD手順の最後に、筋層を露出させる半周、5センチメートル長食道の傷を観察します。

4.内視鏡移植

すぐにESD後、内視鏡4の二重ADSC-シート構築物で動物を移植。
1. 内視鏡鉗子でADSC-シート構造体をつかみ、大規模な、透明な内視鏡のキャップを使用することにより、創傷部位への輸送中にそれを保護します。
2. 潰瘍床にADSC-シート構築物の表面全体に適用します。
3. 静かに完全かつ安定した生着を得るために10分間ADSC-シート構造体を適用します。アプリケーションでは、内視鏡鉗子または内視鏡のキャップを使用して、ADSCの表面全体が食道粘膜下層の上に構築適用されます。
4移植し、接着性二重セルシート構築物を得るために、この手順を各動物の4回繰り返します。
注：目標は、創傷領域の近似的半分をカバーするものです。

5.術後評価とフォローアップ

各動物について、0.2 mgのモルヒネ/ kgの一日三回最初の日のために及びエソメプラゾールの28日間の抗酸処理（40 mg /日）での筋肉内注射でESD後の鎮痛を確保します。 amoxicillで抗生物質の予防的投与を行います7日間（1グラム/日）インチ翌日の1日目の液体と固体を承認。
28日間の動物とフォローアップ。メロウピンカスの嚥下障害スコア¹⁶と重量変化の測定値を使用して、毎日の臨床評価を得ます。
マルチモーダル狭窄の評価：全身麻酔下で、スケジュールされた日3、14、および28に、狭窄の発生のマルチモーダル評価を行います。
1. 瘢痕説明、狭窄の測定、および紙支持体膜の検出を使用して内視鏡評価を行います。（胃カメラの直径は8mmである）狭窄を介して交差するように胃カメラを使用して狭窄を測定します。炎症アスペクト（粘膜紅斑、粘膜の浮腫、および粘膜自然出血）および瘢痕内の紙支持体膜の有無に注意を払って、傷跡を確認します。
2. 瘢痕床に直接胃内視鏡オペレータ運河を通じてPCLE緑のプローブを適用します。自発的な検索そして、PKH67標識ADSC-シート構造体の生着と互換性のある緑色の信号を組織しました。
3. 放射線フープ（前面と左側の発生率）でバライト食道造影の2直交発生率を実行します。 ^{^{^{18、17）（[×100}}}狭窄下の垂直軸の狭窄/長さの下で短軸の1-（長さ）狭窄度（％）=）]最も厳しい狭窄評価のための発生率を保管してください。
動物の犠牲。
1. 28日目に、フォローアップ期間の終了時に、動物の犠牲を行います。動物は全身麻酔下にある間に、静脈内フェノバルビタール100mgの/キロを注入。心拍の呼吸運動の不在のために臨床検査を用いた動物の死を確認してください。
2. 胸骨切開と臓器露光後、それぞれから食道を削除（10％緩衝ホルマリン固定、パラフィン包埋し、4μmの厚さのセクションで）動物を犠牲にしました。スライドを染色ヘマトキシリンとサフラン¹⁵で。コンピュータ分析のためのスライドをデジタル化し、動物群^15を比較^します。

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Representative Results

ADSCシートを得るためのADSCの培養及び手順は、図1に示されています。 図2はその紙支持体膜上に互いの上に層状に2 ADSCシートで構成され、移植片の構成を示しています。 ADSCをは、以前PCLEと生体内移植片の監視にできるようにPKH67蛍光色素で標識しました。 図3は、5-cmであり、半周食道傷跡が得られ、拡張された食道内視鏡的粘膜下層剥離術の異なるステップを示しています。 図4は、内視鏡移植手順を示しています。移植は、穏やかなアプリケーションの10分後にすべての動物のために成功しました。 図5は、移植手順の成功を確認し、3日目にプラスPCLEの評価を示します。

マルチモーダル狭窄analysに許可されるフォローアップ期間です。異なる評価は、以下の図と表で示したされています。移植群は対照群のすべての動物に比べて重度の食道狭窄を開発したから対照動物と比較し、移植動物群は、それほど頻繁に消化トラブルと28日目1匹の動物に大きな体重増加を示しました。移植された動物と比較して、対照動物は、有意な線維性組織を開発しました。 表1は、フォローアップ期間中に臨床的および内視鏡的所見を示しています。 図6は、移植および非移植動物でのフォローアップ期間の終了時に、内視鏡や画像所見を示しています。 図7は、移植動物と対照動物との間で異なる組織学的所見を示しています。これらのデータは、食道狭窄防止のためのADSC-シート移植の有効性を確認します。

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1. ADSCシート構築物を図。異なる倍率での標準的な培養皿中のAとBの初期の通路たADSC。 ADSCシートはコマーシャル温度応答性培養皿上PKH標識のADSCを培養することによって得ました。インキュベーション温度は20℃（室温）に低下した場合C.は 、すべての細胞が自発的に酵素処理を必要とせずに、そのままADSCシートとして皿表面から取り外します。 D.アンADSCシートは、転写膜を用いたグラフト構造の前に回収しました。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.ダブルADSC-シート構築物を図。 、B、Cの transpla前日10％の胎児を含むアルファ最小必須培地でCO _2を 12ウェルの温度応答性細胞培養に播種し、培養し、37℃で、5％ - ntationは、PKH標識のADSCは、初期継代番号（P5 P4）に収穫しました仔牛血清および1％抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）。各ウェル（各ウェルの底部で）ポリ-N-イソプロピルアクリルアミドの膜で被覆し、1.5×10 ⁶個^の細胞を播種しました。インキュベーション温度は20℃（室温）に低下させた場合には、全ての細胞が自発的に酵素処理を必要とせずにそのままADSCシートとして切り離さ。 2 ADSCシートからなる二重セルシート構造体のD.理論スキーマが互いの上に積層し、紙支持体膜に印加されます。完成した二重セルシート構築物のE.巨視的ビュー。リファレンス15から変更されたトンはこちらをクリックしてください Oこの図の拡大版を表示します。

3.内視鏡的粘膜下層切開手順を図。 A.内視鏡マークは、歯列弓から40〜45センチメートルの範囲の円周の半分を含む、切除範囲を描写するために作成されました。 B.インジゴカルミン色素を含むグリセロール溶液の粘膜下注入。この注入の目的は、粘膜下層を露出させるために、筋層から粘膜層を分離することでした。 C.周辺の切開が注入された粘膜下層を明らかにし、内視鏡マークに外部から行われました。 D. 5センチメートル長と半周食道の傷を示す粘膜下層剥離術の終了時に内視鏡ビュー。ら= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

4.ダブルADSC-シート内視鏡移植手順を図。 A.四ADSCは、移植される準備ができて構築します。 ADSCのB.保護は、移植前に大きな内視鏡のキャップの下に構築します。内視鏡のキャップの下で保護ADSCコンストラクトを示す動物の咽頭の交差点のC.内視鏡ビュー、。 D.は、アプリケーションの10分は、シート接着を得るのに十分でした。アプリケーションは、内視鏡のキャップまたは内視鏡鉗子を使用して行きました。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5. PCLE所見。 3日目のPCLEは成功した細胞シート移植と互換性のin vitroで得られたものと同様の自発的かつ強いシグナルを示しています。信号は14日と28 A.懸濁液中のADSCのin vitro PCLE信号に見られなかったん。 B.細胞シートで組織のADSCのin vitro PCLE信号。食道傷跡にC.ザin vivoで PCLEプローブアプリケーション。 D。移植後3日目に視覚化したADSCのin vivo PCLE信号。リファレンス15から変更されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6.結果形態素解析の対照群と比較して28日目に、内視鏡および28日目にX線所見は、上流の拡張と完全に再上皮化粘膜ずに短く、光狭窄を示しました。リファレンス15から変更されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7.狭窄分野の組織学的評価。組織学的分析は、HES標識スライドデジタル化した後に行きました。移植された動物（A）においては、治癒過程をと比較して、増大した再上皮化と改善および線維症の発生を減少しました非移植動物（B）。強烈な線維性組織の発達しました粘膜筋板の破壊、線維性インナー筋層浸潤、および大規模な粘膜の欠陥に起因して観察しました。リファレンス15から変更されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

フォローアップ期間中、表1の臨床アセスメント。臨床評価はメロウピンカススコアに、体重変化に応じて、毎日臨床評価を用いて行きました。（*）メロウピンカスは¹⁶得点します。リファレンス15から変更されました。

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Discussion

このブタモデルでは、ADSC-シート移植は技術的に成功し、in vivoで PCLE評価は、細胞移植のモニタリングを可能にしました。臨床内視鏡的、放射線、および組織学的評価は、拡張ESD後食道狭窄予防に内視鏡ADSCシートの有効性を実証しました。

インジゴカルミン色素シートを含むADSCグリセロール溶液の内視鏡移植は、再生医療における革新的なアプローチです。大木ら。まず、内視鏡移植手順を記載しています。彼らの研究では、細胞シートの構築物は、支持膜^{^{^{^{^10、11、19}}}}として使用されるポリフッ化ビニリデンの薄いシートに積層口腔粘膜上皮細胞シートで構成しました。支持膜は、内視鏡鉗子で把持し、慎重に潰瘍ベッドの上に置きました。セルLシート付着は穏やかなアプリケーションの10分後に得ました。この手順は、まだ再生されていません。本研究では、二重ADSCシート構築物は、多数の理由のために移植しました。 ADSCの選択は、特に皮膚の治癒過程において、その抗炎症能力を示したいくつかの研究に基づいていました。 ADSCは、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の相互作用^7を調節することが知られています。線維症発症のメカニズムは複雑であり、部分的にしか理解されています。パラクリン効果は、TGFβおよび血管新生促進因子²⁰などの抗炎症性因子の産生を含むADSCアクションで主要な役割を果たしているようです。

内視鏡ADSCシート移植は、いくつかの制限があります。まず、細胞シートは、安定した接着力を得るために、食道瘢痕に10分間適用しました。手順のこの部分は、挑戦的な技術的に困難であった、と経験豊富な内視鏡医によって行われなければなりませんでした。それにもかかわらず、すべての動物が正常に内視鏡手術の実現可能性を確認し、移植しました。最近、細胞シート移植の成功を改善するための3次元印刷装置の使用は^、21を報告^しました。第二に、この技術は、未知の生存率と関連しています。食道の傷は、細胞のための積極的な環境です。温度応答ディッシュは、細胞外マトリックスを介した細胞シート構築物の産生のために、セル接続の形成を可能にします。従って、生存率およびADSCの相互作用を改善するために、二重ADSCシート構築物^{^{^22、23}を}選択しました。この研究は、細胞生存率または両方の重要な問題である食道狭窄予防に移植の用量効果、のいずれかを評価するために設計されていません。大木らのように、第三。支持膜の使用は、ADSCシート構築物を運ぶために必要でした。アフトえー移植、紙支持体膜は、構造物の破壊せずに削除することができませんでした。このイントラ食道異物が増加し、炎症を担当していました。最適化された技術は、紙支持体膜の除去を可能にします。

PCLEと移植のモニタリングにも挑戦しました。この新しい内視鏡イメージング技術は、腺パターンの可視化、マイクロ血管新生、および細胞変化を含む、 生体内組織学的分析にできます。 PCLEは、炎症性腸疾患、バレット食道、および粘液性膵嚢胞^{^{^24、25}}などの多くの消化器疾患で評価しました。 PCLE互換PKH67蛍光団を細胞標識化のために使用しました。 ADSCシートの存在と適合性の蛍光シグナルは、この正の結果はADSCシート移植の成功を反映して3日目に4匹の動物で観察されました。しかし、BECA使用PKH67は、時間の経過とともに減少した信号を有しており、細胞分裂後、PCLE評価は、わずか数日、移植²⁶後に可能でした。大木ら。そして、金井ら。免疫染色による細胞シート移植をモニターし、そしてそれらは移植後8日目までの細胞の存在を確認しました。成熟細胞は、特定の免疫染色の利点を有する、本研究で使用しました。

食道狭窄は、それによって技術の開発を制限し、ESDを次の最も重篤な有害事象の一つです。狭窄形成を防止するための最適な技術はまだ不足しています。臨床の現場では、拡張された食道ESDを有する患者は、コルチコステロイド、内視鏡的バルーンdilatations、または食道ステント留置²⁷など、さまざまな予防的治療を、規定されています。生体材料のローカルアプリケーションは、異なる結果^{^{^28、29}}と、行われています^{^30、31}で評価しました。再上皮早熟と増加したが、食道瘢痕で観察されました。地元の免疫調節のために、少しデータはADSC注射または羊膜アプリケーション^{^32、}約³³文献で提供されています。遅延狭窄形成及び減少狭窄率が観察されました。

このブタモデルでは、内視鏡細胞シート移植手順が正常に行われました。二重の細胞シートに組織移植のADSCは、拡張ESD後食道狭窄形成を防止する能力を実証しました。 ADSC治癒に関与するメカニズムプロセスが十分に理解されており、今後の研究では、さらに調査する必要があります。したがって、これらの有望な結果を考慮して、臨床試験は、患者における、拡張ESD後ADSCシート構築物の有効性を評価するために実施されるべきです。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transparent endoscopic cap Q180 compatible	Olympus Optical Co
GIF-Q180 gastroscope	Olympus Optical Co
Videoscope System Exera II	Olympus Optical Co
Injection needle 18 G	Olympus Optical Co
Electrosurgery unit ERBE ICC 350	ERBE Technology
Indigo carmin 1%	Life
Endoscopic hybrid knife	Life
Minisonde Z pCLE green probe	Mauna Kea Technology		You must learn how to use the probe. The manipulation could be difficult.
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	12105C
Trypsin	Sigma Aldrich	T146
Alpha minimum essential medium	Thermo Fisher	22561-021
Phosphate-Buffered Salines	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 dye kit	Sigma Aldrich	Mini67-KT
12-well temperature responsive cell culture dish	Upcell Thermo Scientific	174900	Feel the weel with 4 mL standard medium culture 30 min before seeding cells
Esomeprazole 40 mg	Biogaran
Moprhine sulfate 50 mg/mL	Lavoisier
Amoxicilline 1 g	Biogaran
Ketamine 250 mg/5 mL	Panpharma
Propofol 10 mg/mL	Fresenius
Hydrophobic paper	Carrefour