Summary
Este estudo relata um método bem-sucedido de células adiposo endoscópica derivadas de tecido do estroma (ADSC) em folha transplante para a prevenção de estenose esofágica após uma dissecção endoscópica da submucosa estendida (ESD) em suínos.
Abstract
Nos últimos anos, a construção de folhas de células estimulou grande interesse na medicina regenerativa, especialmente para procedimentos de cirurgia reconstrutiva. O desenvolvimento de tecnologias diversificadas que combinam células estromais derivadas de tecido adiposo (ADSCs) com vários biomateriais levou à construção de vários tipos de substitutos de engenharia de tecidos, tais como osso, cartilagem e tecidos adiposos de roedor, de porcino, ou ADSCs humanos. esofágico dissecção submucosa endoscópica estendida (ESD) é responsável pela formação de estenose de esôfago. prevenção de estenose continua sendo um desafio, sem tratamentos eficazes disponíveis. Estudos anteriores relataram a eficácia do transplante de folhas de células da mucosa no modelo canino e em seres humanos. ADSCs são atribuídas propriedades anti-inflamatórias, efeitos de modulação imunes locais, indução neovascularização e habilidades diferenciação em mesenquimais e linhagens não-mesenquimais. Este estudo original descreve o tra endoscópicansplantation de uma construção da engenharia de tecidos ADSC para evitar estenose esofágica em um modelo suína. A construção ADSC foi composta de duas folhas adsc alogénicos em camadas umas sobre as outras em uma membrana de suporte de papel. As ADSCs foram marcadas com o fluororo PKH67 para permitir à base de sonda endomicroscopy de laser confocal de monitorização (pCLE). No dia do transplante, efectuou-se uma 5-cm e ESD hemi-circunferencial que se sabe induzir estenose esofágica. Os animais foram imediatamente endoscopicamente transplantado com 4 construções adsc. A completa adesão das construções adsc foi obtido após 10 min de aplicação suave. Os animais foram sacrificados no dia 28. Todos os animais foram transplantados com sucesso. O transplante foi confirmada no dia 3 com uma avaliação pCLE positivo. Em comparação com animais transplantados, animais de controle desenvolvido restrições graves, com maior desenvolvimento do tecido fibrótico, o problema alimentar mais frequente, e ganho de peso reduzido. No nosso modelo, o transplante de allogenic ADSCs, organizadas em folhas de células duplas, depois de ESD estendida foi bem sucedida e fortemente associada com uma taxa de estreitamento esofágico inferior.
Introduction
A gestão de tumores esofágicos superficial mudou com o desenvolvimento de novas técnicas endoscópicas. Hoje em dia, a ressecção endoscópica é o tratamento de primeira linha. Na verdade, ele é associado com menores taxas de morbidade e mortalidade do que uma cirurgia com a igualdade de resultados oncológicos 1, 2, 3. ressecção endoscópica da mucosa (EMR) e ressecção endoscópica da submucosa (ESD) são as técnicas mais amplamente utilizados. No caso de um tumor superficial prolongado, ESD é preferido. Comparado ao EMR, ESD permite en ressecção bloco, independentemente do tamanho da lesão e moldar 4, 5, 6. A principal complicação tardia de ESD é a formação de estenose de esôfago, o que geralmente ocorre entre uma e duas semanas após a ressecção. Estudos publicados recentes têm demonstrado que a formação de estenose está correlacionada com atamanho da ressecção. O japonês endoscópica Society recomenda evitar ESD tamanho superior a ¾ da circunferência do esôfago porque eles estão associados com o desenvolvimento de estenose em mais de 90% dos casos e são responsáveis por problemas de alimentação graves e grande deterioração da qualidade de vida.
A prevenção da estenose de esôfago continua sendo um desafio. Mecanismos envolvidos na formação de estenose são apenas parcialmente conhecida. Estenose formações parece resultar da associação de dois mecanismos diferentes: (1) o recrutamento celular pró-inflamatórios e (2) o desenvolvimento de fibrose excessiva 7. Vários tratamentos preventivos têm sido propostos. No entanto, os resultados não foram satisfatórios, com pouco benefício e efeitos colaterais graves 8, 9. Recentemente, uma equipe japonesa, Ohki et al. , Proposto para transplantar uma folha de células de camada única de células da mucosa oral autólogas para o esophcicatriz ageal. O transplante foi realizado imediatamente após ESD 10, 11. Eles demonstraram a eficácia desta abordagem inovadora, primeiro num modelo canino e, em seguida, em pacientes.
células estromais derivadas de tecido adiposo (ADSCs) são promissores na medicina regenerativa. A sua aplicação em vários campos tem mostrado resultados interessantes, especialmente no processo de cicatrização de feridas. Terapia ADSC oferece várias vantagens, porque as células são facilmente isoladas e estão associados com propriedades anti-inflamatórias, efeitos imunomoduladores locais, indução neovascularização, e habilidades de diferenciação em mesenquimais e linhagens não-mesenquimais 12, 13, 14.
Em um estudo anterior, a nossa equipa demonstrou a eficácia do transplante endoscópica dupla ADSC folhas para prev estenose esofágicaenção após ESD estendida em um modelo suíno 15. Neste artigo, os relatos de construção ADSC folhas e técnica de transplante endoscópico são apresentados.
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Protocol
Todos os animais foram tratados de acordo com a Comissão de Ética em Pesquisa Animal (orientações do Ministério da Agricultura francês). O protocolo recebeu a aprovação do comitê de ética local autorizado para experimentações com animais na Descartes Universidade Paris (número registrado MESR 2.035,02; Faculdade de Medicina de Paris Descartes, Paris, França).
1. ADSC Cultura e Etiquetagem
- Obter ADSCs confirmados de uma instituição privada. Culturas ADSCs alogénicas a 37 ° C e 5% de CO 2 com meio essencial mínimo alfa incluindo soro bovino fetal a 10% e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina).
- Obter cerca de 24 x 10 6 ADSCs por animal usando procedimentos de expansão celular padrão (37 ° C e 5% CO 2). Colher as ADSCs usando uma solução de tripsina-padrão (10 mL para um prato T150). Realizar contagem de células com um hemocitómetro.
- Execute célula rotular o dia antes do transplante usando o pr coloração PKH67ocedure descrito abaixo.
NOTA: O objectivo do processo de coloração é a de permitir o rastreamento de células após o transplante.- A fim de marcar 2 x 10 6 ADSCs, preparar a solução A (2 X 10 6 células com 100 uL de diluente de C) e solução B (4 uL de PKH67 com 1 ml de solvente C).
- Incubar as soluções A e B durante 2 min. Em seguida, adicionar 100 uL de soro fetal bovino durante 1 min.
- Lavar a solução com 300 uL de meio RPMI citrado (298,5 mL de RPMI e 1,5 mL de citrato) e centrifugar a 1500 xg durante 5 min. Repita esta operação 2 vezes. Manter as células marcadas e protegê-los da luz até que a construção folha.
2. Faça duplo ADSC folhas Construct
- No dia antes do transplante, preparar um prato de cultura de células responsivas temperatura de 12 poços com 4 mL por poço de meio de cultura de células, descritos acima, antes de PKH-rotulagem. Semear o prato com 1,5 x 10 6 PKH-Labeled células por poço e incubar durante 12 h (37 ° C e 5% de CO 2).
- No dia do transplante, separar a camada de células confluentes por incubação do prato à temperatura ambiente durante 30 min.
- Aspirar cuidadosamente uma folha ADSC com uma pipeta e mergulhá-la em um papel hidrofóbica (1,5 cm de diâmetro). Use este papel como uma membrana de suporte.
- Compreender uma outra folha ADSC e depositá-lo suavemente no topo do outro para obter uma construção de camada dupla.
- Repita estes procedimentos para obter o maior número de construções ADSC folhas, conforme necessário (4 por animal).
3. esofágico endoscópica submucosa Dissection (ESD)
- No dia do transplante, pré-medicar os animais com 10 mg / kg de cetamina por via intramuscular e induzi-los com 8 mg / kg de propofol. Em seguida, execute a entubação endotraqueal e manter a anestesia com isoflurano inalação 2,5%.
- Uma vez que o animal está sob anestesia geral, realizar a ESD com uma gastroscope, um videoscope, e uma unidade de eletrocirurgia.
- Use uma faca de endoscópica e coagulação macia para obter marcas dorsais hemi-circunferencial que variam de 40 cm a 45 cm da arcada dentária.
- Injectar uma solução de glicerol que contém corante indigo carmim na camada submucosa para a separação da camada de mucosa da túnica muscular.
- Use uma faca de endoscópica com o modo endocut I obter incisões circunferenciais.
- Use uma faca de endoscópica com o modo de coagulação forçado a realizar a dissecção submucosa, movendo-se a partir da incisão proximal da incisão distal.
- No final do procedimento de ESD, a observar, cicatriz esofágica 5 cm de comprimento de hemi-circunferencial expor a camada muscular.
4. endoscópica Transplantation
- Imediatamente após a ESD, por via endoscópica transplantar animais com 4 construções duplas ADSC folhas.
- Segure uma construção ADSC folhas com pinça endoscópica eprotegê-lo durante o transporte para o local da ferida por meio de um grande, tampão endoscópica transparente.
- Aplicar toda a superfície da construção ADSC folhas ao leito da ferida.
- Suavemente aplicar o construto ADSC folhas durante 10 minutos para se obter um enxerto completa e estável. Para aplicação, utilizar pinça endoscópica ou um tampão endoscópica e aplicar toda a superfície da ADSC construir sobre a camada da submucosa do esôfago.
- Repetir este procedimento quatro vezes para cada animal, a fim de obter quatro constructos-camada de células transplantadas e aderentes duplos.
NOTA: O objectivo é cobrir approximatively metade da área ferida.
5. pós-operatória Avaliação e Acompanhamento
- Para cada animal, garantir pós-ESD analgesia com a injecção intramuscular de 0,2 mg / kg de morfina três vezes por dia para o primeiro dia e com 28 dias de tratamento anti-ácido de esomeprazol (40 mg / dia). Realize profilaxia antibiótica com amoxicillem (1 g / dia), durante 7 dias. Autorizar líquidos no dia 1 e sólidos no dia seguinte.
- Seguir-se com os animais durante 28 dias. Obter avaliações clínicas diárias usando Mellow Pinkas pontuações disfagia 16 e medições de variação de peso.
- avaliação de estenose Multimodal: sob anestesia geral, em dias programados 3, 14 e 28, realizar uma avaliação multimodal de ocorrência de estenose.
- Realizar uma avaliação endoscópica usando descrição cicatriz, medição de estenose, e detecção de membrana suporte de papel. Medir a estenose através do endoscópio para atravessar a estenose (o diâmetro do endoscópio é de 8 mm). Observe a cicatriz, prestando atenção ao aspecto inflamatório (eritema da mucosa, edema da mucosa, e de mucosa hemorragia espontânea) e ausência ou presença da membrana suporte de papel dentro da cicatriz.
- Aplicar sonda verde pCLE através do canal do operador gastroscópio diretamente para a cama cicatriz. Procurar por uma espontâneae organizado sinal verde compatível com construção enxerto ADSC folhas PKH67 marcado.
- Execute 2 incidências ortogonais de esofagografia barita com um aro radiológica (frente e incidências do lado esquerdo). Manter a incidência mais apertado para avaliação estenose (grau de estenose (%) = [1- (comprimento do eixo menor sob estenose / comprimento do eixo normal sob estenose) x 100)]) 17, 18.
- O sacrifício de animais.
- No 28 ° dia, no final do período de seguimento, realizar o sacrifício dos animais. Enquanto o animal está ainda sob anestesia geral, injectar 100 mg / kg de fenobarbital intravenosa. Certifique-se de morte do animal por exame clínico para a ausência de uma batida do coração e de circulação de respirar.
- Após uma exposição esternotomia e órgão, remover o esôfago de cada animal sacrificado (com 10% de fixação de formalina tamponada, inclusão em parafina e secções 4 mm de espessura). Manchar os slidescom Hematoxilina e Saffron 15. Digitalizar os slides para análise computadorizada e comparar os grupos de animais 15.
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Representative Results
A cultura de ADSCs e o procedimento para obter a folha de ADSC é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra a construção do enxerto, composto por duas folhas adsc em camadas umas sobre as outras na sua membrana de suporte de papel. ADSCs foram previamente marcado com o fluoróforo PKH67 para permitir a entrada de monitorização do enxerto vivo com pCLE. A Figura 3 mostra as diferentes etapas de dissecção esofágica submucosa endoscópica prolongado, resultando numa cicatriz esofágica 5 cm e hemi-circunferencial. A Figura 4 mostra o procedimento de transplante endoscópica. O transplante foi bem-sucedida para todos os animais após 10 min de aplicação suave. A Figura 5 mostra a avaliação pCLE positivo no dia 3, confirmando o sucesso do procedimento de transplante.
O período de acompanhamento permitiu analys estenose multimodais é. As diferentes avaliações são mostrados nas seguintes figuras e tabelas. Comparado ao grupo controle, o grupo de animais transplantados mostraram problemas para alimentar menos frequentes e maior ganho de peso no dia 28. Um animal do grupo transplantado desenvolveu uma estenose esofágica grave, em comparação a todos os animais do grupo controle. Em comparação com os animais transplantados, os animais de controlo desenvolveram tecido fibrótico significativa. A Tabela 1 mostra os achados clínicos e endoscópicos durante o período de acompanhamento. A Figura 6 mostra a endoscópica e radiológicas no final do período de seguimento em animais transplantados e não transplantados. A Figura 7 mostra as diferentes alterações histológicas entre animais transplantados e de controlo. Estes dados confirmam a eficácia do transplante ADSC folhas para a prevenção de estenose esofágica.
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Figura 1. ADSC folhas Construct. ADSCs A e B. Early-passagem em placas de cultura padrão com diferentes ampliações. adsc folhas foram obtidos por cultura de ADSCs PKH-marcados em placas de cultura comercial de temperatura-sensível. C. Quando a temperatura de incubação foi reduzida para 20 ° C (temperatura ambiente), todas as células espontaneamente isoladas a partir das superfícies de prato como folhas adsc intacto, sem a necessidade de tratamento enzimático. D. Um ADSC folha colhida antes da construção do enxerto utilizando uma membrana de transferência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Duplo ADSC folhas Construct. A, B, e C. O dia antes transplantation, ADSCs PKH-marcadas foram colhidas em número precoce passagem (P4 - P5), semeadas em uma cultura de células de temperatura-sensível de 12 poços, e cultivadas a 37 ° C e 5% de CO 2 com meio alfa essencial mínimo incluindo 10% fetal antibióticos de soro bovino e 1% (penicilina e estreptomicina). Cada cavidade foi revestida com uma membrana de poli-N-isopropilacrilamida (na parte inferior de cada cavidade) e semeado com 1,5 x 10 6 células. Quando a temperatura de incubação foi reduzida para 20 ° C (temperatura ambiente), todas as células de forma espontânea isolada como folhas adsc intacta, sem a necessidade de tratamento enzimático. D. esquema teórico da construção de dupla camada de células composta por duas folhas adsc em camadas umas sobre as outras e aplicada a uma membrana de suporte de papel. E. vista macroscópico de uma construção de camada de células dupla completou. Modificado de Referência 15. Por favor, clique aqui t o visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3. endoscópica submucosa Dissection Processo. Marcas A. endoscópicos foram criados para delinear a área de ressecção, variando de 40 a 45 cm da arcada dentária e envolvendo metade da circunferência. B. A injeção submucosa de uma solução de glicerol que contém o corante índigo carmim. O objectivo da presente injecção foi a de separar a camada de mucosa da túnica muscular, a fim de expor a camada da submucosa. C. incisões periféricos foram realizados externamente para as marcas endoscópicos, revelando a camada submucosa injectado. D. A visão endoscópica no final da dissecção submucosa mostrando um 5 cm de comprimento e de hemi-circunferencial cicatriz esofágica.et = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Duplo ADSC folhas endoscópica Transplante de Processo. A. Quatro ADSC constrói pronto para ser transplantado. B. Protecção do ADSC construir sob uma grande tampa endoscópica antes do transplante. View C. endoscópica da travessia da faringe animal, mostrando a construção ADSC protegidos sob o tampão endoscópica. D. 10 min de aplicação foi suficiente para se obter a aderência da folha. A aplicação foi feita utilizando a tampa endoscópica ou pinça endoscópica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Conclusões pCLE. pCLE no dia 3 mostra sinais espontâneos e intensos semelhantes aos obtidos in vitro, compatível com uma camada de células-transplante bem sucedido. Nenhum sinal foi encontrado nos dias 14 e 28. A. A in vitro sinal pCLE de ADSCs em suspensão. B. O sinal pCLE in vitro de ADSCs organizados em uma camada de células. C. A in vivo pCLE aplicação sonda para a cicatriz no esôfago. D. O sinal pCLE in vivo de ADSCs visualizado no dia 3 após o transplante. Modificado de Referência 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Os resultadosda Análise morfológica no dia 28. Em comparação com o grupo controle, os achados endoscópicos e radiológicos no dia 28 mostrou uma pequena e leve estenose sem dilatação a montante e uma mucosa completamente re-epitélio. Modificado de Referência 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. histológica avaliação das áreas de estenose. A análise histológica foi realizada após HES-rotulagem e digitalização de slides. Em animais transplantados (a), o processo de cura foi melhorada, com o aumento da re-epitelização e diminuição do desenvolvimento da fibrose, em comparação com animais não transplantados (B). desenvolvimento do tecido fibrótico intensa foiobservada devido à destruição muscular mucosas, fibrótica interior invasão da camada muscular, e grandes defeitos da mucosa. Modificado de Referência 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Avaliação clínico durante o período de acompanhamento. As avaliações clínicas foram realizadas utilizando uma avaliação clínica diária de acordo com a pontuação Mellow Pinkas e com a variação de peso. (*) Mellow Pinkas marcar 16. Modificado de Referência 15.
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Discussion
Neste modelo suíno, o transplante ADSC folhas foi tecnicamente bem sucedida, ea avaliação in vivo pCLE permitido para monitoramento enxerto de células. As avaliações clínicas, endoscópicos, radiológicos e histológicos demonstraram a eficácia da folha ADSC endoscópica na prevenção de estenose esofágica após ESD estendida.
O transplante endoscópica de uma solução ADSC glicerol contendo uma folha de carmim indigo é uma abordagem inovadora em medicina regenerativa. Ohki et ai. em primeiro lugar descrito o procedimento de transplante endoscópica. Nos seus estudos, construções de camada de células foram feitos de folhas de células epiteliais da mucosa bucal em camadas sobre uma folha fina de difluoreto de polivinilideno, utilizado como uma membrana de suporte 10, 11, 19. A membrana de suporte foi apreendido com pinça endoscópica e cuidadosamente colocados no leito da úlcera. Cell-folha de aderência foi obtido após 10 min de aplicação suave. Este processo ainda não foi reproduzida. Neste estudo, construções duplas ADSC folhas foram transplantadas por várias razões. A escolha de ADSC baseou-se em vários estudos que demonstraram as suas capacidades anti-inflamatórios, especialmente no processo de cicatrização da pele. ADSCs são conhecidos para modular queratinócitos e fibroblastos interacções 7. O mecanismo do desenvolvimento da fibrose é complexa e apenas parcialmente compreendido. O efeito parácrino parece desempenhar um papel importante na acção ADSC, incluindo a produção de factor anti-inflamatório, tal como TGF-p e factores pró-angiogénicos 20.
transplante ADSC folhas endoscópica tem várias limitações. Em primeiro lugar, as folhas de células foram aplicadas durante 10 minutos à cicatriz esofágica para obter uma adesão estável. Esta parte do procedimento foi desafiador, tecnicamente difícil, e teve de ser realizada por um endoscopista experiente. No entanto, todos os animais foram transplantadas com sucesso, confirmando a viabilidade do procedimento endoscópico. Recentemente, o uso de um dispositivo de impresso-3D para melhorar o sucesso de transplante de camada de células foi relatada 21. Em segundo lugar, esta técnica está associada com uma taxa de sobrevivência desconhecido. Uma cicatriz de esôfago é um ambiente agressivo para as células. Um prato de temperatura-sensível permite a produção da célula de folhas através de construir a matriz extracelular e para a formação de ligações celulares. Assim, para melhorar a taxa de sobrevivência e as interacções adsc, uma construção de dupla-ADSC folha foi escolhido 22, 23. Este estudo não foi desenhado para avaliar quer a taxa de sobrevivência celular ou o efeito da dose de transplante na prevenção estenose esofágica, que são duas questões importantes. Em terceiro lugar, tal como no Ohki et ai. , A utilização de uma membrana de suporte foi necessário para realizar a construção ADSC folhas. à réer transplante, a membrana de papel de apoio não pode ser removido sem destruição construto. Este material estranho intra-esofágica foi responsável pelo aumento da inflamação. Uma técnica optimizada iria permitir a remoção da membrana de suporte de papel.
monitoramento transplante com pCLE também foi um desafio. Esta nova técnica de imagem endoscópica permite na análise histológica vivo, incluindo a visualização do padrão glandular, micro-vascularização, e alteração celular. pCLE foi avaliada em muitas doenças digestivas, tais como a doença inflamatória do intestino, o esófago de Barrett, e cistos pâncreas mucinosos 24, 25. O fluoróforo PKH67 pCLE compatível foi utilizado para marcação celular. Um sinal de fluorescência compatíveis com a presença da folha ADSC foi observada em 4 animais no dia 3. Este resultado positivo reflectiu o sucesso do transplante ADSC folhas. No entanto, becauso PKH67 tem um sinal diminuiu ao longo do tempo e após a divisão celular, a avaliação pCLE era possível apenas alguns dias após o transplante 26. Ohki et ai. e Kanai et al. monitorizados transplante camada de células através de imunocoloração, e que confirmaram a presença de células até 8 dias após o transplante. células maduras foram usadas neste estudo, as quais têm a vantagem de imunomarcação específica.
estenose de esôfago é um dos eventos adversos mais graves seguintes ESD, limitando assim o desenvolvimento da técnica. técnicas ideais para prevenir a formação de estenose ainda faltam. Na prática clínica, os pacientes com ESD esofágica prolongada são prescritos diferentes tratamentos preventivos, tais como corticosteróides, dilatações balão endoscópicos, ou esôfago stenting 27. Aplicação local de biomaterial foi realizado, com resultados variados 28, 29 30, 31. Um re-epitelização precoce e aumentada foi observada na cicatriz esofágica. Para imunomodulação local, poucos dados estão disponíveis na literatura sobre a injeção ADSC ou aplicação da membrana amniótica 32, 33. Observou-se a formação de estenose tardia e uma taxa de estenose diminuiu.
Neste modelo de porco, o procedimento de transplante endoscópica-camada de células foi realizada com sucesso. ADSCs transplantados organizadas em folhas de células duplas demonstraram a sua capacidade de prevenir a formação de estenose de esôfago após ESD estendida. Os mecanismos envolvidos na cicatrização ADSCprocesso são mal compreendidos e deve ser investigado em estudos futuros. Assim, tendo em conta estes resultados promissores, um ensaio clínico deve ser realizado para avaliar a eficácia da construção ADSC folhas depois estendido ESD em pacientes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transparent endoscopic cap Q180 compatible | Olympus Optical Co | ||
| GIF-Q180 gastroscope | Olympus Optical Co | ||
| Videoscope System Exera II | Olympus Optical Co | ||
| Injection needle 18 G | Olympus Optical Co | ||
| Electrosurgery unit ERBE ICC 350 | ERBE Technology | ||
| Indigo carmin 1% | Life | ||
| Endoscopic hybrid knife | Life | ||
| Minisonde Z pCLE green probe | Mauna Kea Technology | You must learn how to use the probe. The manipulation could be difficult. | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12105C | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T146 | |
| Alpha minimum essential medium | Thermo Fisher | 22561-021 | |
| Phosphate-Buffered Salines | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| PKH67 dye kit | Sigma Aldrich | Mini67-KT | |
| 12-well temperature responsive cell culture dish | Upcell Thermo Scientific | 174900 | Feel the weel with 4 mL standard medium culture 30 min before seeding cells |
| Esomeprazole 40 mg | Biogaran | ||
| Moprhine sulfate 50 mg/mL | Lavoisier | ||
| Amoxicilline 1 g | Biogaran | ||
| Ketamine 250 mg/5 mL | Panpharma | ||
| Propofol 10 mg/mL | Fresenius | ||
| Hydrophobic paper | Carrefour |
References
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