The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.
For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.
Spise er afgørende; dog deregulering af fødeindtagelse resulterer i spiseforstyrrelser såsom bulimi, anoreksi eller den generelle tendens til at spise for meget pålægger omkostninger på enkeltpersoner og samfundet 1, 2, 3. Målet med den nuværende forskning er at afdække reguleringsmekanismer af fødeindtagelse og give en strategi for at omgå uorden formation. Talrige undersøgelser anvender pattedyr modelorganismer har givet ny indsigt i kredsløb og den rolle, signalsystemer i spiseforstyrrelser 4, 5, 6. Ikke desto mindre er vores viden om neuronale og molekylære baser ligger til grund for disse lidelser er stadig langt fra afsluttet. I de seneste år, frugten flyve Drosophila melanogaster er blevet et værdifuldt modelsystem til optrevling grundlæggende mekanistiske indsigt i reguleringen af metabolism 7, 8, 9. Kapillarrøret Feeder (CAFE) assay for Drosophila melanogaster blev etableret i laboratoriet af Seymour Benzer i 2007 inspireret af et tidligere arbejde af Dethier i blowfly 10, 11. CAFE assay gjorde det muligt direkte at måle fødeindtagelse i Drosophila melanogaster. I denne adfærdsmæssige testsystem, fluer lever af flydende fødevarer omhandlet i graduerede glaskapillarer anbragt inde i et hætteglas. Faldet af kapillære menisk indikerer tab af mad løsning via fordampning og fødeindtagelse. Bestemmelse af fordampning rente med hætteglas uden fluer tillader nøjagtig kvantificering af fødeindtagelse.
CAFE-analysen er en af flere adfærdsmæssige paradigmer bruges til at måle fodring i Drosophila melanogaster og forskere nødt til at vælge den mest hensigtsmæssige for deres specifikkespørgsmål. Beslutningen om at anvende en bestemt assay bør overveje følgende punkter: arten af fødevarer omhandlet; fodring tilstand; måling af indtagelse eller optagelse af næringsstoffer og efterforskning fødevareforbrug eller reaktion på mad.
CAFE assay som beskrevet i denne rapport er ideel til følgende fødeindtagelsen af en flydende fødekilde under en opretstående fodring tilstand. Alternativt fødeindtagelse kan måles for en flue gruppe på en farvet fødekilde i et hætteglas eller på en plade. Fluer normalt dræbt eller bedøvet efter fodring, og mængden af indtaget farvestof bestemmes ved spektrometri eller visuel inspektion af farvede abdomen. Fluer begynder at udskille den indtagne fødevarer kun 30 min efter indtagelse, hvorfor denne fremgangsmåde er vanskelig at anvende til analysen af kontinuerlige længere fodring behaviors 12, 13.
I modsætning fluer holdes intakt ved absorberbar farvestofs med radioaktive sporstoffer anvendes og deres forbrug af radioaktive isotoper er scoret i en scintillationstæller 14, 15. Absorption af det radioaktive ved fluen fordøjelsessystem gør langsigtet mad optagelse måling er muligt, men kan føre til undervurdering af forbruget på grund af ikke-absorberede og udskilles tracer molekyler. En anden tilgang til at måle respons på mad i Drosophila melanogaster er den snabel forlængelse respons (PER), hvilket normalt sker for fødeindtagelse 16. Denne elegante metode måler første reaktion på en fødevare stimulus, men ikke registrerer mængden af indtaget. Fødeindtagelse dynamisk justeres under fodring ved hjælp af flere post-fordøjelsesproblemer feedback-signaler, der er kritiske for regulering af fodring 17, 18. Adskillige forsøg er blevet gjort i de seneste år til semi-automatisere dataindsamling i PER analysen <sup class = "xref"> 19, 20. PER detekteres af en elektrisk pude eller en kombination af elektroder og talt via computer. Kombinere PER assay med radioisotop optagelse afslørede, at dette assay er begrænset af lav følsomhed over for detektion mængde fodring forskelle 18. Den manuelle fodring assay (Mafe) 21, hvori en flue fødes manuelt med et glas kapillarrør, blev for nylig udviklet til måling mad-optagelse i en enkelt immobiliseret flue. Den Mafe assay eliminerer interferens på fødesøgning og fodring initiering og har en tidsopløsning sekunder, og initiering af PER og fødeindtagelse kan overvåges uafhængigt i assayet. Men den måde, hvorpå immobilisering af fluen påvirker visse aspekter af fodring adfærd (f.eks bevægelse, motivation) skal stadig undersøges. For fremragende sammenlignende undersøgelser af forskellige assays til måling fødevareforbruget i Drosophila miglanogaster og hjælpe forskerne finde den mest hensigtsmæssige, se rapporter fra Deshpande og Marx 13, 22.
CAFE assay undgår nogle af ulemperne ved andre assays beskrevet ovenfor og kombinerer nemme at anvende med pålidelig måling af fødeindtagelse. Her er en detaljeret beskrivelse af CAFE analysen forudsat, og vi viser en simpel opsætning modifikation at reducere fordampning. Repræsentative resultater, herunder en to mad valg assay (kort og lang sigt) og saccharose optagelse af fluer er påvist. I diskussionen sammenligner vi vores beskrevne metode med alternative måder at udføre CAFE analysen, og fremhæve potentielle begrænsninger.
Rapporten beskriver CAFE analysen i en trin-for-trin mode med fokus på den tekniske opsætning og gode præstationer i laboratoriet. På grund af sin enkelhed, kan dette assay også anvendes uddannelsesmæssigt som en skole eksperiment. Eksemplerne viser, at analysen giver undersøgelse af fødevarer sensing, præferencer og forbrug i Drosophila melanogaster over korte og længere perioder (timer til dage). CAFE-analysen er blevet anvendt bredt i marken for at undersøge emner, herunder mad og forbrug af narko…
The authors have nothing to disclose.
We thank the past and present members of the Scholz lab for discussion and Helga Döring for excellent technical support. We especially thank the members of the Biocenter workshop of the University of Cologne for their support and creativity. The work is supported by SFB 1340, SysMedAlc, and DAAD-Siemens.
Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied | ||
Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
Cover for the plastic box | Dimensions (37 x29 x18 cm) | ||
Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
Food color (red, E124) | Not stated | ||
Food color (blue, E133) | Not stated | ||
Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
Digital caliper | |||
Standard fly food | (for 20 L) | ||
Agar | 160 g | ||
Brewer`s Yeast | 299.33 g | ||
Cornmeal | 1200g | ||
Molasses | 1.6 L | ||
Propionic acid | 57.3 mL | ||
Nipagin 30% | 160 mL |