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Neuroscience

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정 doi: 10.3791/55024 Published: March 17, 2017

Introduction

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식사는 필수적이다; 그러나, 폭식증, 거식증 또는을 강요을 과식하는 일반적인 경향과 같은 섭식 장애의 결과로 음식 섭취의 규제 완화는 개인과 사회 1, 2, 3의 요금으로 제공됩니다. 본 연구의 목적은 음식 섭취의 조절 메커니즘을 밝히기 위해서 무질서 형성을 회피하기위한 전략을 제공하는 것이다. 포유 동물 유기체 모델을 사용하여 많은 연구 장애 4,5,6 먹는 회로 및 신호 시스템의 역할에 새로운 통찰력을 제공했다. 그럼에도 불구하고, 이러한 질환의 기초가되는 신경 세포 및 분자 기지에 대한 우리의 지식은 완전한에서 멀리 남아있다. 최근 몇 년 동안, 과일 초파리 melanogaster의이 metabolis의 규제에 기본 기계적인 통찰력을 탈피하기위한 가치있는 모델 시스템이되었다 비행m 7, 8, 9. 노랑 초파리의 모세관 공급 장치 (CAFE) 분석은 검정 파리 10, 11 Dethier에 의해 이전 작품에서 영감을 2007 년 모어 Benzer의 실험실에서 설립되었다. 카페 분석은 가능한 직접 초파리에서 음식 섭취를 측정하기 위해 만든. 이 행동 테스트 시스템에서, 파리는 유리 병 내부에 배치 그레이드 유리 모세관에서 제공하는 액체 음식을 먹고. 모세관 메 니스 커스의 감소는 증발 및 음식 소비를 통해 음식 용액의 손실을 나타낸다. 파리없이 튜브에 의해 증착 속도를 결정하는 것은 음식 섭취의 정확한 정량을 허용한다.

카페 분석은 초파리에서 먹이를 측정하는 데 사용되는 여러 행동 패러다임 중 하나이며 연구자들은 특정에 가장 적합한 하나를 선택해야문제. 다음과 같은 점을 고려해야 특정 분석법을 사용하도록 결정 : 제공된 식품의 성질; 공급 조건; 섭취 또는 영양소의 흡수 및 조사 식품 소비 식품에 대한 응답의 측정.

이 보고서에 설명 된대로 CAFE 분석은 직립 공급 조건에서 액체 음식 소스의 음식 섭취를 다음에 이상적이다. 또는 음식 섭취는 유리 병이나 접시에 색깔의 음식 소스에 비행 그룹에 대해 측정 할 수있다. 파리 정상적으로 죽거나 마취 먹이 섭취 후 염료의 양은 분석법 또는 염색 복부 육안으로 판정한다. 파리는 30 분 섭취 후 섭취 한 음식을 배설하기 시작, 따라서이 방법은 지속적으로 더 이상 공급의 분석을 위해 사용하기 어려운 13, 12 행동들.

반면 파리는 때 흡수 염료 그대로 유지된다방사성 트레이서들과 사용되며 동위 원소들의 소비 섬광 계수기 (14), (15)에서 획득된다. 플라이 소화 시스템에 의해 방사성 표지의 흡수는 장기적으로 음식 섭취 측정이 가능하게하지만, 때문에 비 흡수 및 배설 추적 분자의 소비의 과소 평가로 이어질 수 있습니다. 또 다른 방법은 melanogaster의 일반적으로 음식 섭취 (16)에 대해 발생하는 코 확장 응답 (PER)이며, 초파리의 음식에 대한 반응을 측정합니다. 이 우아한 방법은 음식의 자극에 대한 초기 반응을 측정하지만, 섭취의 양을 기록하지 않습니다. 음식 섭취를 동적으로 공급 (17) (18)의 조절에 중요한 여러 포스트 소화 피드백 신호를 이용하여 공급 중에 조절된다. 몇 번의 시도는 PER 분석에서 반 자동화 데이터 수집에 최근되었습니다 19, 20입니다. 당은 전기 패드 또는 전극의 조합에 의해 감지되고 컴퓨터를 통해 계산됩니다. 방사성 동위 원소의 흡수와 PER 분석을 결합하면이 분석은 양 먹이의 차이 (18)를 검출하는 낮은 감도에 의해 제한되는 것으로 나타났습니다. 비행은 유리 모세관을 사용하여 수동으로 공급하는 수동 급지 분석 (MAFE) (21)는, 최근에 고정화 한 즉석 식품 섭취량을 측정하기 위해 개발되었다. MAFE 분석은 개시 꼴 및 공급의 간섭을 제거하고, PER의 시간 (초)의 해상도 및 개시가 있고 음식 소비 분석 독립적으로 모니터링 할 수있다. 그러나 상기 방법은 상기 플라이 고정화 (예 운동 동기)이 아직 조사해야 급전 동작의 특정 측면에 영향을 미친다. 초파리 나 음식 소비를 측정하기위한 다른 분석의 우수한 비교 후기lanogaster은하고, 가장 적합한 하나를 찾는 연구에 도움 데쉬와 마르크스하여 보고서를 볼 수 있습니다 13, 22.

카페 분석은 위에서 설명한 다른 분석의 단점 중 일부를 방지하고 음식 섭취의 신뢰성있는 측정과 사용의 단순성을 결합한다. 여기서, 카페 분석의 상세한 설명을 제공하고, 우리는 증발을 감소시키기 위해 간단한 설정 변경을 보여준다. 두 음식 선택 분석 (단기 및 장기)과 파리의 설탕 섭취를 포함하는 대표적인 결과가 증명된다. 토론에서 우리는 CAFE 분석을 수행하고 잠재적 인 한계를 강조하기 위해 다른 방법으로 우리의 기술 방법을 비교한다.

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Protocol

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1. 카페 분석

참고 : 실험 유리 병, 특정 뚜껑과 마이크로 모세 혈관 : 분석법은 세 가지 구성 요소로 구성되어 있습니다. 커버 플라스틱 상자가 제조 된 튜브를 운반하고보다 효율적으로 습도를 제어하기 위해 사용된다.

  1. 분석을위한 튜브로 초파리 melanogaster의 문화 플라스틱 병 (옵션 8cm 높이 3.3 cm 직경)를 사용합니다.
  2. O 링 (도 1A, 1B)를 포함하는 제조 플렉시 유리 뚜껑 유리 병을 밀봉합니다. 로드 눌러 나 또한 공기 순환 및 물 공급을 가능하게 뚜껑의 중앙 개구 (0.9 cm 직경)를 통해 취관과 파리, 그리고 스폰지 마개로 구멍을 닫습니다. 여섯 작은 원추형 개구 (0.4 cm 상부 직경 0.3 cm의 내경)의 중앙 구멍을 둘러싸 2 피펫 팁 적합 - 대신에 모세관을 유지하도록 20 μL 볼륨. (뚜껑의 기술적 인 세부 사항에 대한 보충 수치를 참조하십시오.)
    참고 : 사용대신에 우리의 원고에 사용되는 사용자 정의 만든 뚜껑의 모세 혈관에 대한 개구부 스폰지 스토퍼 가능하다. 우리의 사용자 정의 뚜껑 모세 혈관이 떨어지는 위험을 최소화 제조 된 유리 병의 안전한 취급을 할 수 있습니다.
  3. 액체 음식을 제공하기 위해, 1 μL 마크 5 μL의 마이크로 캐 필러를 사용합니다. 구멍 (빨간색 가장자리로 표시된 그림 1B)에 팁을 20 μL 피펫 팁과 삽입 - 2의 상단을 차단하여 뚜껑의 원추형 구멍의 모세 혈관을 놓습니다. 같은 구멍에 20 μL 피펫 팁 - 탈출 파리를 방지하기 위해, 포경 (2)를 삽입합니다.
  4. 안전하게, 여러 준비 튜브를 처리 그리드 화 인레이 (그림 2A)와 플라스틱 상자에 그들을 배치합니다.

파리 2. 준비

  1. 25 ° C, 상대 습도 60 %와 12 시간 / 12 시간 명암주기에 표준 음식에 파리를 유지합니다.
  2. 사육 조건을 제어 (35) 처녀 여성을 소개하는50 ㎖를 포함하는 플라스틱 배양 병에 각 실험 그룹 D (15) 남성 (9.8 cm 높이 4.8 cm 직경) 음식을 비행. 파리 후 성인이 신선한 음식 튜브 (으)로 운항하는 항공사로 전송하고이 두 개 더 일 동안 알을 낳는하자, 처음 3 일 동안 알을 낳기 할 수 있습니다. 이 후 다시 전송을 반복합니다. 취소 성인 2 일 이상 후 파리.
  3. 음식 섭취 플라이 크기에 의존하기 때문에, 3 일된 어른 2- 마취 100 파리의 그룹의 중량을 결정하는 공동이 플라이 패드를 사용하고, 1.5 mL의 플라스틱 튜브로 수집하고, 표준 측정 날아 실험실 규모. 성별 (표 1)에 의해 분류 적어도 네 개의 독립 플라이 군의 습윤 중량을 결정하고; 플라이 밀리그램 당 μL 음식 소비를 계산하는 가중치를 사용한다. 단일 플라이는 실험 당 사료 식품의 양을 결정하고, 피드백함으로써 모세관 비우는 않도록 따라서 음식으로 채워진 모세관의 수를 조정하는 값을 사용한다.
    1. 3 시간 분석, 사용20 파리와이 가득 모세 혈관. 장기간 실험 (> 3 시간 및면 9 일)의 경우, (신뢰할 수있는 결과를 설명하는 조건으로 8 개 미만의 파리 얻을 수 없다) 네 채워진 모세관 공급 8 개의 파리의 그룹을 사용한다.
  4. CO 2 노출에서 무게를 측정 한 후 그룹 (8 또는 20 파리)에 별도의 파리. 진정 CO 2에서 48 시간 동안 이전 실험을 복구 할 수 있도록 (15 mL를 표준 식품을 포함한) 새로운 식품 바이알 그룹 전송. 카페 분석을 위해 4 ~ 6 일 된 파리를 사용합니다.
  5. 비 - 고갈 야생형 파리 그나마 피드로 19, 21, 프리 굶주 리기 3 시간 공급 실험 날아간다. 식품 소비가 며칠 동안 모니터링 할 때 어떤 금식이 필요하지 않습니다. 금식의 경우, 전송은 부드럽게 ~ 0.5 mL의 DDH 적신 만 45 mm 직경 접힌 종이 필터를 포함하는 유리 병에 그들을 활용하여 시험을하기 전에 16 ~ 20 시간을 날아2 O (증류수를 두 번)와 연결 CAFE 분석 뚜껑을 닫습니다.

액체 식품의 3. 준비

  1. 100 mL의 DDH 2 O. 피펫 3 μL, 33 μL, 333 μL, 3.3 mL의 6.6 mL로 102.6 g 자당 (C 12 H 22 O 11)을 작성하여 (w / v를 10 %) 크로스 원액을 3 M 준비 15 mL의 플라스틱 튜브에 원액; 2 mL의 음식 색상의 추가 (적색 : 코치 닐 [E124] 청색 : 인디고 카민 [E132]) 및 DDH 2 O. 10 mL를 채우기 결과 농도는 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2 M 자당 있습니다 .
    주 : 식품 색소는 쉽게 메 니스 커스를 시각화 허용한다. 그러나, 염료는 음식물 섭취에 영향을 미칠 수있다. 염료에 음식 염료를 분배 또는 실험 및 그룹 중 음식 샘플에 염료의 사용을 무작위로 인한 바이어스를 방지합니다.
  2. 알코올 환경 피펫을 위해 15 ML의 플라스틱 튜브에 3 M 자당 원액 333 μL를 테스트합니다.100 %의 EtOH (에탄올) 1.5 ㎖ (2.3 ml)에 추가 15 % (0.25 밀리미터) 및 23 % (0.39 mM)을 작동하는 솔루션 발생하는 10 ㎖까지 DDH 2 O를 추가합니다.
  3. 4 ° C에서 스톡 -20 ° C에서 솔루션과 작업 솔루션을 계속; 일주일 내 사용합니다.
  4. 모세관 력에 의해, 착색 음식물 용액과 동시에 열 모세관까지 채운다. 자당 용액 (용액에 45 ° 각도로 모세 혈관을 들고)로 모세 혈관의 끝을 삽입합니다. 액체가 최고 모세관 (5 μL) 마크에 도달하면 중지하고 휴지와 외부와 내부를 초과 솔루션을 제거합니다.

4. 조립 및 모세관 공급 분석을 수행

  1. 금식이 필요하지 않은 경우, 눌러 또는 블로우 파이프에 의해 분석에 대한 실험 파리를 전송합니다. 증발을 정량화 파리없이 세 가지 제어 튜브를 포함해야합니다.
  2. 외부 오프닝의 하나를 닫는 - (20 μL 볼륨 2) 조심스럽게 피펫 팁을 제거GS, 먼저 채워진 유리 모세관, 하단 끝을 삽입합니다. 다시 옆에있는 모세관에 피펫 팁을 배치하여 모세관을 고정합니다. 몇몇 식품 용액이 테스트되는 경우, 따라서,이 절차를 반복한다.
  3. 장소 모세관 음식 소스가 서로 다른 높이에 위치 된 경우 발생할 수있는 바이어스 방지하기 위해 동일한 수준의 모든 유리 병 안에 종료 (3 - 뚜껑 4 센티미터); 실수 필터 종이 식품 소스 상이한 점도를 터치하여 누설 모세관 않도록 여과지까지의 거리를 유지한다.
  4. 마커 펜 (시작 마크)를 사용하여 착색 된 액체의 상단부 라벨. 그들 개별적 색 스트라이프 또는 코드를 사용하여 라벨, 상이한 모세관 식별 할 수 있도록한다.
  5. 그리드 화 속지와 플라스틱 상자 안에 여러 준비 CAFE 분석을 놓고 실험실 조건에서 또는 온도 -, 라이트 - 습도 조절 CLIM에서 안전한 위치로 (그림 2A) 상자를 전송실험 기간 (예 : 3 시간 또는 일)에 대한 : 챔버 (25 ° C, 상대 습도 60 %, 12 시간 / 12 시간 명암주기 매개 변수)를 먹었다.
  6. 분석은 몇 일 동안 수행되는 경우 아래 필터 종이 밖으로 건조 된 바와 같이, 스폰지 마개 (100 μL)를 통해 매일 24 시간이 분석의 내부 습도를 일정하게 유지하기 위해 신선한 물을 적용합니다. 습도 장치로 30 ㎖ DDH 2 O 가득 네 개의 분리 된 유리 병 (8 cm 높이 3.3 cm 직경)를 사용하고 플라스틱 상자에 CAFE 분석 옆에 배치합니다. 실험 (그림 2A) 중에 습도 제어 환경을 만들기 위해 플라스틱 상자 커버를 사용합니다.
    참고 : 넓은 다양성은 실험실 조건에서 발생; 그러나, (a 교실 예.)을 실온에서 카페 분석을 수행 가능하다. (플라스틱 상자 물 튜브와 커버를 충전 또는 젖은 스폰지 마개없이 여과지) 가습 장치의 사용은 고도의 (증발을 감소 권장
  7. 장기 실험을 매 24 시간 동안 갓 채워진 사람과 모세 혈관을 교체합니다. 각 24 시간 간격 전에 죽은 파리의 메모를 확인하고 다음 기간 동안 비행 당 소비를 계산하는 라이브 파리의 수를 사용합니다. 메 니스 커스의 감소 (5.1 참조) 측정 후 이전의 모세 혈관을 폐기하십시오.
    참고 : 우리는 거의 죽은 파리를 볼 수없는 3 시간의 실험이 진행되는 동안. 3 죽은 파리 - 4 일 연구 기간 동안 우리는 일반적으로 하나를 찾을 수 있습니다.
  8. 카페 분석이 직립 위치에있는 동안 분석 또는 모세관을 교체하기 전에 끝에서, 마커 펜으로 모세관 (마크 끝)의 하부 메 니스 커스 (meniscus)를 표시합니다. 마크 단부 (개시 마크) 초기 마크 아래가 아닌 경우 데이터를 버린다. 이 메 니스 커스 변경 될 수 있습니다로, 뚜껑을 제거하지 마십시오.
  9. 조심스럽게 분석에서 모세 혈관을 제거하고 데이터 수집을 위해 저장합니다. discar 않을 경우 모세관 내의 액체가 하부 끝에 도달하는지 확인D 데이터, 음식이 파리에 액세스 할 수 없습니다 있다는 사실. 그룹으로 바이알 당 모든 모세 혈관을 수집합니다. 탈출 파리를 방지하기 위해 모든 입구에 포경 피펫 팁을 삽입합니다. 설치를 해체하고 더 사용하기 위해 실온에서 비누 목욕 및 건조 하룻밤에 유리 병, 뚜껑 및 스폰지 마개를 씻는다.
    주 : 파리 더 분석 한 후 분석 될 수있다. 눈으로 또는 해부 현미경으로 음식 섭취를 확인합니다.
  10. 적어도 세 가지 다른 일에 동일한 유전자형과 반복 실험.

5. 데이터 수집 및 분석

  1. 캘리퍼스 또는 통치자를 사용하여 모세관에 마크 시작과 마크 사이의 거리를 측정한다. 스프레드 시트에 직접 데이터를 전송하는, 디지털 캘리퍼스 (도 1E)에 접속 된 USB (범용 직렬 버스)를 사용한다. 측정 후 모세 혈관을 폐기하십시오.
  2. 모세관 크기에 대한 계정 음식 섭취 또는 증발을 계산합니다. 예를 들면, 캡을 고려길이 73mm 인 음식 솔루션의 5 μL를 포함 illary. 메 니스 커스에서 14.6 mm의 감소는 1 μL 솔루션의 흡수를 반영한다. 다음 식을 사용하여 음식물 섭취량을 계산한다 :
    식품 섭취 (μL) = 측정 거리 (mm) / 14.6 mm
  3. 음식 섭취에 증발의 효과를 제외하려면, 파리없이 세 (최소) 제어 튜브의 증발을 의미 계산합니다. 파리에 의해 식품 소비에 대해 얻은 값에서이 평균 값을 뺍니다.
  4. 비행 당 총 소비량을 확인하려면 다음 수식을 사용하여
    식품 소비 (μL) = (식품 섭취 [μL] - 증발 손실 [μL]) / 유리 병에 파리의 총 수입니다. 장기적 실험은 24 시간주기의 시작 전에 살아있는 파리의 수를 사용한다.
  5. 이러한 암수 파리와 같은 신체 크기의 차이를 설명하기 위해, 체중 먹이 섭취량 (식품 μL / mg의 플라이)을 정상화.
  6. 데이터 분석을위한 통계 소프트웨어를 사용합니다. 규범에 대한동맹 분산 된 데이터를 사용 학생의 T의 -tests 두 비행 그룹 간의 차이를 결정하고, 두 개 이상의 그룹에 대한 사후 Tukey에 크레이머 테스트와 ANOVA (분산 분석)를 사용합니다. 선택의 상황에서, 비모수 하나의 샘플 기호 테스트를 사용하여 임의의 선택이 차이점을 분석한다.

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Representative Results

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1118 유전자형의 파리는 분석이 수행되는 방법을 설명하는 데 사용됩니다. 1118 돌연변이는 일반적으로 트랜스 제닉 라인들을 생성하고, 도입 유전자의 유전 적 배경에 흰색 유전자 표시 제어하기 위해 사용된다. 일반적으로, 행동 실험을 위해, 모든 유전자 변형 라인은 실험 대조군으로 사용되는 것과 동일한 w 1,118 재고에 다섯 세대에 backcrossed된다. 우리는 여러 실험을 보여 변형 된 셋업 증발 손실 비교 단기 음식 선택 실험 장기적인 음식 섭취 실험 다른 자당에 희석 실험.

증발 카페 분석의 성능에 중요한 역할을한다. 우리는 증발 감소 우리의 분석에 추가 방법을 포함 : ⅰ) 중앙 스폰지 마개가 물 24 시간마다 리필됩니다; ⅱ) ADDI적인 물 (4.6 참조) 습도 인클로저를 생성하는 상자 반송 박스 내 튜브 및 커버 III)의 사용을 채웠다. 않고 상술 한 장치와 설치의 증발을 비교 증발의 상당한 감소가 보여진다. 에탄올 함유 용액의 높은 변동성에도 효과가 새 설정을 사용하여 감지 할 수 없습니다.

두 선택 식품 실험 20 파리의 그룹을 3 시간 동안 공급할 수있다. 자연 환경에서 초파리는 알코올 (22)와 과일을 발효에 우선적으로 공급하고,이 파리 에탄올 (23)없이 효모 자당 솔루션에 비해 에탄올과 효모 자당 솔루션을 선호, 비슷한 설정을 사용하여 표시되었습니다. 여기에,이 음식 선택이 제공되며, 붉은 음식 색으로 표시 0.1 M 자당 용액과 푸른 식품 색상 (그림 1A, C)로 표지 15 % EtOH로 0.1 M 자당 솔루션입니다. 비주얼 전복부의 아 민화는 파리 두 솔루션 (그림 1D)에 공급을 나타냅니다. 플라이 당 식품 소비를 EtOH (도 3a)를 포함하는 용액에 대한 크로스 (약 2 배) 상당히 크다.

후속 실험 장기 연구에서, 여덟 파리의 그룹은 4 일 동안 유사한 음식 소스에 대한 액세스를 가지며, 파리 매일 (도 3b)의 에탄올을 함유하는 식품을 더 소모한다. 에탄올 선호 지수 ([SUC +를 EtOH] - [SUC] / 총 소비)이 기간 (평균 = 0.29, 표 4)을 통해 일정하게 유지된다. 관찰 된 에탄올의 환경 설정은 다른 음식 소스 24, 25, 26를 구별 할 수 날아 여러 가지 다른 출판물과 방송과 일치한다. 관찰 된 에탄올 매력의 다른 열량 내용의 결과 일 수 있습니다제공된 솔루션과의 에탄올 (24)의 보람 속성. 상기 분석은 보조 식품의 부정적인 영향을 측정하는데 사용될 수있다. 안드와 동료들은 파라쿼트 (산화 약물)의 응용 프로그램이 식품 소비 10 감소 이러한 방법의 첫 번째 책에서 보여 주었다.

다음 실험에서 양성 간 음식 섭취의 차를 나타낸다. 대사 요구 사항은 남성과 여성의 D. melanogaster의 사이에 차이가 있습니다. 예를 들어, 남성 파리 여성은 탄수화물이 풍부한 식단 (27)을 통해 단백질이 풍부한 식단을 선호, 계란 생산 과정, 증가 된 단백질 생합성을 필요로하는 단계 탄수화물이 풍부한 음식을 선호하면서. 정합 암수 파리는이 실험에 사용 하였다. 20 세 남성 및 H 급지 간격 내 여성 20 파리 사이 음식 섭취량의 차이를 분석하기 위해, 카페 분석법 자당 승낙을 사용하여 수행배급 시리즈. 다섯 모세 혈관은 10까지 솔루션을 제공했다 - 3 2 M 자당에, 각 솔루션의 소비는 (그림 4A)를 측정 하였다. 결과는 남녀 모두가 음식 소스 (그림 4A)로 고농도 자당 솔루션을 선호하는 것으로 나타났다. 그러나, 여성이 남성 (P <0.05)에 비해 두 낮은 농도의 수크로오스 용액의 훨씬 더 많은 소비; 한편, 수컷은 높은 농도의 용액 (P <0.001)의 훨씬 더 많은 소비. 이러한 데이터는 몸 크기의 차이를 고려하지 않았다 있습니다. 여성 D. melanogaster의이 남성 (표 1)보다 일반적으로 더 크고 무겁다. 식품 소비가 질량을 비행 정상화 될 때, 저 자당 솔루션의 소비 남성과 여성의 차이는 더 이상 중요하지 않습니다. 요약하면, 수컷 이전 데이터와 일치 정합 여성보다 수크로오스 용액을 소비 REFL가능한 다른 대사 요구, 영양 환경 설정이나 두 남녀 사이의 모세 혈관에 공급하는 기능이 간단한 차이를 돌출 한 칼라.

그림 1
그림 1 : 초파리 melanogaster의 모세관 공급 분석. A) 파리와 공급 분석. 적신 여과지 유리 병의 바닥에 물을 제공한다. 네 개의 모세 혈관 실험 (반대 모세 혈관에서 적목과 푸른 색의 음식) 동안 제공됩니다. 모세 혈관이 두 번째 피펫 팁에 의해 위치에 고정되어 있습니다, 사용되지 않는 위치는 피펫 팁을 사용하여 폐쇄된다. 뚜껑의 중심에 거품 플러그는 공기 교환을 할 수 있습니다. B) 뚜껑의 상세보기. 컷 피펫 팁 (2-20 μL, 붉은 테두리)는 미사용 위치의 원추형 개구 및 제 PI에 삽입pette 팁 구멍을 닫습니다 절단 팁에 삽입됩니다. 절단 피펫 팁이 마이크로 캐 필러의 위치를 ​​제어하는 ​​데 사용되며, 미가공 팁 꽉 모세관을 보유하는 데 사용된다. C)는 D. melanogaster의 비행은 모세관 먹는다. 수유 후 D)는, 음식 색상은 비행 복부에 명확하게 볼 수 있습니다. E) 디지털 캘리퍼 시작 마크 사이의 거리를 측정하고, 메 니스 커스의 끝을 표시하기 위해 사용된다. 데이터는 USB를 통해 Excel 스프레드 시트에 직접 전송됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 모세관 공급 장치 분석에 증발의 영향. A) 여러 CAFE 분석은 내부에 배치그리드 화 속지와 플라스틱 상자. 실험 사 가득 물 유리 병 중에 습도를 제어하기위한 (빨간색 테두리)는 그리드 내부에 배치됩니다. 증발 컨트롤은이 병에 직접 근접 배치됩니다. 전체 셋업 커버 백그라운드에 나타낸다. 증발을 통해 볼륨 손실 B) 비교. 증발 4 000 일의 평균값은 도시되어있다. 습도 중앙 스폰지 마개 (24 시간 간격)에 물을 도포 (I)에 의해 제어되고; (ⅱ) 그리드에 네 물이 채워진 튜브를 첨가하는 단계; 및 (iii) 전체에 설치하는 플라스틱 덮개를 사용. 습도 테스트 모두 솔루션을 제어하면 증발이 현저하게 낮은 (*** P ≤ 0.001, N = 48). EtOH를 포함 자당 솔루션을 비 함유 사이의 변동성 차이는 사용 된 습도 장치 검출 없습니다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림.

그림 3
그림 3 : 자당 솔루션을 통해 자당을 포함하는 에탄올에 대한 기본 설정 (EtOH로). 1118 파리 w 남성을위한) 식품 소비가 표시됩니다. 수컷은 일반 자당 용액보다 수크로오스 용액을 함유하는 15 %의 EtOH 유의하게 소비한다. *** P ≤ 0.001; N = 27 B)는 크게 4 일 시험 기간 동안 23 %의 EtOH를 포함하는 자당 솔루션을 선호 파리. *** P ≤ 0.001; ** P ≤ 0.01; N은 = 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : Consumption (μL은 / 비행 μL / mg의 비행) 남성과 여성에 의해 다른 자당 농도의 1118 파리 w A) 수 크로스 용액의 상이한 농도의 소비는 남녀간에 크게 다르다. 여성 파리는 낮은 자당 농도에서 더 많은 소비, 남성 파리는 높은 농도에서 더 소비한다. * P <0.05; *** P <0.001; (20) 남성 각, N = 20 여성 각) 30 시험과 N은 = 27 시련. 질량 기준 B) 식품 섭취. 질량을 비행을 정규화 할 때 소비의 상당한 증가는 0.1 M 2 자당 솔루션에 대한 남성과 여성의 파리 사이에 발생합니다. *** P ≤ 0.001; N은 27 명의 남성, N = 30 여성을 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 번 테이블
표 1 : 남성의 체중과 1118 파리 w 여성. 100 파리 4-5기를 측정하고, 체중 (밀리그램 / 플라이)을 산출 하였다. (STDEV (표준 편차) 및 STERROR (표준 오차)와 함께) 평균 값이 표시됩니다. 평균 값은 질량 (μL / mg을 비행) 비행 음식 소비를 정상화하는 데 사용됩니다. 이 스프레드 시트를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2
표 2 : CAFE 분석의 증발 손실 (μL). 증발 손실 액체 량은 4 일 동안 도시된다. 습도 제어 (+) 또는 아니오 (NO)t (-),도 2에 설명 된 바와 같이. 두 개의 서로 다른 솔루션 (자당 자당 플러스의 EtOH)에 대한 증발 데이터가 표시됩니다. 평균 값은 매일과 (STDEV 및 STERROR 포함) 기간 동안 제공됩니다. 자당 희석 실험의 증발 손실 (평균 값) 아래에 별도로 도시되어있다. 이 스프레드 시트를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3
표 3 : 1,118w 0.1 M 자당 / 15 %의 EtOH없이 남성으로의 소비는 3 시간 동안 연준를 파리. 20 파리의 그룹에 의해 두 솔루션의 소비 3 일에서 3 시간 동안 측정 하였다. 플라이 그룹 소비 값 플라이 마이크로 리터 당 흡수를 평가하기 위해 테스트 파리의 숫자로 나누어 증발 손실을 뺀. (STDEV 및 STERROR 포함) 평균 값이 표시됩니다. 이 스프레드 시트를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4
표 4 : 0.1 M 자당으로의 소비와 1118 파리 w 남자 포 일간 23 % EtOH로하지 않고. 8 파리 그룹 모두에 의해 용액의 소비량은 4 일 동안 24 시간 동안 측정 하였다. 에탄올 선호 지수는하기 식 (- [SUC] / 총 소비량 [SUC +의 EtOH를])을 사용하여 계산 하였다. 플라이 그룹 소비 값은 증발 손실을 뺀 플라이 μL 당 흡수를 평가하기 위해 테스트 파리의 숫자로 분할된다. (STDEV 및 STERROR 포함) 평균 값은 매일 표시됩니다..jove.com / 파일 / ftp_upload / 55024 / JoVE55024R1-Diegelmann-테이블 4.xlsx "대상 ="_ "빈>이 스프레드 시트를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5
표 5 : 남성에 의해 자당의 다섯 가지 농도의 소비와 1118 파리 w 여성. 각 솔루션, 자당 섭취의 합에 대한 값의 섭취가 표시됩니다. 각 농도에 대한 평균 값 (STDEV 및 STERROR으로) 각 열 아래에 주어진다. 비행 질량 (파리의 밀리그램 당 마이크로 리터 흡수)에 따라 섭취량을 계산하려면, 식품 소비 (오른쪽 그림 표 1) 남성 또는 여성 파리의 평균 무게에 의해 구분된다. 이 스프레드 시트를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 보고서는 기술 설치 및 실험실에서의 성공적인 성능에 초점을 맞추고, 단계별 방식으로 CAFE 분석에 대해 설명합니다. 단순하기 때문에,이 분석은 학교 교육적 실험으로 사용될 수있다. 예제는 분석이 짧고 긴 기간 (일 시간)을 통해 초파리 melanogaster의 음식 감지, 환경 및 소비의 조사를 할 수 있음을 보여준다. 카페 분석은 식품 의약품 소비 중독 에너지 항상성 및 공급 (16)의 연결을 제어, 18, 24, 25을 포함한 환자를 조사 분야에서 널리 사용되고있다.

카페 분석에서 실험 파리는 성공적으로 구하고, 감지 및 운동과 같은 음식을 얻기 위해 여러 가지 작업을 수행해야합니다; 이러한 작업을 수행 할 수없는이 감소 소비 될 수 있습니다. 에 대한동작을 노화 파리의 기아 상태에 주로 의존, 19, 21 금식에 의해 증가 될 수있다. 감지 및 음식 소스의하여 현지화, 냄새 또는 맛을하는 비행의 능력에 의해 영향을받을 수 있으며, 간접적으로 낮은 소비 속도 (28)이 발생할 수 있습니다. 모세관의 끝에서 식품의 표시는 아래로 상승하고 적극적으로 공급하는 거꾸로 위치에 자신을 유지하기 위해 파리를 강제로. 모세관에 마시는 위치를 유지하기 위해, 비행의 근육 수축을 조정해야합니다. 노화로 인한 운동 부족을하는 것처럼 운동의 손상 또는 과잉 행동은 명확하게, 음식 섭취에 영향을 미칠 것입니다. 또한,이 기동하는 동안 다른 파리에 의한 간섭은 음식 섭취의 조기 종료에 이르게. 따라서, 사용되는 파리의 개수는 실험 전에 결정되어야한다. 이 숫자는 모든 파리가 제대로 먹을 수 있는지 확인해야합니다 및 피를 통제한다(8에서 우리 D. melanogaster의 카페 분석 유리 병 (20) 파리 최대까지) 유리 병에 사라져 밀도. 수유는 식사의 영양 가치에 의해 영향을 받는다, 동적, 따라서 29 (24)을 자신의 섭취를 조절 파리. 이 신경 전달 물질 옥토 파민 누락 돌연변이가 정상 PER 응답 점수를 가지고 도시하지만 동시에 식품 섭취량 (14)의 상당한 감소를 표시했다. 또한, 수유하는 동안, 동기 부여가 먹는 감소를 계속하고 동작의 종료로 연결됩니다.

위에서 언급 한 고려 사항은 카페의 분석에, 그들은뿐만 아니라 다른 테스트 시스템에서 측정 동작을 먹이에 영향을주지에만 적용됩니다. 음식물 섭취 측정시 따라서, 상기 분석을 수행하는 파리의 능력은 고려되어야한다. 기술적으로 도전하지 않지만, CAFE 분석은 몇 가지 잠재적 인 실제적인 단점이있다. 메 니스 커스의 감소모세관 내부의 파리에 의해 증발 손실과 음식 섭취에 따라 달라집니다. 높은 증착은 신호 대 잡음비에 대한 문제가 때문에 최소화되어야한다. 우리는 실험 기간 (4.6 참조) 중에 습도를 제어하는 ​​몇 가지 추가 방법 및 장치를 적용했다. 이 액세서리는 증발 우리가 사용하는 음식 소스의 다른 변동성이 크게 심지어 제거 효과를 줄이기 위해 우리를 도왔다. 어떤 기후 챔버를 사용할 수없는 경우 역시, 상기 분석은 결점으로서 높은 증착 값 (교실에서 예)을 실온에서 수행 될 수있다.

프로토콜에서 언급 된 바와 같이, 모세관의 말단 기인 음식 소스 상이한 거리로 플라이 선택에 바이어스를 방지하기 위해 유리 병 내부의 동일한 레벨에 배치 될 필요가있다. 이를 달성하기 위해, 모세관 위치는 제 피펫 팁에 고정된다. 모세관의 길이는 wild-에 공급하는 기준으로 표시되지유형은 10 파리. 액체의 유출이 식품 소비의 정확한 판독을 훼손 할 수 있습니다 (4.3 참조 4.9); 진동이없는 환경 유출을 방지 할 수 있습니다. 용액 블록 모세관 입자 흐름과 음식 소비를 방지한다. 음식물 용액이 효모를 포함하는 경우 특히 완전히 같은 방해물을 피하기 위하여 용해되어야한다. 수용성 효모 추출물의 사용은이 문제를 극복 할 수 있지만 영양의 불완전한 소스로 추가 피트니스 비용이 발생할 수 있습니다. 음식 접근은 실험 전 및 후에 평가 될 필요가있다. 분석에 포함되어야하는 데이터 만 플라이 음식에 대한 접근은 전체 실험 기간 동안 존재 곳 (4.9 참조) 얻은 것이다. 거꾸로 공급 위치는 실험의 중요한 특징이다. 과일 나무에서 내려 걸어 그들이 썩은 과일을 오를 수로 자연 조건에서이 공급 위치, 비행에 익숙하지 않다. 이 비교 예는 실험에 의해지지된다(ⅰ) MAFE 분석에서 고정 된 파리의 수평 먹는 위치 및 (ii) 오른쪽 위로 위치를 먹이가 방사성 표지 음식 (13)를 사용하여, (21)에 CAFE 분석에서 거꾸로 위치에 먹이 파리의 식사 크기를 보내고 . 거꾸로 음식 디스플레이 파리에 대한 문제가 될 것 같지 않지만, 상기 모세관 내부의 음식의 조성에 영향을 미칠 수있다. 효모 세포와 같은 일시 중단 보충 교재는 모세관의 바닥에 중력을 통해 싱크 수 있으므로 하단에 더 집중 될 수 있습니다 또는 모세관을 연결 할 수 있습니다. 이 비행 행동 때문에 결과에 영향을 미칠 것입니다. 공급 용액의 성분이 완전히 용해되는 것을 보장하고, 자주 장기 실험 동안 신선한 모세관 도입 음식 섭취에 이러한 영향을 최소화한다.

시간의 위에 걸쳐 여기에 설명 카페 분석의 사용은 플라이 그룹에서 음식 섭취를 측정 할 수 있도록시간 또는 일. 자세한 분석이 필요한 경우 (예., 단일 플라이 또는 동작 분의 범위의 동작) 등 MAFE 분석과 같은 다른 급송 분석법, 더 적합하다. 파리의 개수는 상기 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 단일 모세관 (30)을 사용함으로써 감소되는 것이 가능할 수있다.

대표적인 결과를 얻기 위해 사용되는 실험의 수는 문헌 17, 24에 기술 된 실험과 일치하는, 15 내지 27로 다양하다. 상기 분석은 실험에서 전위 바이어스를 배제 고전 맹검 방식으로 수행 될 수 있으며, 이는 일반적으로 몇 일에 각각 적어도 4-5 번 반복된다. 카페 분석 얻어진 데이터는 몸 크기에 관한 먹이 행동의 차이를 설명하기 위해 체중을 정상화 할 수 있습니다. 상기 분석으로 얻은 결과는 않도록 견고하고 재현성 그대학원 학생들을위한 실용적인 과정에서 성공적으로 도입되었습니다.

카페 분석 널리 초파리 melanogaster의 대사와 맛 연구 분야에 사용된다 이는 동작을 공급하는 식품 보조제 및 / 또는 약제의 역할을 테스트하는 다수의 애플리케이션을 가지며, 이는 특정 음식 소스 (24)에 대한 용량 반응을 조사하는데 사용될 수있다. D. melanogaster의 신경 회로에서 조작 할 기술의 현저한 다양한 조합이 분석은 연구자 동작 12, 17, 18에 공급 보강 시스템의 역할을 조사 할 수있다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials (breeding) Greiner Bio-One 960177 www.greinerbioone.com
Vials (CAFE assay) Greiner Bio-One 217101 www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assay Workshop
Plastic box, low wall Plastime 353 www.plastime.it
Cover for the plastic box Workshop
Capillaries BLAUBRAND  REF 7087 07 www.brand.de
Pipette tips Greiner Bio-One 771290 www.greinerbioone.com
Filter paper circles Whatman 10 311 804 www.sigmaaldrich.com
D(+)-Sucrose AppliChem 57-50-1 www.applichem.com
Ethanol absolute VWR Chemicals 20,821,330 www.vwr.com
Food color (red, E124) Backfun 10027 www.backfun.de
Food color (blue, E133) Backfun 10030 www.backfun.de
Soap solution (CVK 8) CVH 103220 www.cvh.de
Digital caliper GARANT 412,616 www.hoffmann-group.com
Vials (breeding) Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm 
Vials (CAFE assay) Height 8 cm, diameter 3.3 cm
Lid-CAFE assay Produced in university workshop, technical drawing supplied
Please click here to download this file.
Plastic box, low wall A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions 
Cover for the plastic box Dimensions (37 x 29 x 18 cm)
Capillaries DIN ISO 7550 norm,  IVD-guideline 98/79 EG, ends polished
Pipette tips Pipettes for the outer circle are cut according to the lid
Filter paper circles 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used
D(+)-Sucrose Not harmful
Ethanol absolute Highly flammable liquid and vapor
Food color (red, E124) Not stated
Food color (blue, E133) Not stated
Soap solution (CVK 8) Odor neutral soap
Digital caliper
Standard fly food (for 20 L)
Agar 160 g
Brewer's Yeast 299.33 g
Cornmeal 1,200 g
Molasses 1.6 L
Propionic acid 57.3 mL
Nipagin 30% 160 mL

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References

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모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em
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Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).More

Diegelmann, S., Jansen, A., Jois, S., Kastenholz, K., Velo Escarcena, L., Strudthoff, N., Scholz, H. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (121), e55024, doi:10.3791/55024 (2017).

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