解剖和蜜蜂背血管的观察心功能的研究

Introduction

这种方法的总体目标是允许研究者快速，轻松地观察和量化药理剂对蜜蜂的心脏速率的影响。蜜蜂，像其他昆虫，具有传播血淋巴，血液的昆虫当量，在整个体腔，被称为血腔的开放循环系统。血淋巴的循环为营养物质，免疫因子，废产物，以及神经激素和其他信号分子¹的运输是必不可少的。循环是通过背容器中，沿昆虫的背中线，以及附件搏动器官延伸促进。背容器被分成两个功能上不同的部分，指定在腹部的心脏，并在胸部和头部的主动脉。在对胸部和头部的心脏泵血淋巴传播收缩，而附属器官搏动血淋巴确保流向四肢。

2。这种方法是在成年蜂不太有用，但是，由于它可能很难通过腹壁来清楚地观察背脉管。在各种昆虫，包括蜜蜂记录心脏速率的建立的方法，是利用接触热成像，其利用施加到昆虫的外部，以检测心脏脉动^3,4-热敏电阻。在成人蜜蜂心脏速率也已使用电生理技术来测量电阻抗信号^4,5-记录。这种技术需要的电极插入到动物旁边的心脏和使用阻抗变换器来记录心跳^4。同样，心电图已用于DETECŧ由心脏产生，并与蜜蜂的录像相结合，观察心脏活动⁶变化的电信号。一个显着的优势，这些方法是心脏速率在一个完整的，活蜂评估，而不是在一个解剖的标本，这有助于确保全方位的主题生理反应的可用性。这些方法的挑战包括会计主体，需要限制之外的变量和刺激，可能改变心脏率，以及测试药物制剂时，确定合适的给药方法的固定或麻醉。

已用于研究蜂的心脏活动的另一种方法是，以部分解剖昆虫以暴露心脏，然后进行测量使用一个力位移传感器⁷背脉管收缩。在这个协议中，心脏不断与正在运行的生理盐水和测试沐浴合作mpounds可以溶解在该溶液应用到对象^7。这种方法与前面描述的那些之间的显著区别在于腹神经索被去除，消除了对中枢神经系统已被证明在调节心脏速率⁵发挥作用。其结果是，在基线心跳，这通常是相当不稳定的，稳定在一个低得多的频率和幅度比在活昆虫^5,7-通常观察到。什么所有这些方法的共同点在于，它们需要高度专业化和通常是昂贵的设备，除了专门知识的一定水平，以进行。或许最大的缺点是，没有这些方法均特别适用于涉及测试大量的受试者，如筛选潜在cardiomodulatory化合物文库的实验。

这里所描述的方法的最大优势是它的简单性。该协议是比较容易掌握，安装需要空间不大，只有最小的资金投入是必要的。该方法需要比一些蜜蜂，几个手术器械，等渗溶液更小，以及一个数字显微镜或用数码相机拍摄传统显微镜。蜜蜂解剖可视化背船只和数字视频使用前，用药剂治疗后，记录心脏速率。虽然录像实际上不是必要观察心脏速率的变化，这将大大增加吞吐量（ 即 ，可以在给定的时间量来处理对象的数目）。研究者可以一次录制了大量的视频，然后后来在更方便的时间攻入这些视频最大限度地提高效率。这种方法的另一个优点是，视频允许研究者重新开始，应在评分过程被中断，并使其更容易在Viewer，以便减少偏见蒙蔽治疗。

Protocol

1.收集和考试科目的准备

1. 收集从菌落蜜蜂的合适数量。
   注意：需要的数量取决于不仅大小和实验的范围，但也研究者的技能。例如，如果有2个治疗组，每组10蜜蜂期望样本大小，一个合理的熟练研究者可以收集至少30蜜蜂占不成功解剖，并用20有用的视频得分结束。
2. 最小化该集合和解剖之间经过的时间量。
   注意：虽然蜂可以在实验室中被安置为之前夹层天（ 即 ，保持在一解剖背脉管稳定心脏速率的可能性）已观察解剖的成功率相对降低到的时间量蜜蜂被安置从殖民地了。
   1. 而收容在实验室提供的水和食物的来源蜜蜂。对于EXAmple，在最低限度，提供对50％（重量/体积）的水的蔗糖溶液（这是足够小于6小时的持续时间）。更长的时间，提供访问蜜蜂蜂蜜。
   2. 房子蜜蜂在大约32°C和60-80％的相对湿度温度在实验室过夜，以减轻压力和避免脱水。
3. 此前解剖，麻醉蜜蜂简要方便搬运。
   注意：此可降低夹层的成功率并降低吞吐量。
   1. 寒意蜜蜂，方法是将它们放在冰上或成只是足够长的时间，以减少要想在方便搬运移动冰箱。
   2. 另外，简单地揭露蜜蜂_的 CO _2，为了方便搬运。
      注：长期暴露在寒冷可减少解剖的成功率。延伸或重复暴露于CO ₂也能降低夹层的成功率。

2.解剖背腹墙

注：蜜蜂应在解剖时是活着的。

1. 使用镊子和/或显微剪刀，删除的腿和翅膀，以促进腹部解剖。保持一个小烧杯或装有蒸馏水附近设有夹层之间的冲洗工具的目的类似容器。
2. 同时抑制与钳蜜蜂，利用显微切割剪刀沿第一和第二tergites之间背侧腹壁横向切割（参见图1）。

图1：蜜蜂腹部背视图。初始切口应在第一和第二tergites之间进行，由红色线表示。比例尺= 1毫米。 请点击她的E要查看此图的放大版本。

3. 同时轻轻夹紧用钳子第二背片的后缘，沿着从最初的切口，以托管架的蜂的每一侧纵向切割（参见图2）。切割时避免刺穿胃肠道要小心。

图2：蜜蜂腹部的横向视图。第二和第三切口应沿着腹部的任一侧进行，由红色线表示。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 交换剪刀第二组细镊子，并利用它们来仔细背腹壁从休息分离ÒF中的腹部。轻轻取出托管架和保持附着于背腹壁胃肠道的任何部分。避免破裂肠道，作为内容可以外套腹壁和妨碍背脉管的可视化。

图3：背船只观。一旦肠道和托管架被去除，背容器是沿解剖背腹壁的中线可见。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 安排在照相机下方的所需取向背侧腹壁使得背脉管可见（ 见图3）。利用显微切割剪刀修剪掉多余的ABdominal墙阻碍背船只的可视化。背腹壁的形状应该像一个浅杯或碗当正确位于。
   1. 由于背脉管不延伸到蜂的最后面腹段，取出最后背片，以提高背脉管的可视化。
6. 利用一个音量可调微量移液器，覆盖10微升等渗溶液，以保持生理条件和促进稳定的心跳背船只。
   注：建议的解决方案是四分之一强度的林格氏溶液（0.120克氯化物/ L的钙，0.105mmol克/升氯化钾0.050克/升碳酸氢钠和2.250克/升氯化钠），已经发现，以促进稳定，连续心跳。

3.观察和心率的调节

1. 允许背船只坐不受干扰，直到稳定，连续的心跳达到（通常在300秒）。
   注：心跳可视化为背船只的节律性收缩。最初，可能似乎是没有心跳，特别是如果蜂麻醉，但心脏通常在等渗溶液休息几分钟后恢复跳动，并且可以继续搅打数小时，只要它仍然沐浴在溶液中。
2. 测量在每分钟（BPM）的节拍的数量方面的心脏速率。
   1. 记录在一个60秒的时间观察宫缩的数量。用一只手式计数器和一个计时器，以促进这一进程。
3. 由前和用cardiomodulatory化合物处理之后记录所观察到的BPM测量心脏速率的变化。
   注意：虽然所需要的时间来观察心脏速率的效果可根据化合物被测试而变化，在心脏速率的变化通常可在几分钟之内观察到。
   1. 确定基线心脏速率之前立即在加入任何试验化合物。
      注：后处理心脏速率通常可以为90〜120秒后确定。
   2. 通过在用于洗澡背容器相同等渗溶液中的化合物溶解制备潜在cardiomodulators（ 例如，章鱼胺）。
   3. 试验化合物添加到通过利用micropipetter背脉管周围的溶液中。
4. 获得更高的精度和更高的吞吐量，使每个测试受试者的录像，然后使用视频在稍后的时间得分心脏速率。
   注意：这允许单个研究者错开解剖，以便于几乎连续生产的影片。当录制视频，建议最小长度为60秒大关添加任何测试化合物约240秒。这确保了研究者对得分基线心脏速率，然后对得分后处理心脏速率120秒另外60秒窗口60秒窗口治疗后。

Representative Results

由于许多可能使用此协议待测试的药理活性化合物是不溶于水，必须有一个可靠的溶剂，将允许测试化合物通过用沐浴背脉管的等渗溶液被递送。二甲基亚砜（DMSO）是通常用作在动物⁸递送实验性药物和其他化合物的车辆的溶剂，并已成功地用于此目的的研究中检查农药对蜜蜂心脏活动⁹的效果。因此，DMSO被选为用于递送试验化合物于背容器，这需要它首先为cardiomodulatory活性试验的潜在的车辆。在这个协议中，解剖背脉管最初沐浴在10微升的四分之一强度的林格氏溶液，然后心脏速率之前加入试验化合物确定。测试化合物AR向在已知浓度在DMSO中的10微升溶解在四分之一强度的林格氏液递送，然后背容器是观察在心脏速率的后续变化。

在测试之前，任何的化合物，DMSO的浓度范围是为对心脏速率，相对于四分之一强度的林格氏用0％的DMSO溶液中的任何影响的测试。二甲基亚砜溶解在0.2％，2％，10％，和在等体积加入时在四分之一强度的林格氏为了测试的0.1％，1％，5％和10％的最终浓度溶液的20％体积/体积该解决方案已经在洗澡背血管。采用这种方法，而不是在用于洗澡背容器初始10微升所需浓度添加DMSO，因为不是每个解剖产生一个稳定的心跳。如果DMSO对心脏速率有不利影响，这种影响可能不是从失败的解剖区分。心脏速率之前立即评估加入DMSO，然后再次120秒后。 图4显示了该实验的结果，证明了0.1％和1％的DMSO溶液中对心脏速率相对于四分之一强度的林格氏液无DMSO无显著影响，而5％和10％的DMSO显著降低心脏速率。

图4：DMSO对蜜蜂心脏率的影响。图表显示在基础心脏变化的百分比，如每分钟心跳测量。蜜蜂背脉管的治疗与在四分之一强度的林格氏液不会显著增加或减少心脏速率，相对于未经DMSO四分之一强度的林格氏溶液0.1％或1％DMSO V / V。用5％或10％的DMSO处理在溶液中引起心脏速率的显著下降。表现为结果平均值±SEM（N = 10）。 * p <0.05，与0％DMSO对照 （秩和检验与邓恩的多重比较试验测试）。 请点击此处查看该图的放大版本。

为了使该测定是相关的，它必须是可以观察以下与cardiomodulatory化合物治疗心脏速率的变化。该生物胺章鱼胺是已知的，作为在无脊椎动物¹⁰神经调节，并且已显示作为在两个水果cardioaccelerant苍蝇¹¹和蜜蜂^7。章鱼胺是针对车辆（1％DMSO在四分之一强度的林格氏溶液）试验如上述在100nM，10μM和100μM的浓度说明。 图5显示了该实验的结果，证明了10μM和100μM的浓度章鱼胺的显著增加心脏速率。

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图5： 章鱼胺对蜜蜂心脏率的影响。图表显示在基础心脏变化的百分比，如每分钟心跳测量。用100nM章鱼胺蜜蜂背脉管的治疗并不显著增加或（在四分之一强度的林格氏溶液1％DMSO V / V）降低相对于车辆心脏速率。用10μM和100μM的章鱼胺治疗相对于车辆心脏速率显著增加。表现为结果平均值±SEM（N = 10）。 * P <0.05与车辆控制（与邓恩的多重比较试验秩和检验测试）。 请点击此处查看该图的放大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments