דיסקציה תצפית של כלי דבש דבורים הגבי ללימודים של תפקוד הלב

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לאפשר לחוקר במהירות ובקלות להתבונן לכמת את ההשפעה כי סוכן תרופתי יש על קצב הלב של דבורי דבש. דבורים, כמו חרקים אחרים, יש מערכת דם פתוחה מפיצת hemolymph, מקבילת החרק של דם, בכל חלל הגוף, המכונה hemocoel. תפוצתו של hemolymph חיוני להובלת חומרים מזינים, גורמי החיסון, פסולת, כמו גם neurohormones ומולקולות איתות אחרות ^1. מחזור הוא הקל על ידי כלי הגבי, המשתרע לאורך קו האמצע הגבי של חרקים, כמו גם איברים pulsatile אביזר. הכלי הגבה מחולק לשני חלקים נפרדים מבחינה תפקודית, המיועד בלב בבטן ואת אבי העורקים בבית החזה והראש. התכווצויות מופצות ב hemolymph משאבת הלב לכיוון החזה והראש, בעוד איברים pulsatile אביזר להבטיח זרימת hemolymph בגפיים.

<p ניתן לצפות class = "jove_content"> תפקוד לב חרקים באמצעות מגוון של שיטות, בהתאם לשלב הגודל, פיזיולוגיה, או חיים של החרק. גישה משותפת התבוננות קצב לב זחלים או חרקים קטנים היא השימוש הדמית intravital ^2. שיטה זו היא פחות שימושית דבורים בוגרים, אולם, כפי שהוא יכול להיות קשה כדי להציג כלי הגבה בבירור דרך דופן הבטן. גישה הוקמה להקלטת קצב לב במגוון חרקים, דבורים כלל, היא השימוש של תרמוגרפיה קשר, אשר מנצלת תרמיסטורים להחיל את החלק החיצוני של החרקים כדי לזהות פעימות לב ^3,4. קצב לב דבורים בוגרות גם נרשם באמצעות טכניקה אלקטרו למדוד ^4,5 אות עכבה חשמלית. טכניקה זו דורשת החדרה של אלקטרודות לתוך החיה ליד הלב ושימוש ממיר עכבה להקליט פעימות ^4. באופן דומה, אק"ג שמש detect אותות חשמליים המיוצרים על ידי הלב בשילוב עם הקלטת וידאו של הדבורה לצפות לשינויים בפעילות הלב ^6. יתרון בולט לגישות אלה הוא כי קצב לב נבחן דבורה שלמה, חייה, ולא בתוך דגימה גזורה, אשר מסייעת להבטיח את הזמינות של המגוון הרחב של תגובות פיסיולוגיות בנושא. האתגרים של גישות אלה כוללים חשבונאי קיבוע או הרדמה של הנושא, את הצורך להגביל משתנה גירויים חיצוניים שעשויים לשנות את קצב לב, כמו גם קביעת שיטת הצגה מתאימה כאשר בודקים סוכנים תרופתיים.

גישה נוספת, שבו נעשה שימוש ללימוד פעילות דבורת לב היא לנתח את החרק חלקית כדי לחשוף את הלב, אז למדוד התכווצויות כלי הגבו באמצעות מתמר עקירה בכוח ^7. בפרוטוקול זה, בלב טובל הרף עם תמיסת מלח פיזיולוגית ריצה ושיתוף מבחןmpounds יכול להיות מומס פתרון זה עבור יישום לנושא ^7. הבדל משמעותי בין שיטה זו לבין אלה שתוארו לעיל הוא כי חוט עצב הגחון מוסר, ומבטל את התפקיד שמערכת העצבים המרכזית הוכחה לשחק ויסות קצב לב ^5. התוצאה היא כי דופק הבסיס, שהיא בדרך כלל די יציבה, מייצב בתדר נמוך בהרבה משרעת מ הוא ציין בדרך כלל חרק חי ^5,7. מה כל אחת מהשיטות הללו יש מכנה משותף הוא שהם דורשים ציוד מיוחד מאוד ולעתים קרובות יקר, בנוסף לרמה מסוימת של מומחיות, כדי להתנהל. אולי החסרון הגדול הוא שאף אחד גישות אלו גם מתאימים במיוחד לניסויים כרוכים בדיקה של מספר רב של נושאים, כגון הקרנת ספרייה של תרכובות cardiomodulatory הפוטנציאלי.

נקודת הכח החזק ביותר של הגישה המתוארת כאןהפשטות היא שלה. הפרוטוקול הוא יחסית קל לשלוט, ההתקנה דורשת שטח קטן, ורק קלט פיננסי מינימלי הכרחי. השיטה מחייבת קצת יותר דבורים כמה, כמה מכשירי ניתוח, פתרון איזוטוני, ואו מיקרוסקופ דיגיטלי או מיקרוסקופ מסורתי עם מצלמה דיגיטלית. דבורים הם גזורים לדמיין כלי הגבה וסרטי וידאו דיגיטלי משמשים כדי להקליט קצב לב לפני ואחרי טיפול עם סוכנים תרופתיים. למרות הקלטת וידאו הוא לא באמת הכרחי כדי לצפות לשינויים בקצב הלב, זה יגביר את התפוקה באופן משמעותי (כלומר, מספר הנבדקים כי ניתן לעבד כמות של זמן נתון). החוקר יכול למקסם את היעילות על ידי הקלטת מספר רב של קטעי וידאו בו-זמנית ולאחר מכן מאוחר יותר הבקיע את סרטי הווידאו האלה בזמן שנוח יותר. יתרון נוסף של גישה זו הוא כי קטעי וידאו לאפשר החוקר להתחיל מחדש, צריך תהליך הניקוד יופרע, ולהקל על נiewer לדעת מה הם מקבלים את הטיפול על מנת לצמצם הטיה.

Protocol

איסוף 1. הכנת הנבדקים מבחן אסוף את המספר המתאים של דבורים מהמושבה. הערה: המספר הדרוש תלוי לא רק את הגודל וההיקף של הניסוי, אלא גם את המיומנות של החוקר. לדוגמא, אם יש 2 קבוצות טיפול עם גודל מדגם רצוי של 10 דבורים לכל קבוצ…

Representative Results

מאחר ורבים מן הרכיבים פעילים מהבחינה פרמקולוגית שעשויים להיבדק באמצעות פרוטוקול זה אינם מסיסים במים, זה הכרחי כדי לקבל ממס אמין שיאפשר תרכובות בדיקה תועברנה באמצעות הפתרון איזוטוני נהג להתרחץ כלי הגבה. Sulfoxide דימתיל (DMSO) הוא חומר ממיס כי הוא נפוץ כמו…

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin…

Materials

Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments