心機能の研究のための解剖と観察ハニービー背側の船

Introduction

この方法論の全体的な目標は、研究者が迅速かつ容易に観察し、薬理学的薬剤は、ミツバチの心拍数に与える影響を定量化できるようにすることです。ミツバチは、他の昆虫のように、血体腔として知られている体腔、全体を通して、血リンパ、血液の昆虫同等のものを広めるオープン循環系を持っています。血リンパの循環が栄養素、免疫因子、老廃物、ならびに神経ホルモンおよび他のシグナル伝達分子¹の輸送のために不可欠です。循環は昆虫の背側正中線だけでなく、アクセサリー拍動器官に沿って延びている背の容器、によって促進されます。背容器は腹部と胸部と頭の中で大動脈に心を指定、機能的に異なる2つのセクションに分かれています。胸部や頭部に向かって心臓ポンプ血リンパ中の伝播収縮は、付属拍動器官は、四肢への血リンパの流れを確保しながら。

2の使用です。それは、腹壁を通して背容器を明確に表示することは困難であるため、この方法は、しかしながら、成人ミツバチにおいてあまり有用です。ミツバチなどの昆虫、様々な心拍数を記録するための確立されたアプローチは、サーミスタは、心臓拍動^3,4を検出するために、昆虫の外側に適用される利用接触サーモグラフィの使用です。成体ミツバチにおける心拍数は、電気インピーダンス信号^4,5を測定するために電気技術を使用して記録されています。この技法は、心臓への次の動物に電極を挿入し、心拍^4を記録するため^のインピーダンス変換器の使用を必要とします。同様に、心電図はdetecするために使用されています心臓によって生成され、心臓の活動⁶の変化を観察するために蜂のビデオ録画と組み合わせた電気信号をtは。これらのアプローチの明確な利点は、心拍数ではなく、対象における生理学的応答の全範囲の可用性を保証するのに役立つ解剖標本、よりも、そのまま、生きている蜂で評価されていることです。これらのアプローチの課題は、被写体、心拍数を変化させるだけでなく、薬理学的薬剤をテストするときに、適切な配信方法を決定するかもしれない外部の変数と刺激を制限する必要の固定化や麻酔のための会計が含まれています。

ハチ心臓活動を研究するために使用されている別のアプローチは、部分的に、力変位変換器^7を使用して^、背部の血管収縮を測定し、その後、心臓を露出させるために、昆虫を分析することです。このプロトコルでは、心臓は継続的に生理食塩水やテストの共同の実行に浴びますmpoundsは、対象⁷への適用のために、この溶液中に溶解することができます。この方法及びそれらを前述の有意差は、腹側神経索は、中枢神経系は、心拍数^5の調節に再生するために示されている役割を排除する、除去することです。結果は通常、非常に不安定なあるベースラインハートビートは、典型的には、生きている昆虫^5,7で観察されるよりもはるかに低い周波数と振幅で安定するということです。どのようなこれらの方法の全てに共通しているの彼らが行われるために、ある程度の専門知識に加えて、高度に専門化し、しばしば高価な機器を必要とするということです。おそらく、最大の欠点は、これらのアプローチのいずれも、そのような潜在的にcardiomodulatory化合物のライブラリーをスクリーニングするように被験者の数が多い、試験伴う実験に特に適していないことです。

ここで説明されたアプローチの最大の強みそのシンプルさです。プロトコルは習得が比較的容易であり、セットアップは少しスペースを必要とし、最小限の金融入力が必要です。方法はいくつかの蜂、いくつかの手術器具、等張液、およびデジタル顕微鏡やデジタルカメラとの伝統的な顕微鏡のいずれかより少しが必要です。ハチは、背側血管を可視化するために解剖され、デジタルビデオは薬剤による治療前後の心拍数を記録するために使用されます。録画は、心拍数の変化を観察するために実際に必要ではないが、それは非常にスループットを増加させる（ すなわち 、一定時間内に処理可能な被験者の数）。研究者は一度にビデオの多数を記録し、後で都合のよいときにこれらのビデオを採点することによって、効率を最大限に高めることができます。このアプローチのもう一つの利点は、ビデオは調査員が採点処理が中断されるべきで、最初からやり直す、とvのためのそれを容易にすることを可能にするということですiewerバイアスを減少させるために治療を知らされます。

Protocol

被験者の1収集と準備

1. コロニーから蜂の適切な数を収集します。
   注：必要な数は、規模や範囲の実験だけでなく、研究者のスキルだけでなく、依存します。 2つの治療グループでは、グループごとに10蜂の所望のサンプルサイズである場合たとえば、合理的に熟練した研究者は失敗した解剖を考慮して、少なくとも30蜂を集めるかもしれないし、スコアに20便利な動画で終わります。
2. コレクションと解剖の間を通過する時間を最小にしてください。
   注：ミツバチが解剖の前日間実験室に収容することができるが、解剖の成功率（ すなわち 、解剖背容器安定心拍数を維持する可能性）は、その時間の量に対して減少することが観察されていますミツバチコロニーから離れて収容されています。
   1. 研究室に収容されながら、水や食料の供給源とミツバチを提供します。エクサのためmple、少なくとも、（これ未満6時間の持続時間のために十分である）を水中でスクロースの50％（w / v）の溶液へのアクセスを提供します。より長い期間のために、ミツバチが蜜へのアクセスを提供します。
   2. ストレスを軽減し、脱水症状を避けるために、約32°C 60〜80％の相対湿度の温度で一晩ラボでハウス蜂。
3. 解剖の前に、取り扱いを支援するために簡単にハチを麻酔。
   注：これは、解剖の成功率を減少させ、スループットを減少させることができます。
   1. ちょうど十分な長さの取り扱いを助けるために運動を減らすために、氷上や冷蔵庫にそれらを配置することにより、いずれかのミツバチを冷やします。
   2. また、簡単に取り扱いを助けるためにCO ₂にミツバチを公開します。
      注：寒さに拡張暴露は、解剖の成功率を減らすことができます。拡張またはCO ₂への暴露を繰り返しても、解剖の成功率を減少させることができます。

2.解剖背側腹壁の

注：蜂は解剖の時に生きている必要があります。

1. 鉗子および/または顕微解剖ハサミを使用して、腹部の切開を容易にするための脚と翼を削除します。解剖の間に器具を洗浄する目的で、近くに蒸留水で満たされた小さなビーカーまたは類似の容器を保管してください。
2. 鉗子で蜂を抑制しつつ、第一および第二のtergites（ 図1参照）との間に背側腹壁に沿って横方向にカットする顕微解剖ハサミを使用しています。

図1：ミツバチの腹部の背面図。赤線で示すように最初の切開は、第一および第二のtergitesとの間でなされるべきです。スケールバー= 1ミリメートル。 彼女をクリックしてくださいeは、この図の拡大版を表示します。

3. 軽くピンセットで第二背板の後縁を把持しながら、スティンガーに最初の切開から蜂の各辺に沿って縦方向に切断（ 図2を参照）。消化管を穿刺避けるために切断する際には注意してください。

図2：ミツバチの腹部の側面図。赤線で示すように第二と第三の切開は、腹部の両側に沿ってなされるべきです。スケールバー= 1ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

4. 細かい鉗子の第二のセットのためのはさみを交換し、慎重に残りoから背側腹壁を分離するためにそれらを利用します腹部F。ゆっくりスティンガーと背側腹壁に付着したまま消化管の任意の部分を削除します。内容は背血管の可視化を妨げるコート腹壁をすることができているように、腸を破裂避けてください。

図3：背容器の眺め。腸とスティンガーが削除されたら、背血管を切開背側腹壁の正中線に沿って表示されます。スケールバー= 1ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

5. 背容器が表示されるようにカメラの下に所望の向きで背側腹壁を配置します （ 図3を参照）。余分なABを離れてトリミングする顕微解剖はさみを利用背血管の可視化を妨げるdominal壁。背側腹壁の形状が適切に位置し、浅いカップまたはボウルのようになります。
   1. 背容器は蜂の最後尾腹部のセグメントに延びていないので、背の血管の可視化を向上させるために、最終的な背板を取り外します。
6. 調整可能なボリュームのマイクロピペットを利用して、生理的条件を維持し、安定したハートビートを容易にするために、等張溶液10μlと背容器をカバーしています。
   注：推奨されるソリューションは四半期強度リンゲル液（0.120グラム/ Lの塩化カルシウム、0.105グラム/ Lの塩化カリウム0.050グラム/ L重炭酸ナトリウム、および2.250グラム/ Lの塩化ナトリウム）安定を促進することが見出されています、連続ハートビート。

3.観測と心拍数の調節

1. 安定した、連続的なハートビートが達成されるまで背容器を静置することを許可します（通常300秒以内）。
   注：ハートビートは背容器のリズミカルな収縮として可視化されます。最初に、蜂が麻酔された場合は特に、ハートビートがないように見えるかもしれないが、心臓は通常、数分間等張液で休ん後に打撃を再開しますし、時間の暴行続けることができる、それが溶液に浸したまま提供。
2. 分あたりの拍数（BPM）の観点で心拍数を測定します。
   1. 60秒の期間中に観察された収縮の回数を記録します。このプロセスを容易にするために、手の数取器とタイマーを使用してください。
3. cardiomodulatory化合物で処理する前と後に観察BPMを記録することによって、心拍数の変化を測定します。
   注：心拍数への影響を観察するために必要な時間は、試験される化合物に依存して変化し得るが、心拍数の変化は、典型的には数分以内に観察することができます。
   1. 直前のベースライン心拍数を決定しますいずれの試験化合物を添加。
      注：治療後の心拍数は、通常90〜120秒後に決定することができます。
   2. 背の容器を浸して使用したのと同じ等張液中の化合物を溶解することによって潜在的なcardiomodulators（ 例えば、オクトパミン）を準備します。
   3. マイクロピペッターを利用して背容器を周囲の溶液に試験化合物を追加します。
4. より高い精度とより高いスループットのために、各被験者のビデオ録画を行い、その後、後で心拍数を獲得するためにビデオを使用しています。
   注：これはビデオのほぼ連続生産を容易にするために解剖をずらすために、単一の調査員を可能にします。動画を記録する場合、最小推奨長さは、任意の試験化合物を60秒マークで追加されると、約240秒です。これは、研究者は、治療後の心拍数120秒をスコアのベースライン心拍数とし、別の60秒のウィンドウを採点するための60秒のウィンドウを持っていることを保証します治療後。

Representative Results

このプロトコルを使用して試験される可能性があり薬理学的に活性な化合物の多くは水溶性ではないので、試験化合物が背容器を浸すために使用される等張液を介して配信されることを可能にする信頼性の高い溶媒が必要です。ジメチルスルホキシド（DMSO）は、一般に、動物⁸に実験薬物および他の化合物を送達するためのビヒクルとして使用される溶剤であり、ミツバチ心臓活動⁹に殺虫剤の影響を調べた研究では、この目的のために首尾よく使用されてきました。その結果、DMSOは、それが最初cardiomodulatory活性について試験することを必要と背容器に試験化合物を送達するための潜在的な手段として選択しました。このプロトコルでは、解剖背容器は、最初四半期強度リンゲル液10μlに浸され、その後、心拍数は、試験化合物を添加する前に決定されます。試験化合物は、ARE 1/4強度リンゲル液に溶解したDMSO10μlに既知濃度で送達した後、背容器は心拍数の後続の変化を観察します。

任意の化合物を試験する前に、DMSOの濃度範囲は、0％DMSOで四半期強度リンゲル液に対する心拍数への影響について試験しました。に等量で加えた場合にDMSOを0.1％、1％、5％、および10％の最終濃度を試験するために、0.2％、2％、10％、及び1/4強度のリンガー溶液中の20％v / vで溶解しました。ソリューションは、すでに背容器を入浴します。必ずしもすべての解剖が安定心拍を生成するので、背容器を浸すために使用される最初の10μlの所望の濃度でDMSOを添加することとは対照的に、このアプローチは、使用されました。 DMSOは、心拍数に悪影響を与える場合、この効果は、失敗した解剖と区別できない場合があります。心拍数の直前に評価されましたDMSOを追加し、再度120秒後に。 5％および10％DMSOを大幅心拍数を減少させ、一方、 図4は 、DMSOなしでリンゲル液四半期の強度に対する、溶液中の0.1％および1％DMSOが、心拍数に有意な影響を及ぼさなかったことを実証し、この実験の結果を示しています。

図4：蜂の心拍数に対するDMSOの影響。分当たりのビートで測定したグラフは、基礎心拍数の変化率を示しています。四半期強度の0.1％または1％DMSO v / vの持つ蜂蜜ミツバチ背血管の治療リンゲル液が大幅にDMSOなしでリンゲル液四半期の強さに比べて、心拍数を増加または減少しません。溶液中の5％または10％DMSOを用いた治療は、心拍数の有意な減少を引き起こします。以下のように表す結果は、平均±SEM（N = 10）を意味します。 * P <0.05対0％DMSOコントロール （ダンの多重比較検定とクラスカル・ワリス検定）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

このアッセイは、関連するようにするためには、cardiomodulatory化合物での治療後の心拍数の変化を観察することが可能でなければなりません。生体アミンオクトパミンは、無脊椎動物¹⁰における神経調節物質として作用することが知られており、両方の果実におけるcardioaccelerant ^11、蜂蜜ミツバチ^7を飛ぶように作用することが示されています。 100 nMの、10μM、および100μMの濃度で、上記のようにオクトパミンは（4分強リンゲル液中の1％DMSO）車両に対して試験しました。 図5は、10μM及びオクトパミン100μMの濃度は有意に心拍数を増加させたことを実証し、この実験の結果を示しています。

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図5： 蜂の心拍数に対するオクトパミンの効果。分当たりのビートで測定したグラフは、基礎心拍数の変化率を示しています。 100nMのオクトパミンとミツバチの背血管の治療は大幅に増加または（4分強リンゲル液中の1％DMSO v / vの）車両に心拍数を相対的に低下させません。 10μMおよび100μMオクトパミンによる治療は大幅に車両に心拍数を相対的に増加しました。以下のように表す結果は、平均±SEM（N = 10）を意味します。 * P <0.05車両制御対（ダンの多重比較検定とクラスカル・ワリス検定）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments