Introduction
O objetivo geral desta metodologia é permitir que o investigador rapidamente e facilmente observar e quantificar o efeito que um agente farmacológico tem sobre o ritmo cardíaco das abelhas. As abelhas, como outros insectos, tem um sistema circulatório aberto que divulga hemolinfa, o equivalente de insectos de sangue, através da cavidade corporal, conhecido como o hemocelo. A circulação de hemolinfa é essencial para o transporte de nutrientes, factores do sistema imunológico, produtos de resíduos, bem neuro-hormonas e outras moléculas de sinalização 1. A circulação é facilitada pelo vaso dorsal, que se estende ao longo da linha média dorsal de insecto, bem como órgãos acessórios pulsáteis. O vaso dorsal é dividida em duas partes funcionalmente distintas, designou o coração no abdômen e na aorta no tórax e na cabeça. contrações propagadas na hemolinfa bomba do coração em direção ao tórax e cabeça, enquanto órgãos pulsátil acessórias garantir o fluxo de hemolinfa para as extremidades.
Outra abordagem que tem sido utilizado para estudar a atividade cardíaca abelha é dissecar parcialmente o inseto, a fim de expor o coração, em seguida medir contrações vaso dorsal, utilizando uma força de deslocamento transdutor 7. Neste protocolo, o coração é continuamente banhado com soro fisiológico em execução e co testempounds pode ser dissolvido nesta solução para aplicação sobre o assunto 7. Uma diferença significativa entre este método e os anteriormente descritos é que o cordão nervoso ventral é removido, eliminando o papel que o sistema nervoso central tem mostrado desempenhar na modulação da frequência cardíaca 5. O resultado é que a pulsação da linha de base, o qual geralmente é bastante errático, estabiliza a uma frequência muito mais baixa e a amplitude do que o tipicamente observado em um insecto vivo 5,7. O que todos estes métodos têm em comum é que eles exigem equipamento altamente especializado e, muitas vezes caros, além de um certo nível de perícia, a fim de ser conduzido. Talvez a maior desvantagem é que nenhuma destas abordagens são particularmente bem adequado para experiências que envolvem o teste de um grande número de sujeitos, tais como o rastreio de uma biblioteca de compostos potencialmente cardiomodulatory.
A maior força da abordagem aqui descritaé a sua simplicidade. O protocolo é relativamente fácil de dominar, a instalação requer pouco espaço, e apenas uma entrada financeiro mínimo é necessário. O método requer pouco mais de cerca de abelhas, alguns instrumentos cirúrgicos, uma solução isotónica, e quer um microscópio digital ou um microscópio tradicional com uma câmara digital. As abelhas são dissecados para visualizar o vaso dorsal e vídeos digitais são usados para gravar a frequência cardíaca antes e após o tratamento com agentes farmacológicos. Embora a gravação de vídeo não é realmente necessário observar alterações do ritmo cardíaco, ele irá aumentar o rendimento muito (ou seja, o número de indivíduos que podem ser processados em um determinado período de tempo). O investigador pode maximizar a eficiência através da gravação de um grande número de vídeos de uma só vez e depois marcando esses vídeos em um momento mais conveniente. Outra vantagem dessa abordagem é que os vídeos permitem que o investigador de começar de novo, deve o processo de pontuação ser interrompido, e torná-lo mais fácil para o viewer ser cegos para o tratamento, a fim de reduzir o desvio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Recolha e Preparação de assuntos de teste
- Coletar o número apropriado de abelhas da colônia.
NOTA: O número necessário depende não só do tamanho e escopo do experimento, mas também da habilidade do investigador. Por exemplo, se existem 2 grupos de tratamento com um tamanho de amostra desejada de 10 abelhas em cada grupo, um investigador razoavelmente habilidoso pode recolher pelo menos 30 abelhas para explicar dissecções sem sucesso e acabar com 20 vídeos úteis para marcar. - Minimizar a quantidade de tempo que passa entre a recolha e dissecção.
Nota: Embora as abelhas podem ser alojados no laboratório para os dias anteriores à dissecção, a taxa de sucesso de dissecção (isto é, a probabilidade de manter uma taxa cardíaca estável num vaso dorsal dissecados) foi observada para diminuir em relação à quantidade de tempo que abelhas estão alojados longe da colônia.- Fornecer abelhas com uma fonte de água e comida, enquanto alojada no laboratório. para example, no mínimo, proporcionar o acesso a uma 50% de solução de sacarose em água (v / W) (isto é suficiente para durações de menos de 6 horas). Para períodos mais longos, fornecer abelhas acesso ao mel.
- abelhas casa na noite de laboratório a uma temperatura de aproximadamente 32 ° C e 60-80% de umidade relativa para reduzir o estresse e evitar a desidratação.
- Antes de dissecação, anestesiar abelhas brevemente para auxiliar no manuseio.
NOTA: Isso pode diminuir a taxa de sucesso das dissecções e reduzir a taxa de transferência.- Relaxar as abelhas, quer por colocá-los em gelo ou em uma geladeira por apenas o tempo suficiente para reduzir o movimento, a fim de auxiliar no manuseio.
- Alternativamente, expor brevemente abelhas ao CO 2, a fim de auxiliar no manuseio.
NOTA: A exposição prolongada ao frio pode reduzir a taxa de sucesso de dissecações. Estendida ou repetida exposição ao CO 2 também pode reduzir a taxa de sucesso de dissecações.
2. Dissecçãoda Dorsal da parede abdominal
NOTA: As abelhas devem estar vivo no momento da dissecção.
- Utilizando uma pinça e / ou tesoura de microdissecção, retire as pernas e asas para facilitar a dissecção do abdômen. Manter um pequeno copo ou recipiente semelhante preenchido com água destilada nas proximidades para fins de enxaguamento instrumentos entre dissecações.
- Enquanto restringem a abelha com uma pinça, utilizar a tesoura para cortar microdissecção lateralmente ao longo da parede abdominal dorsal entre as primeira e segunda tergites (ver Figura 1).
Figura 1: Vista dorsal do abdômen abelha. A incisão inicial pode ser feita entre os primeiro e segundo tergites, como indicado pela linha vermelha. Escala da barra = 1 mm. Por favor, clique delae para ver uma versão maior desta figura.
- Enquanto levemente agarrando a borda posterior do segundo tergito com a pinça, cortado longitudinalmente ao longo de cada lado da abelha da incisão inicial para o aguilhão (ver Figura 2). Tenha cuidado ao cortar para evitar a perfuração do trato gastrointestinal.
Figura 2: Vista lateral do abdômen abelha. Os segundo e terceiro incisões devem ser feitas ao longo de cada lado do abdómen, como indicado pela linha vermelha. Escala da barra = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Trocar a tesoura para um segundo conjunto de pinça fina e utilizá-los para separar cuidadosamente parede abdominal dorsal do resto of abdômen. Suavemente remover o ferrão e qualquer parte do tracto gastrintestinal que se mantém ligado à parede abdominal dorsal. Evitar a ruptura do intestino, como o conteúdo pode revestir a parede abdominal e impedir a visualização do vaso dorsal.
Figura 3: Vista do vaso dorsal. Uma vez que o intestino e ferrão ter sido removida, o vaso dorsal é visível ao longo da linha média da parede abdominal dorsal dissecados. Escala da barra = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Organizar a parede abdominal dorsal na orientação desejada por baixo da câmara de modo que o vaso dorsal é visível (veja a Figura 3). Utilizar a tesoura de microdissecção para aparar qualquer excesso de abdominal parede impede que a visualização do vaso dorsal. A forma da parede abdominal dorsal deve se assemelhar a um copo ou tigela rasa quando bem situado.
- Uma vez que o vaso dorsal não se estender para o segmento abdominal mais atrás da abelha, remover o tergito final a fim de melhorar a visualização do vaso dorsal.
- Utilizando uma micropipeta de volume ajustável, cobrir o vaso dorsal com 10 ml de uma solução isotônica para manter as condições fisiológicas e facilitar uma pulsação constante.
NOTA: A solução recomendada é de solução de Ringer força trimestre (0,120 g de cloreto de / L de cálcio, 0,105 g / L de cloreto de potássio, 0,050 g / L de bicarbonato de sódio e 2,250 g / L de cloreto de sódio), o qual foi encontrado para facilitar um estábulo, batimento cardíaco contínuo.
3. Observação e Modulação de Frequência Cardíaca
- Permitir que o vaso dorsal para repousar até que um batimento cardíaco estável, contínua é alcançada(Geralmente dentro de 300 segundos).
NOTA: A pulsação do coração é visualizado como contrações rítmicas do vaso dorsal. Inicialmente, pode não parecem ser batimento cardíaco, especialmente se a abelha foi anestesiado, mas o coração bater normalmente será retomada após o repouso em solução isotónica durante vários minutos, e pode continuar a bater por hora, desde que se mantenha banhadas em solução. - Medir o ritmo cardíaco em termos do número de batimentos por minuto (BPM).
- Grave o número de contrações observados durante um período de 60 segundos. Use um contador de contagem de mão e um temporizador para facilitar este processo.
- Medir a alteração da frequência cardíaca pelo registro da BPM observados antes e após o tratamento com um composto cardiomodulatory.
Nota: Embora o tempo necessário para se observar um efeito sobre a frequência cardíaca pode variar dependendo do composto a ser testado, as mudanças no ritmo cardíaco pode tipicamente ser observado no prazo de minutos.- Determinar a frequência cardíaca basal imediatamente antes daa adição de qualquer composto de ensaio.
NOTA: frequência cardíaca pós-tratamento geralmente pode ser determinada após 90 a 120 segundos. - Prepare cardiomodulators potenciais (por exemplo, octopamina) por dissolução do composto na mesma solução isotónica utilizados para banhar o vaso dorsal.
- Adicionar os compostos de teste para a solução envolvente do vaso dorsal utilizando um micropipetter.
- Determinar a frequência cardíaca basal imediatamente antes daa adição de qualquer composto de ensaio.
- Para maior precisão e maior rendimento, faça uma gravação de vídeo de cada assunto de teste e, em seguida, usar os vídeos para marcar frequência cardíaca em um momento posterior.
NOTA: Este permite que um único investigador para escalonar dissecações, a fim de facilitar a produção quase contínua de vídeos. Ao gravar vídeos, o comprimento mínimo recomendado é de aproximadamente 240 segundos com qualquer composto de teste que está sendo adicionado à marca dos 60 segundos. Isso garante que o investigador tem uma janela 60 seg para conseguir frequência cardíaca linha de base e, em seguida, uma outra janela 60 seg para conseguir pós-tratamento taxa cardíaca de 120 segdepois do tratamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma vez que muitos dos compostos farmacologicamente activos que podem ser testados utilizando este protocolo não são solúveis em água, é necessário ter um solvente fiável que permita que os compostos de teste a ser entregue através da solução isotónica utilizados para banhar o vaso dorsal. Dimetil sulfóxido (DMSO) é um solvente que é comumente utilizado como um veículo para a entrega de drogas e outros compostos experimentais em animais 8, e que tem sido usado com sucesso para esta finalidade em estudos que examinaram o efeito de pesticidas sobre abelha do mel actividade cardíaca 9. Consequentemente, DMSO foi seleccionado como um potencial veículo para a entrega de compostos de teste para o vaso dorsal, o que exigia que primeiro ser testados quanto à actividade cardiomodulatory. Neste protocolo, o vaso dorsal dissecado inicialmente é banhado em 10 ml de solução de trimestre de Ringer e, em seguida, a frequência cardíaca é determinada antes de adicionar compostos de teste. Os compostos de teste arE fornecida a uma concentração conhecida em 10 ul de DMSO dissolvidos em solução de Ringer força trimestre e, em seguida, o vaso dorsal é observado para alterações subsequentes no ritmo cardíaco.
Antes de testar todos os compostos, numa gama de concentração de DMSO foi testado quanto a qualquer efeito sobre a frequência cardíaca, em relação à solução de Ringer força trimestre com 0% de DMSO. DMSO foi dissolvido a 0,2%, 2%, 10%, e 20% v / v em solução força trimestre de Ringer, a fim de testar a uma concentração final de 0,1%, 1%, 5%, e 10%, quando adicionada num volume igual a a solução já banhando o vaso dorsal. foi utilizado Esta abordagem, em oposição à adição de DMSO na concentração desejada nas iniciais 10 ul utilizados para banhar o vaso dorsal, porque nem todos os dissecção produz um batimento cardíaco estável. Se DMSO tem um efeito adverso sobre o ritmo cardíaco, o efeito pode não ser distinguíveis de uma dissecção falhou. A frequência cardíaca foi avaliada imediatamente antes daadição de DMSO, e depois novamente de 120 seg mais tarde. A Figura 4 mostra os resultados desta experiência, demonstrando que 0,1% e 1% de DMSO na solução não teve nenhum efeito significativo sobre a frequência cardíaca, em relação à força trimestre solução de Ringer sem DMSO, ao passo que 5% e 10% de DMSO diminuiu significativamente a taxa do coração.
Figura 4: Efeito de DMSO sobre a frequência cardíaca de abelha. Gráfico mostra a variação percentual da freqüência cardíaca basal, medida em batimentos por minuto. Tratamento de vaso dorsal da abelha do mel com 0,1% ou 1% DMSO v / v em solução força trimestre de Ringer não aumenta significativamente ou diminuir a frequência cardíaca, em relação à solução de força trimestre de Ringer sem DMSO. O tratamento com 5% ou 10% de DMSO na solução provoca uma diminuição significativa na frequência cardíaca. Resultados expressos em média ± SEM (n = 10). * P <controle DMSO 0,05 vs 0% (Kruskal-Wallis com o teste de comparações múltiplas de Dunn). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para que este teste seja relevante, deve ser possível observar alterações do ritmo cardíaco após o tratamento com compostos cardiomodulatory. A octopamina amina biogénica é conhecido por actuar como um neuromodulador no invertebrados 10 e foi mostrado que actua como um cardioaccelerant em ambos moscas da fruta 11 e mel abelhas 7. A octopamina foi ensaiada contra o veículo (1% de DMSO na solução de Ringer força trimestre), como descrito acima, em concentrações de 100 nM, 10 uM e 100 uM. A Figura 5 mostra os resultados desta experiência, demonstrando que 10 uM e 100 uM de concentrações octopamina aumentou significativamente a taxa do coração.
t "fo: manter-together.within-page =" 1 ">
Figura 5: Efeito da octopamina na frequência cardíaca abelha. Gráfico mostra a variação percentual da freqüência cardíaca basal, medida em batimentos por minuto. Tratamento de vaso dorsal da abelha do mel com 100 nM octopamina não aumenta significativamente ou diminuir a frequência cardíaca em relação ao veículo (1% DMSO v / v em solução força trimestre de Ringer). O tratamento com 10 uM e 100 uM octopamina aumentou significativamente a frequência cardíaca em relação ao veículo. Resultados expressos em média ± SEM (n = 10). * P <0,05 vs controlo com veículo (teste de Kruskal-Wallis, com o teste de comparação múltipla de Dunn). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
- Klowden, M. J. Circulatory Systems. Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 3rd, 365-413 (2013).
- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
- Wasserthal, L. T. Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements. J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).
- Wasserthal, L. T. Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects. Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).
- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
- Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees. Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).
- Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition. J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).
- Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
- Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz. Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).
- Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).
- Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).
