La disección y la observación de la abeja de la miel dorsal del recipiente de Estudios de la función cardiaca

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

El objetivo general de esta metodología es permitir que el investigador para observar y cuantificar el efecto que tiene un agente farmacológico en el ritmo cardíaco de las abejas melíferas forma rápida y sencilla. Las abejas, como otros insectos, tienen un sistema circulatorio abierto que difunde hemolinfa, el equivalente de insectos de la sangre, a través de la cavidad del cuerpo, conocida como la hemocoel. La circulación de hemolinfa es esencial para el transporte de nutrientes, factores inmunológicos, productos de desecho, así neurohormonas y otras moléculas de señalización ^1. Circulation es facilitado por el vaso dorsal, que se extiende a lo largo de la línea media dorsal del insecto, así como los órganos pulsátiles accesorios. El vaso dorsal se divide en dos secciones funcionalmente distintas, designado el corazón en el abdomen y la aorta en el tórax y la cabeza. contracciones propagadas en la hemolinfa corazón bombee hacia el tórax y la cabeza, mientras que los órganos pulsátiles accesorios garantizan el flujo de la hemolinfa de las extremidades.

<pclass = "jove_content"> función cardíaca de insectos se puede observar usando una variedad de métodos, dependiendo de la magnitud, fase fisiología, o la vida del insecto. Un enfoque común para la observación de la frecuencia cardíaca en larvas o insectos más pequeños es el uso de imágenes intravital ^2. Este método es menos útil en las abejas adultas, sin embargo, ya que puede ser difícil de ver claramente el vaso dorsal a través de la pared abdominal. Un enfoque establecido para el registro de la frecuencia cardíaca en una variedad de insectos, incluyendo abejas, es el uso de la termografía de contacto, que utiliza termistores aplicado en el exterior del insecto para detectar pulsaciones cardiacas ^3,4. La frecuencia cardíaca en las abejas adultas también ha sido grabado utilizando una técnica electrofisiológica para medir una señal de impedancia eléctrica ^{de 4,5.} Esta técnica requiere la inserción de electrodos en el animal al lado del corazón y el uso de un convertidor de impedancia para registrar los latidos del corazón ^4. Del mismo modo, electrocardiogramas se han utilizado para DETECt señales eléctricas producidas por el corazón y combinados con grabación de vídeo de la abeja para observar los cambios en la actividad cardíaca ^6. Una clara ventaja de estos enfoques es que la frecuencia cardíaca se evalúa en una, abeja vivas intactas, en lugar de en un espécimen disecado, que ayuda a asegurar la disponibilidad de toda la gama de respuestas fisiológicas en el tema. Los desafíos de estos enfoques incluyen la contabilidad para la inmovilización o la anestesia de la materia, la necesidad de limitar las variables externas y estímulos que podrían alterar la frecuencia cardiaca, así como la determinación de un método de entrega adecuado al probar agentes farmacológicos.

Otro enfoque que se ha utilizado para el estudio de la actividad cardiaca de abeja es para diseccionar parcialmente el insecto con el fin de exponer el corazón, a continuación, medir contracciones vaso dorsal utilizando un transductor de desplazamiento de fuerza ^7. En este protocolo, el corazón se baña continuamente con solución salina fisiológica en marcha y prueba de compounds se pueden disolver en esta solución para su aplicación al objeto ^7. Una diferencia significativa entre este método y las descritas anteriormente es que el cordón nervioso ventral se elimina, eliminando el papel que el sistema nervioso central se ha demostrado que desempeña en la modulación de la frecuencia cardíaca ^5. El resultado es que el latido del corazón de referencia, que suele ser bastante irregular, se estabiliza a una frecuencia mucho más baja y amplitud que se observa típicamente en un insecto que viven ^5,7. Lo que todos estos métodos tienen en común es que requieren un equipo altamente especializado y, a menudo caro, además de un cierto nivel de experiencia, con el fin de llevar a cabo. Tal vez la mayor desventaja es que ninguno de estos enfoques son particularmente adecuados para experimentos que involucran el examen de un gran número de temas, tales como selección de una biblioteca de compuestos potencialmente cardiomodulatory.

La mayor fortaleza del método descrito aquíes su simplicidad. El protocolo es relativamente fácil de dominar, la instalación requiere poco espacio, y sólo una entrada financiero mínimo es necesario. El método requiere poco más que algunas abejas, algunos instrumentos quirúrgicos, una solución isotónica, y, o bien un microscopio digital o un microscopio tradicional con una cámara digital. Las abejas son diseccionados para visualizar el vaso dorsal y vídeos digitales se utilizan para registrar la frecuencia cardíaca antes y después del tratamiento con agentes farmacológicos. Aunque la grabación de vídeo no es realmente necesario para observar los cambios en el ritmo cardíaco, además de aumentar considerablemente el rendimiento (es decir, el número de sujetos que se pueden procesar en un período de tiempo determinado). El investigador puede maximizar la eficiencia mediante el registro de un gran número de vídeos a la vez y, posteriormente, marcando estos videos en un momento más conveniente. Otra ventaja de este enfoque es que los vídeos permiten al investigador a empezar de nuevo, se debe interrumpir el proceso de puntuación, y que sea más fácil para el vdel Visor para cegar al tratamiento con el fin de reducir el sesgo.

Protocol

1. Recogida y preparación de los sujetos de prueba Recoger el número apropiado de las abejas de la colonia. NOTA: El número necesario depende no sólo del tamaño y alcance del experimento, sino también la habilidad del investigador. Por ejemplo, si hay 2 grupos de tratamiento con un tamaño deseado de la muestra de 10 abejas por grupo, un investigador experto razonablemente podría recoger un mínimo de 30 abejas para dar cuenta de las disecciones sin éxito y terminar con 20 videos útiles para m…

Representative Results

Dado que muchos de los compuestos farmacológicamente activos que pueden ser probados usando este protocolo no son solubles en agua, es necesario tener un disolvente fiable que permitirá a los compuestos de ensayo para ser entregados a través de la solución isotónica usada para bañar al vaso dorsal. Dimetil sulfóxido (DMSO) es un disolvente que se utiliza comúnmente como un vehículo para la administración de fármacos experimentales y otros compuestos en los animales 8,</su…

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin…

Materials

Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments