Introduction
이 방법의 전반적인 목표는 연구자 빠르고 쉽게 관찰 및 약리 에이전트가 꿀벌의 심박수에 미치는 영향을 정량화 할 수 있도록하는 것입니다. 꿀벌은 다른 곤충처럼 hemocoel로 알려진 체강, 전반에 걸쳐, 체액, 혈액의 곤충 해당하는 발신 개방 순환 시스템을 가지고있다. 체액의 순환 영양분 면역 인자 폐기물뿐만 아니라 신경 호르몬 및 다른 시그널링 분자 (1)의 전송을 위해 필수적이다. 순환은 곤충의 지느러미 중간 선뿐만 아니라 액세서리 타악기 기관을 따라 연장 등의 용기에 의해 촉진된다. 지느러미 용기,이 기능적으로 별개의 섹션으로 나누어 복부에 심장 및 흉부와 머리에 대동맥 지정됩니다. 흉부와 머리를 향해 심장 펌프 체액에 전파 수축, 액세서리 박동 기관 사지에 체액의 흐름을 보장하면서.
꿀벌 심장 활동을 연구에 사용 된 또 다른 접근은 부분적으로 강제 변위 센서 (7)를 사용 등쪽 혈관 수축이어서, 심장을 노출 측정하기 위해 곤충 해부한다. 이 프로토콜에서, 마음은 계속 실행 생리 식염수 및 테스트 공동으로 목욕mpounds 피사체 7 응용 프로그램이 용액에 용해 될 수있다. 이 방법은 이들 전술 사이에 상당한 차이가 복부 신경 코드는 중추 신경계는 심장 박동 조절 5에서 재생되었음을 나타내는 역할을 제거하는 제거된다는 것이다. 그 결과, 일반적으로 매우 불안정하다 기준선 하트 비트가 훨씬 낮은 주파수에서 안정 및 진폭보다 전형적으로 살아있는 곤충 5,7-에서 관찰된다는 것이다. 어떻게 이들 모든 방법은 공통점을 실시하기 위하여, 전문이 일정 수준에 더하여, 고도의 전문 종종 고가의 장비를 필요로한다는 것이다. 아마도 가장 큰 단점은 이들 접근법 중 어느 것도 특히 이러한 잠재적 cardiomodulatory 화합물의 라이브러리를 스크리닝 피험자 다수시키는 테스트 실험에 적합하지된다는 것이다.
여기에 설명 된 접근 방법의 가장 큰 장점단순이다. 프로토콜은 작은 설치 공간을 필요로 마스터 비교적 용이하고, 단지 최소한의 금융 입력이 필요하다. 상기 방법은 몇몇 꿀벌 몇몇 수술 도구, 등장액보다 조금 더 필요로하고, 디지털 현미경, 디지털 카메라 전통적인 현미경 하나. 꿀벌 지느러미 용기를 시각화하는 해부하고, 디지털 비디오는 이전과 약리 에이전트와 치료 후 심장 박동을 기록하는 데 사용됩니다. 비디오 기록은 심박수의 변화를 관찰하기 위해 실제로 필요한 것은 아니지만 크게 처리량을 증가 (즉, 주어진 시간에 처리 할 수있는 환자 수). 조사관은 한 번에 동영상의 큰 숫자를 기록하고 나중에 더 편리한 시간에이 동영상을 득점하여 효율성을 극대화 할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 비디오 연구자가 득점 프로세스가 중단되어야한다, 시작 및 V에 대한보다 쉽게 할 수 있다는 것입니다iewer은 바이어스를 감소시키기 위해 처리를 멀게한다.
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Protocol
1. 수집 및 시험 과목의 준비
- 식민지에서 꿀벌의 해당 번호를 수집합니다.
주 : 필요한 수의 크기와 실험의 범위뿐만 아니라, 조사원의 기술뿐만 의존한다. 두 치료 그룹은 그룹 당 10 벌의 원하는 샘플 크기가있는 경우 예를 들어, 합리적으로 숙련 된 연구자가 실패 해부을 설명하고 득점 20 유용한 동영상을 끝내고 적어도 30 벌을 수집 할 수 있습니다. - 수집 및 절개 사이를 통과하는 시간을 최소화한다.
주 : 꿀벌이 일전 박리에 대해 실험에 수납 할 수 있지만, 해부의 성공률 (해부 등쪽 용기 안정적인 심박수를 유지할 가능성이 IE) 시간에 대하여 감소하는 것으로 관찰되었음을 꿀벌은 멀리 식민지에서 수용된다.- 실험실에 보관하면서 물과 음식의 소스와 꿀벌을 제공합니다. 엑사에 대한mple 최소한 (이보다 6 시간의 기간에 충분하다) 물 수크로오스 용액 (V / w) 50 %에 대한 액세스를 제공한다. 오랜 기간 동안, 꿀벌은 꿀에 대한 액세스를 제공합니다.
- 약 32 ° C 60-80 %의 상대 습도의 온도에서 랩 하룻밤 하우스 꿀벌은 스트레스를 감소시키고 탈수를 방지 할 수 있습니다.
- 이전 해부에, 처리에 도움을 간략하게 벌을 마취.
주 :이 해부의 성공률을 감소시키고 처리량을 감소시킬 수있다.- 얼음에 그들을 배치하거나 그냥 충분히 처리에 도움이하기 위해 이동을 감소하기위한 냉장고에 하나 꿀벌을 진정.
- 또는 간단히 처리에 도움이하기 위해 CO 2에 꿀벌을 노출.
참고 : 감기에 확장 노출 해부의 성공률을 감소시킬 수있다. 특별 또는도 해부의 성공 확률을 줄일 수 CO 2 노출을 반복했다.
2. 해부지느러미 복부 벽의
참고 : 꿀벌 해부의 시간에 살아 있어야한다.
- 집게 및 / 또는 미세 절제 위, 제거 다리와 날개를 사용하여 복부의 절개를 용이하게한다. 작은 비커 또는 해부 사이에 악기를 세척하기위한 목적으로 인근 증류수로 채워진 유사한 용기를 보관하십시오.
- 집게로 꿀벌을 억제하면서, 제 1 및 제 2 tergites의 등쪽 복벽을 따라 횡 방향으로 절단하기 위해 미세 절제 가위를 이용 (도 1 참조).
그림 1 : 꿀벌의 복부 지느러미 볼 수 있습니다. 빨간 선으로 표시된 바와 같이 초기 절개, 제 1 및 제 2 tergites 사이에해야한다. 스케일 바 = 1mm. 그녀를 클릭하세요전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
- 가볍게 집게 제 tergite의 후방 모서리를 파지하는 동안 바늘의 초기 절개에서 벌의 각각의 측면을 따라 길이 방향으로 절단 (도 2 참조). 위장관 천공 방지하기 위해 절단시주의하십시오.
그림 2 : 꿀벌의 복부의 측면보기. 적색 선으로 나타낸 바와 같이 두번째와 세번째 절개는 복부 쪽 함께 이루어져야한다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 미세 집게의 두 번째 세트 가위를 교환하고주의 깊게 나머지 오에서 지느러미 복부 벽을 분리하도록 활용복부 바. 조심스럽게 바늘과 지느러미 복부 벽에 부착 된 상태로 유지 위장관의 일부를 제거합니다. 내용이 지느러미 용기의 시각화를 방해 코트 복벽을하고 같이 장을 파열하지 마십시오.
그림 3 : 지느러미 용기의보기. 창자와 바늘이 제거되고 나면, 지느러미 용기는 해부 등의 복부 벽의 중간 선을 따라 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 지느러미 용기 볼 수 있도록 카메라 밑의 원하는 방향으로 지느러미 복벽을 배열 (도 3 참조). 초과 AB를 멀리 트림하는 미세 절제 가위 활용지느러미 용기의 시각화를 방해 dominal 벽. 제대로 자리 잡고 때 지느러미 복부 벽의 형태는 얕은 컵이나 그릇과 유사합니다.
- 지느러미 선박이 꿀벌의 후퇴 한계 복부 세그먼트로 확장되지 않기 때문에, 지느러미 용기의 시각화를 개선하기 위해 최종 tergite를 제거합니다.
- 조정 볼륨 마이크로 피펫을 활용, 생리적 조건을 유지하고 지속적으로 심장 박동을 촉진하기위한 등장 성 용액 10 μL와 지느러미 선박을 커버합니다.
주 : 권장 해결책이 분기 강도 링거 용액 (0.120 g / 리터, 칼슘 클로라이드, 0.105 g / L 염화칼륨, 0.050 g / L 중탄산 나트륨, 및 2.250 g / L 염화나트륨) 안정을 촉진하는 것으로 밝혀졌다, 연속 하트 비트.
3. 관측 및 심박수의 변조
- 안정적이고 지속적인 심장 박동이 달성 될 때까지 등의 용기는 그대로 앉아 허용(일반적으로 300 초 이내).
참고 : 하트 비트는 등의 용기의 리듬 수축으로 가시화된다. 처음에는 꿀벌이 마취 된 특히, 하트 비트 수없는 것으로 나타날 수 있지만, 마음은 보통 몇 분 동안 등장 성 용액에 휴식 후 박동을 다시 시작하고 시간 동안 구타를 계속할 수 있습니다,이 용액에 목욕을 유지 제공. - 분 (BPM) 당 비트 수의 측면에서 심장 박동수를 측정한다.
- 60 초의 시간 동안 관찰 수축의 수를 기록한다. 이 과정을 촉진하기 위해 손 집계 카운터 및 타이머를 사용합니다.
- 전과 cardiomodulatory 화합물로 처리 한 후에 관찰 BPM을 기록하여 심박수의 변화를 측정한다.
주 : 시간은 시험되는 화합물에 따라 달라질 수 심장 박동수에 영향을 관찰하기 위해 필요하지만, 심박수의 변화는 일반적으로 분 이내에 관찰 할 수있다.- 직전 기준 심박수를 결정어떠한 시험 화합물의 첨가.
주 : 치료 후 심박수는 일반적으로 90 내지 120 초 후에 결정될 수있다. - 지느러미 용기를 목욕하는 데 사용되는 같은 등장 성 용액에 화합물을 용해하여 잠재적 cardiomodulators (예를 들면, 옥토 파민)을 준비합니다.
- micropipetter를 이용하여 지느러미 용기 주변의 용액에 시험 화합물을 추가한다.
- 직전 기준 심박수를 결정어떠한 시험 화합물의 첨가.
- 높은 정확도 및 높은 처리량의 경우, 각 시험 대상의 비디오 녹화를 만든 다음 나중에 심장 박동의 점수에 동영상을 사용합니다.
참고 :이 동영상의 거의 연속 생산을 촉진하기 위해 해부를 비틀 수있는 단일 조사를 할 수 있습니다. 비디오를 녹화 할 경우, 최소 권장 길이는 시험 화합물과 약 240 초 60 초 마크에서 추가되는 것입니다. 이 조사는베이스 라인 심박수 다음 후 처리 심박수 120 초를 기록하는 또 다른 60 초 창을 처치 60 초 창이 있는지 확인합니다치료 후.
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Representative Results
이 프로토콜을 이용하여 테스트 될 수있는 약리학 적 활성 성분의 대부분은 물에 용해되지 않기 때문에, 이는 시험 화합물이 등쪽 용기 목욕 사용 등장액을 통해 전달 될 수 있도록 신뢰성있는 용매를 가질 필요가있다. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)는 일반적으로 동물 8 실험 약물 및 다른 화합물을 전달하기위한 수단으로 사용되는 용매이며, 꿀벌 심장 활동 9 농약의 효과를 조사 연구에서 이러한 목적을 위해 성공적으로 사용되어왔다. 따라서, DMSO는 처음 cardiomodulatory 활동을 테스트 할 것을 요구하는 등의 용기에 시험 화합물을 전달하기위한 잠재적 인 차량으로 선정되었다. 이 프로토콜에서, 해부 등의 용기는 처음 분기 강도 링거 용액 10 μL에서 목욕을 한 후 심장 박동이 시험 화합물을 추가하기 전에 결정된다. 시험 화합물은 아칸소전자는 분기 강도 링거 용액에 용해 DMSO 10 μL에 알려진 농도로 전달하고 지느러미 용기는 심장 박동의 후속 변경에 대한 관찰된다.
임의의 화합물을 시험 전, DMSO의 농도 범위 0 % DMSO로 분기 강도 링거액 상대 심박수에 영향에 대해 시험 하였다. DMSO 0.2 %, 2 %, 10 %로 용해하고, 0.1 %, 1 %, 5 %, 10 %의 최종 농도를 테스트하기 위해 분기 강도 링거액 20 % V / V와 같은 부피 첨가 때시켰다 이 솔루션은 이미 등의 용기를 목욕. 등쪽 용기 목욕 사용 초기 10 μL에 원하는 농도로 DMSO를 첨가 반대하지 각 절개 안정적인 하트 비트를 산출하기 때문에이 접근법을 사용 하였다. DMSO는 심장 박동에 악영향이있는 경우,이 효과는 실패한 절개 구별하지 않을 수도있다. 심장 박동 이전에 바로 평가 하였다DMSO를 추가 한 다음 다시 120 초 이상. 도 4는 5 %와 10 % DMSO가 크게 심박수를 저하하는 반면, 0.1 %, 1 % DMSO 용액에서 분기 강도 DMSO없이 링거액 상대 심박수에 큰 영향을 없었다는 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다.
그림 4 : 꿀벌 심장 박동에 DMSO의 효과. 분당 비트 중에서 측정 한 그래프는 기저 심박수의 변화율을 나타낸다. 크게 증가 또는 DMSO없이 분기 강도 링거액에 비해 심박수를 감소하지 않습니다 분기 강도 링거액 0.1 % 또는 1 % DMSO의 v / V를 꿀 꿀벌 등의 용기의 치료. 용액을 5 % 또는 10 % DMSO로 처리 심박수의 현저한 감소를 야기한다. 표현 결과를 ± SEM (N = 10)을 의미한다. * P <0.05 대 0 % DMSO 제어 (크루스 칼 - 월리스는 던의 다중 비교 테스트로 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 분석은 관련성위한 위해서는 cardiomodulatory 화합물로 처리 다음 심박수의 변화를 관찰 할 수 있어야한다. 생체 아민 옥토 파민은 무척추 동물 (10)의 신경 조절 역할을하는 것으로 알려져 두 과일의 cardioaccelerant 11과 꿀 꿀벌 7을 운항하는 역할을하는 것으로 나타났다. 100 nM 내지 10 μM, 100 μM의 농도로 상술 된 바와 같이 옥토 파민은 (분기 강도 링거액에 1 % DMSO), 차량에 대해 시험 하였다. 도 5 및 10 μM 옥토 파민 100 μM의 농도가 상당히 심박수 증가 것을 보여주는 실험 결과를 나타낸다.
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그림 5 : 꿀벌 심장 박동에 옥토 파민의 효과. 분당 비트 중에서 측정 한 그래프는 기저 심박수의 변화율을 나타낸다. 100 나노 미터 옥토 파민 꿀 꿀벌 등의 용기의 치료는 크게 증가 또는 (분기 강도 링거액에 1 % DMSO의 v / v)의 차량에 심장 박동 상대적으로 감소하지 않습니다. 10 μM, 100 μM의 옥토 파민과 치료는 크게 차량에 심장 박동 상대적으로 증가했다. 표현 결과를 ± SEM (N = 10)을 의미한다. * P <0.05 차량 제어 대 (던의 다중 비교 테스트와 크루스 칼 - 월리스 시험). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
- Klowden, M. J. Circulatory Systems. Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 3rd, 365-413 (2013).
- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
- Wasserthal, L. T. Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements. J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).
- Wasserthal, L. T. Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects. Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).
- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
- Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees. Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).
- Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition. J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).
- Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
- Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz. Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).
- Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).
- Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).
