विच्छेदन और हनी बी पृष्ठीय पोत का अवलोकन हृदय समारोह के अध्ययन के लिए

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

इस पद्धति के समग्र लक्ष्य के अन्वेषक जल्दी और आसानी से पालन और प्रभाव एक औषधीय एजेंट मधु मक्खियों के दिल की दर पर है कि यों करने की अनुमति है। मधुमक्खियों, अन्य कीड़ों की तरह, एक खुला संचार प्रणाली है कि hemolymph, खून की कीट बराबर प्रसार, शरीर गुहा, hemocoel के रूप में जाना भर है। Hemolymph का प्रचलन पोषक तत्वों, प्रतिरक्षा कारकों, अपशिष्ट उत्पादों, साथ ही neurohormones और अन्य संकेतन अणुओं ¹ के परिवहन के लिए आवश्यक है। सर्कुलेशन पृष्ठीय जहाज है, जो कीट के पृष्ठीय midline, साथ ही गौण गुणवाला अंगों के साथ फैली से मदद की है। पृष्ठीय पोत, दो कार्यात्मक अलग वर्गों में बांटा गया है पेट में दिल और छाती और सिर में महाधमनी नामित। छाती और सिर की ओर हृदय पंप hemolymph में प्रचारित संकुचन, सहायक गुणवाला अंगों पांव को hemolymph प्रवाह को सुनिश्चित करते हुए।

<pवर्ग = "jove_content"> कीट हृदय समारोह तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर, आकार, शरीर क्रिया विज्ञान, या जीवन कीट की अवस्था पर निर्भर करता देखा जा सकता है। लार्वा या छोटे कीड़ों में दिल की दर के अवलोकन के लिए एक आम दृष्टिकोण intravital इमेजिंग ² का इस्तेमाल होता है। इस विधि के रूप में यह स्पष्ट रूप से पेट की दीवार के माध्यम से पृष्ठीय पोत देखने के लिए मुश्किल हो सकता है, वयस्क मधुमक्खियों में कम उपयोगी है लेकिन है। कीड़े, मधुमक्खियों सहित की एक किस्म में दिल की दर की रिकॉर्डिंग के लिए एक स्थापित दृष्टिकोण, संपर्क thermography, जो कीट के बाहरी हृदय स्पंदन ^3,4 का पता लगाने के लिए आवेदन किया thermistors का इस्तेमाल का इस्तेमाल होता है। वयस्क मधुमक्खियों में दिल की दर भी एक बिजली प्रतिबाधा संकेत ^4,5 को मापने के लिए एक electrophysiological तकनीक का उपयोग कर दर्ज किया गया है। इस तकनीक को दिल के बगल में इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि जानवर में और एक प्रतिबाधा कनवर्टर का उपयोग दिल की धड़कन को ⁴ रिकॉर्ड करने के लिए की आवश्यकता है। इसी तरह, electrocardiograms detec करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैबिजली के दिल से उत्पादन किया है और हृदय की गतिविधि ⁶ में परिवर्तन का पालन करने के लिए मधुमक्खी की वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त संकेतों टी। इन तरीकों के विशिष्ट लाभ यह है कि दिल की दर, एक अक्षुण्ण, रहने वाले मधुमक्खी में मूल्यांकन किया है बल्कि एक विच्छेदित नमूना है, जो इस विषय में शारीरिक प्रतिक्रियाओं की पूरी रेंज की उपलब्धता सुनिश्चित करने में मदद करता है की तुलना में है। इन तरीकों की चुनौतियों का स्थिरीकरण या विषय, बाहर चर और उत्तेजनाओं कि दिल की दर को बदल सकता है, साथ ही जब औषधीय एजेंटों के परीक्षण के लिए एक उचित वितरण पद्धति का निर्धारण को सीमित करने की जरूरत के anesthetization के लिए लेखा शामिल हैं।

एक और दृष्टिकोण है कि मधुमक्खी के हृदय की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है आंशिक रूप से आदेश दिल को बेनकाब करने के लिए, तो उपाय के एक बल विस्थापन ट्रांसड्यूसर ⁷ का उपयोग कर पृष्ठीय पोत संकुचन में कीट टुकड़े करना है। इस प्रोटोकॉल में, दिल लगातार चल रहे शारीरिक खारा और परीक्षण सह के साथ नहाया हैmpounds विषय ^{से 7} आवेदन के लिए इस समाधान में भंग किया जा सकता है। इस विधि और उन पहले से वर्णित के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि उदर तंत्रिका कॉर्ड निकाल दिया जाता है, भूमिका है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र दिल की दर ⁵ नियमन में खेलने के लिए दिखाया गया है को नष्ट करने के लिए है। नतीजा यह है कि आधारभूत दिल की धड़कन है, जो आम तौर पर काफी अनिश्चित है, एक बहुत कम आवृत्ति पर स्थिर है और आयाम की तुलना में आम तौर पर रहने वाले एक कीट ^5,7 में मनाया जाता है। क्या इन तरीकों के सभी आम में है कि वे अति विशिष्ट और अक्सर महंगे उपकरण की आवश्यकता होती है, विशेषज्ञता का एक निश्चित स्तर के अलावा, क्रम में आयोजित किया जा रहा है। शायद सबसे बड़ा नुकसान यह है कि इन तरीकों में से कोई भी विशेष रूप से अच्छी प्रयोगों है कि इस तरह के संभावित cardiomodulatory यौगिकों के एक पुस्तकालय स्क्रीनिंग के रूप में विषयों की एक बड़ी संख्या में शामिल परीक्षण, के लिए अनुकूल हैं है।

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण की सबसे बड़ी ताकतअपनी सादगी है। प्रोटोकॉल, मास्टर करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है सेटअप कम जगह की आवश्यकता है, और केवल एक न्यूनतम वित्तीय इनपुट आवश्यक है। विधि कुछ मधुमक्खियों, कुछ शल्य चिकित्सा उपकरणों, एक isotonic समाधान की तुलना में थोड़ा अधिक है और आवश्यकता है, या तो एक डिजिटल माइक्रोस्कोप या एक डिजिटल कैमरे के साथ एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप। मधुमक्खियों पृष्ठीय पोत कल्पना करने के लिए विच्छेदित कर रहे हैं और डिजिटल वीडियो से पहले और औषधीय एजेंटों के साथ इलाज के बाद हृदय की दर को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि वीडियो रिकॉर्डिंग नहीं वास्तव में दिल की दर में परिवर्तन का पालन करने के लिए आवश्यक है, यह बहुत throughput में वृद्धि होगी (यानी, विषय है कि समय की दी गई राशि में कार्रवाई की जा सकती की संख्या)। अन्वेषक एक बार में वीडियो की एक बड़ी संख्या में रिकॉर्डिंग और फिर बाद में एक और अधिक सुविधाजनक समय पर इन वीडियो स्कोरिंग द्वारा क्षमता को अधिकतम कर सकते हैं। इस दृष्टिकोण का एक अन्य लाभ यह है कि वीडियो अन्वेषक अधिक शुरू, स्कोरिंग प्रक्रिया बाधित किया जाना चाहिए, और यह V के लिए आसान बनाने के लिए अनुमति हैiewer आदेश पूर्वाग्रह को कम करने के उपचार के लिए अंधा हो जाना है।

Protocol

1. संग्रह और परीक्षण विषयों की तैयारी कॉलोनी से मधुमक्खियों की उपयुक्त संख्या ले लीजिए। ध्यान दें: संख्या की जरूरत न केवल आकार और प्रयोग की गुंजाइश है, लेकिन यह भी अन्वेषक के कौशल पर निर्भर करता ह?…

Representative Results

चूंकि औषधीय सक्रिय यौगिकों कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग परीक्षण किया जा सकता है की कई पानी में घुलनशील नहीं कर रहे हैं, यह एक विश्वसनीय विलायक कि परीक्षण यौगिकों isotonic पृष्ठीय पोत स्नान करने के ल…

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin…

Materials

Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments