Disseksjon og Observasjon av Honey Bee Dorsal Vessel for studier av hjertefunksjonen

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

Det overordnede målet med denne metoden er å la etterforsker for å raskt og enkelt observere og kvantifisere effekten som en farmakologisk middel har på puls av honningbier. Bier, i likhet med andre insekter, har et åpent sirkulasjonssystem som sprer hemolymfe, insekt tilsvarende blod, i hele kroppens hulrom, kjent som hemocoel. Sirkulasjonen av hemolymfe er vesentlig for transport av næringsstoffer, immunologiske faktorer, avfallsprodukter, samt neurohormones og andre signaliseringsmolekyler ^1. Circulation lettes ved den dorsale fartøyet, som strekker seg langs rygglinjen av insekt, så vel som hjelpe pulsatile organer. Den dorsale kar er delt i to funksjonelt forskjellige seksjoner som er betegnet som hjerte i magen og aorta i thorax og hode. Spredd sammentrekninger i hjertet pumpe hemolymph mot thorax og hode, mens tilbehøret pulsatile organer sikre hemolymph strømmen til ekstremiteter.

<pclass = "jove_content"> Insect hjertefunksjonen kan observeres ved hjelp av en rekke metoder, avhengig av størrelsen, fysiologi, eller livsstadium av insekt. En felles tilnærming for å observere hjertefrekvensen hos larver eller mindre insekter er bruk av intrabilde ^2. Denne metoden er mindre nyttig i voksen bier, men som det kan være vanskelig å klart vise den dorsale fartøyet gjennom bukveggen. En etablert metode for opptak puls i en rekke forskjellige insekter, deriblant bier, er bruken av kontakt termografi, som benytter termistorer påføres på utsiden av insekt å detektere hjertepulseringer ^3,4. Hjertefrekvens hos voksne bier har også blitt spilt inn ved hjelp av en elektrofysiologisk teknikk for å måle en elektrisk impedans signal ^4,5. Denne teknikken krever innsetting av elektroder i dyret ved siden av hjertet, og bruken av en impedansomformer for å registrere hjerteslag ^4. Tilsvarende elektro har blitt brukt til å Detect elektriske signaler som produseres av hjertet og kombinert med videoopptak av bee å observere endringer i hjerteaktivitet ^6. En klar fordel med disse metodene er at pulsen blir vurdert i et intakt, stue bie, snarere enn i en dissekert prøven, som bidrar til å sikre tilgjengeligheten av hele spekteret av fysiologiske responser i faget. Utfordringene med disse metodene omfatter regnskap for immobilisering eller anesthetization av faget, behovet for å begrense utenfor variabler og stimuli som kan endre hjertefrekvens, samt bestemme en passende leveringsmåte ved testing av farmakologiske midler.

En annen tilnærming som har blitt benyttet for å studere bie hjerteaktivitet er for delvis å dissekere insekt for å blottlegge hjertet, deretter måle rygg fartøyet kontraksjoner ved hjelp av en kraft forskyvnings transduser ^7. I denne protokollen, hjertet er stadig badet med løping fysiologisk saltvann og test compounds kan løses i denne løsningen for søknad til emnet ^7. En vesentlig forskjell mellom denne fremgangsmåte og de tidligere beskrevne, er at det ventrale nervesystemet er fjernet, noe som eliminerer den rolle i sentralnervesystemet har vist seg å spille ved modulering av puls ^5. Resultatet er at grunnlinjen hjerterytme, som vanligvis er ganske ujevn, stabiliseres ved en mye lavere frekvens og amplitude enn det som vanligvis observeres i et levende insekt ^5,7. Det alle disse fremgangsmåter har til felles, er at de krever høyt spesialisert og ofte kostbart utstyr, i tillegg til et visst nivå av ekspertise, for å bli utført. Kanskje den største ulempen er at ingen av disse metodene er spesielt godt egnet til forsøk som innebærer utprøving et stort antall fag, som for eksempel screening et bibliotek av potensielt cardiomodulatory forbindelser.

Den største styrken til tilnærmingen som er beskrevet herer dens enkelhet. Protokollen er relativt lett å mestre, oppsettet krever liten plass, og bare en minimal økonomisk innspill er nødvendig. Metoden krever litt mer enn noen bier, et par kirurgiske instrumenter, en isotonisk oppløsning, og enten et digitalt mikroskop eller et tradisjonelt mikroskop med et digitalt kamera. Bier dissekeres for å visualisere ryggbeholderen og digital video blir brukt til å registrere puls før og etter behandling med farmakologiske midler. Selv videoopptak er faktisk ikke nødvendig å observere endringer i hjerterytmen, vil det øke gjennomstrømning (dvs. det antall individer som kan behandles i en gitt tidsperiode). Etterforskeren kan maksimere effektiviteten ved å ta opp et stort antall videoer samtidig og senere utføre disse videoene på et mer passende tidspunkt. En annen fordel med denne tilnærmingen er at videoene la etterforsker for å starte på nytt, bør scoring prosessen avbrytes, og gjøre det lettere for viewer å bli blindet for behandlingen for å redusere skjevhet.

Protocol

1. Innsamling og klargjøring av testpersonene Samle riktig antall bier fra kolonien. MERK: Antallet som trengs avhenger ikke bare av størrelsen og omfanget av forsøket, men også dyktighet av etterforsker. For eksempel, hvis det er 2 behandlingsgruppene med en ønsket utvalgsstørrelse på 10 bier per gruppe, kan en rimelig dyktig etterforsker samle minst 30 bier å gjøre rede for mislykkede disseksjoner og ender opp med 20 nyttige videoer for å score. Minimere mengden av tid som går me…

Representative Results

Siden mange av de farmakologisk aktive forbindelser som kan bli testet ved hjelp av denne protokollen er ikke oppløselige i vann, er det nødvendig å ha et pålitelig oppløsningsmiddel som vil tillate testforbindelsene som skal leveres via isotonisk oppløsning anvendt til å bade dorsal fartøyet. Dimetylsulfoksid (DMSO) er et løsemiddel som er ofte brukt som et redskap for å levere eksperimentelle medikamenter og andre forbindelser i dyr 8, og det har vært brukt med he…

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin…

Materials

Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments