Introduction
Bu metodoloji genel amacı araştırmacı hızlı ve kolay gözlemlemek ve farmakolojik ajan bal arılarının kalp atım hızı üzerindeki etkisini ölçmek için izin vermektir. Arılar, diğer böcekler gibi, hemocoel olarak bilinen vücut boşluğuna boyunca, hemolimf, kan böcek eşdeğer yaymaktadır açık dolaşım sistemi var. Hemolimf dolaşımı besin bağışıklık faktör, atık ürünleri, hem de nörohormonlar ve diğer sinyal molekülleri 1 taşınması için gereklidir. Ödünç böcek dorsal orta hat, hem de bir aksesuar pulsatil organları boyunca uzanır dorsal kabında ile kolaylaştırılır. dorsal damar, iki fonksiyonel bölüme ayrılırdı karın kalp ve göğüs ve baş aorta belirlenir. Göğüs ve kafa doğru kalp pompası hemolimf yayılır kasılmalar, aksesuar pulsatil organları ekstremitelerde hemolimf akışını sağlamak ise.
Arı kardiyak aktivite eğitimi için kullanılan bir başka yaklaşım kısmen bir kuvvet yer değiştirme dönüştürücü 7'yi kullanarak dorsal damar kasılmaları daha sonra, kalp maruz ölçmek için böcek incelemek etmektir. Bu protokol, kalp sürekli çalışan serum fizyolojik ve test işbirliği ile yıkanıyormpounds konu 7 uygulaması için bu çözelti içinde çözündürülebilir. Bu yöntem ve bu, daha önce tarif edildiği arasındaki önemli bir fark, ventral sinir kablosu, merkezi sinir sistemi, kalp hızı 5 modüle oynadığı gösterilmiştir ki rol ortadan kaldırılmış olmasıdır. Sonuç, genellikle oldukça düzensiz bazal kalp atışı, çok daha düşük frekansta stabilize ve genlik daha tipik bir canlı böcek 5,7 gözlenen olmasıdır. Ne bu yöntemlerin hepsi ortak noktası ise yapılacak üzere, uzmanlık belirli bir seviyeye ek olarak, son derece özel ve genellikle pahalı ekipman gerektirir olmasıdır. Belki de en büyük dezavantajı, bu yaklaşımların hiçbiri, özellikle bu potansiyel cardiomodulatory bileşiklerin bir kütüphanenin taranması gibi konularda çok sayıda test ihtiva eden deneyler için uygun olmasıdır.
Burada anlatılan yaklaşımın en büyük gücüsadeliği. protokol ayarı az yer kaplar, usta nispeten kolaydır, ve sadece minimal mali giriş gereklidir. yöntem bazı arılar, birkaç cerrahi aletler, izotonik solüsyon biraz daha gerektirir ve bir dijital mikroskop veya dijital kamera ile geleneksel mikroskop ya. Arılar dorsal gemi görselleştirmek için disseke ve dijital video öncesi ve farmakolojik ajanlar ile tedavi sonrası kalp hızını kaydetmek için kullanılır. Video kayıt kalp hızı değişiklikleri gözlemlemek için aslında gerekli değildir, ancak, büyük ölçüde verim artar (yani, belirli bir zaman miktarı işlenebilir konuların sayısı). Araştırmacı seferde videoların çok sayıda kayıt ve daha sonra bir daha uygun bir zamanda bu videoları puanlama verimliliği en üst düzeye çıkarabilirsiniz. Bu yaklaşımın bir diğer avantajı videoları araştırmacı puanlama süreci kesintiye gerektiğini, baştan başlamak ve v için daha kolay hale getirmek için izin olduğunuiewer önyargı azaltmak için tedaviye kör edilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Toplama ve Test Konularının hazırlanması
- koloni arı uygun sayıda toplayın.
NOT: Gerekli sayı boyutu ve deney kapsamında, aynı zamanda araştırmacının beceri sadece bağlıdır. 2 tedavi grubu, grup başına 10 arı istenen örneklem büyüklüğü ile varsa Örneğin, bir makul yetenekli araştırmacı başarısız diseksiyonlardan hesap ve skoru 20 Yararlı videolar ile sonuna kadar en az 30 arı toplamak olabilir. - toplanması ve diseksiyon arasında geçen süreyi en aza indirin.
NOT: Arılar gün önce diseksiyon için laboratuvarda muhafaza edilebilmesine rağmen, diseksiyonları başarı oranı (bir disseke dorsal geminin istikrarlı bir kalp hızını sürdürmek olasılığı yani) zaman miktarına göre azaldığı gözlenmiştir edildiğini arılar uzakta koloniden yerleştirilmiştir.- Laboratuvarda muhafaza ederken su ve yiyecek kaynağı ile arıları sağlamak. EXA içinmple, en azından (bu en az 6 saat süreleri için yeterli olan) su içinde sükroz çözeltisi (ağ / hac)% 50 erişimi sağlar. uzun süreler için, arılar bal erişim sağlar.
- Yaklaşık 32 ° C ve% 60-80 bağıl nem sıcaklıkta laboratuar gecede Ev arılar stresi azaltmak ve dehidratasyonu önlemek için.
- Diseksiyon önce, taşıma yardımcı olmak için kısaca arıları uyutmak.
NOT: Bu diseksiyonları başarı oranını azaltmak ve verimi azaltabilir.- buz üzerinde yerleştirerek ya da sadece yeterince uzun işlemede yardımcı olmak amacıyla hareketi azaltmak için bir buzdolabına ya arıları Chill.
- Alternatif olarak, kısaca ele alınmasında yardımcı olmak amacıyla CO 2 arılar maruz bırakmaktadır.
NOT: soğuğa maruz kalma Genişletilmiş diseksiyonları başarı oranını azaltabilir. Genişletilmiş veya ayrıca diseksiyonları başarı oranını azaltabilir CO 2 maruz kalma tekrarladı.
2. DiseksiyonDorsal Karın Duvarı
NOT: Arılar diseksiyon anda hayatta olması gerekir.
- forseps ve / veya mikrodiseksiyon makas, kaldırmak bacaklarını ve kanatlarını kullanarak karın diseksiyonu kolaylaştırmak için. Küçük bir beher veya disseksiyonlar arasındaki aletleri durulama amacıyla yakın damıtılmış su ile dolu benzer tutunuz.
- Forseps ile arı frenleyici olsa da, birinci ve ikinci tergites arasındaki dorsal karın duvarı boyunca yanal kesmek için mikrodiseksiyon makas kullanmak (Şekil 1).
Şekil 1: Arı karın Dorsal görünümü. kırmızı çizgi ile gösterildiği gibi sadece ilk kesi, birinci ve ikinci tergites arasında yapılmalıdır. Ölçek çubuğu = 1 mm. Onu tıklayınızE bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
- Hafifçe forseps ile ikinci tergite posterior kenarını sıkarken, stinger başlangıç kesi arı her tarafı boyunca uzunlamasına kesilmiş (bakınız Şekil 2). gastrointestinal sistem delinmesiyle önlemek için kesim dikkatli olun.
Şekil 2: Arı karın Yanal görünümü. kırmızı çizgi ile gösterilen şekilde, ikinci ve üçüncü kesikler, karın her iki tarafı boyunca yapılmalıdır. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- ince forseps ikinci bir set için makas değişimi ve dikkatle geri kalanı o gelen dorsal karın duvarı ayırmak için onları kullanmakKarın f. Yavaşça stinger ve dorsal karın duvarında asılı kalır gastrointestinal sistemin herhangi bir kısmını çıkarmak. içindekiler dorsal geminin görselleştirme engel kat karın duvarı ve olduğu gibi, gut kırılması kaçının.
Şekil 3: dorsal geminin görünümü. Bağırsak ve ısırgan otu çıkarıldıktan sonra, dorsal damar disseke dorsal karın duvarı orta hat boyunca görülebilir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Dorsal damar görülebilecek şekilde kamera altında istenen yönde dorsal karın duvarı düzenleyin (bakınız Şekil 3). herhangi bir aşırı ab uzak trim için mikrodiseksiyon makas yararlanındorsal geminin görselleştirme engellemektedir dominal duvar. Düzgün yer alan zaman dorsal karın duvarının şekli sığ fincan veya kase benzer olmalıdır.
- dorsal damar arının sondaki karın segment içine uzatmak olmadığından, sırt geminin görselleştirme geliştirmek amacıyla son tergite kaldırın.
- ayarlanabilir bir birim mikropipet kullanarak, fizyolojik koşulları sürdürmek ve sürekli bir yayın sinyali sağlamak için bir izotonik çözelti 10 ul ile sırt damarı kapsamaktadır.
Not: önerilen çözüm çeyrek gücü Ringer çözeltisi (0.120 g / l kalsiyum klorür, 0.105 g / L potasyum klorür, 0.050 g / L sodyum bikarbonat ve 2.250 g / L sodyum klorid) sabit bir şekilde kolaylaştırılması için bulunmuştur edilmiştir, sürekli kalp atışı.
3. Gözlem ve Kalp Hızı modülasyonu
- istikrarlı, sürekli kalp atışı elde edilene kadar dorsal damar rahatsız oturmak için izin(Genellikle 300 saniye içinde).
NOT: Kalp atışı dorsal geminin ritmik kasılmalar olarak görüntülenmiştir. Başlangıçta, arı anestezi edildi, özellikle hiçbir kalp atışı orada görünebilir, ancak kalp genellikle birkaç dakika için izotonik çözelti içinde dinlendikten sonra dayak devam edecektir ve saatlerce dayak devam edebilir, bu çözelti içinde kalmış kalır sağladı. - dakika (BPM) başına atım sayısı bakımından kalp hızını ölçün.
- 60 saniye süresince gözlenen kasılma numarasını kaydedin. Bu süreci kolaylaştırmak için bir el taksitli sayacı ve bir zamanlayıcı kullanın.
- önce ve cardiomodulatory bileşik ile tedavi sonrasında gözlenen BPM'i kaydederek kalp hızındaki değişimi ölçer.
Not: zaman test edilen bileşiğe bağlı olarak değişebilir, kalp hızı üzerinde bir etkiye gözlemek için gerekli olsa da, kalp hızı değişiklikleri genellikle birkaç dakika içinde görülür.- hemen önce bazal kalp hızını belirleyinHerhangi bir test bileşiğinin eklenmesi.
NOT: Tedavi sonrası kalp hızı genellikle 90 ila 120 saniye sonra tespit edilebilir. - Dorsal damar yıkanmak için kullanılan aynı izotonik çözelti içinde eritilmesi suretiyle potansiyel cardiomodulators (ör octopamine) hazırlayın.
- Bir Mikropipet kullanarak dorsal kabı çevreleyen çözüm test bileşiklerinin ekleyin.
- hemen önce bazal kalp hızını belirleyinHerhangi bir test bileşiğinin eklenmesi.
- daha doğru ve daha yüksek verim için, her bir test konusunun bir video kaydı yapmak ve daha sonra daha sonra kalp atış hızını puan videoları kullanın.
NOT: Bu videoların neredeyse sürekli üretimi kolaylaştırmak amacıyla diseksiyonu sendeleyip tek araştırmacı sağlar. Video kaydederken, önerilen minimum uzunluk herhangi bir test bileşiği ile yaklaşık 240 saniye 60 saniye işareti eklenir ediliyor. Bu araştırmacı bazal kalp hızı ve daha sonra tedavi sonrası kalp hızı 120 saniye puanlama için başka 60 sn penceresi puanlama için 60 sn penceresi sahip olmasını sağlartedavi sonrası.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak test edilebilir, farmakolojik olarak aktif bileşiklerin bir çoğu, suda çözünür olmadığı için, test bileşikleri dorsal damar yıkanmak için kullanılan izotonik çözeltisi ile iletilecektir sağlayacak güvenilir bir çözücü olması gerekmektedir. Dimetil sülfoksit (DMSO), yaygın olarak hayvan 8 deneysel ilaçları ve diğer bileşiklerin sağlanması için bir araç olarak kullanılan bir çözücü olduğunu ve bal arısı kalp aktivitesi 9 pestisit etkisini inceleyen bu amaç için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Sonuç olarak, DMSO ilk cardiomodulatory aktivitesi için test edilmesi gereken dorsal kabına, test bileşiği verilmesi için potansiyel bir araç olarak seçildi. Bu protokol, parçalara dorsal kabı ilk çeyreğinde gücü Ringer çözeltisi 10 ul yıkandığı ve kalp atış hızı test bileşiklerini eklemeden önce belirlenir. Test bileşikleri are çeyrek gücü Ringer çözeltisi içinde çözülmüş DMSO 10 ul bilinen bir konsantrasyonda teslim edilmesini ve sonra dorsal kabı kalp hızı takip eden değişiklikler gözlenmiştir.
Herhangi bir bileşik test öncesinde, bir DMSO konsantrasyonu aralığı 0% DMSO ile dörtte gücü Ringer solüsyonu göre kalp hızı üzerinde herhangi bir etkisi için test edildi. DMSO% 0.2,% 2,% 10 çözülmüş ve% 0.1,% 1,% 5 ve% 10 arasında bir nihai konsantrasyon test etmek için çeyrek gücü Ringer çözeltisi içinde% 20 h / h ve sonra eşit hacimde ilave edildiğinde edildi çözüm zaten dorsal damar banyo. Dorsal damar yıkanmak için kullanılan ilk 10 ul istenen konsantrasyonda DMSO ilave olarak karşı her diseksiyon sabit kalp verir, çünkü bu yaklaşım kullanılmıştır. DMSO kalp atış hızı üzerinde olumsuz bir etkiye sahipse, bu etkinin başarısız bir diseksiyon ayırt olmayabilir. Kalp hızı öncesinde hemen değerlendirildiDMSO ekleme ve sonra tekrar 120 sn sonra. Şekil 4,% 5 ve% 10 DMSO önemli ölçüde kalp hızı azalmış,% 0.1 ve% 1 DMSO çözeltisi içinde dörtte gücü DMSO olmayan Ringer çözeltisi göre kalp atış hızı üzerinde önemli bir etkiye, sahip olduğunu gösteren, bu deneyin sonuçlarını gösterir.
Şekil 4: Arı kalp hızına DMSO Etkisi. Dakikada attığı ölçüldüğü gibi grafik, bazal kalp hızı yüzde değişimi göstermektedir. önemli ölçüde artırmak veya DMSO olmadan çeyrek gücü Ringer solüsyonu göre kalp atış hızını azaltmak yok, çeyrek gücü Ringer çözeltisi içinde% 0.1 veya% 1 DMSO v / v ile bal arısı dorsal geminin tedavisi. çözelti içinde% 5 ya da% 10 DMSO ile tedavi kalp hızında önemli bir azalmaya neden olmaktadır. olarak ifade edilen sonuçlar ortalama ± SEM (n = 10) olmuştur. * P <0.05 vs 0% DMSO kontrolü (Kruskal-Wallis Dunn çoklu karşılaştırmalar testi ile test). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu deney, ilgili olduğu için, cardiomodulatory bileşiklerle tedavi sonrası kalp hızı değişiklikleri gözlemlemek mümkün olmalıdır. Biyojenik amin octopamine omurgasız 10 bir nöromodülatörü olarak etki bilinmektedir ve her ikisi de meyve bir cardioaccelerant 11 ve bal arılarının 7 uçan olarak hareket ettiği gösterilmiştir. 100 nM, 10 uM ve 100 uM konsantrasyonlarda yukarıda tarif edildiği gibi octopamine (çeyrek gücü Ringer çözeltisi içinde% 1 DMSO) aracın karşı test edildi. Şekil 5, 10 uM ve octopamine 100 uM konsantrasyonlarda önemli ölçüde kalp hızını artırdığını ortaya koyan, bu deneyin sonuçlarını gösterir.
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Şekil 5: Arı kalp hızına octopamine Etkisi. Dakikada attığı ölçüldüğü gibi grafik, bazal kalp hızı yüzde değişimi göstermektedir. 100 nM octopamine ile bal arısı dorsal geminin tedavisi önemli ölçüde artırmak veya (çeyrek gücü Ringer çözeltisi içinde% 1 DMSO v / v) araca kalp hızı göreceli azaltamaz. 10 uM ve 100 uM octopamine ile uygulanan tedavi araca kalp hızı göre artmaktadır. olarak ifade edilen sonuçlar ortalama ± SEM (n = 10) olmuştur. * P <0.05 araç kontrolü vs (Dunn çoklu karşılaştırmalar testi ile Kruskal-Wallis testi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dino-Lite Edge digital USB microscope | Dino-Lite | AM4815ZT | Any digital microscope or similar setup will suffice |
| Microscope stand | Dino-Lite | RK-10 | Any stand appropriate for the digital microscope |
| Laptop or PC | Necessary for digital microscope | ||
| Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades) | World Precision Instruments | 14003 | Any similar scissors suitable for microdissection will suffice |
| Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair) | World Precision Instruments | 504482 | Any similar forceps suitable for microdissection will suffice |
| Ringers solution 1/4 strength tablets | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Dissecting tray | Any surface suitable for microdissection | ||
| Single channel 10 µl pipette | Any device capable of accurately delivering 10 µl volume | ||
| Pipette tips | |||
| Small beaker or container of water | Used to rinse instruments between subjects | ||
| Hand tally counter | Office Depot | 295033 | Any similar product will suffice |
| Timer | Office Depot | 644219 | Any similar product will suffice |
| Deionized water | Preparation of Ringers solution and rinsing instruments |
References
- Klowden, M. J. Circulatory Systems. Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 3rd, 365-413 (2013).
- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
- Wasserthal, L. T. Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements. J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).
- Wasserthal, L. T. Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects. Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).
- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
- Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees. Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).
- Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition. J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).
- Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
- Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz. Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).
- Roeder, T.
- Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).
