Intracarotid Cancer Cell Injection å produsere mus modeller av hjernemetastaser

Summary

Hjernemetastaser har blitt et presserende udekket medisinsk behov som sin forekomsten har økt mens behandlingsalternativene har vært palliativ. Opprette eksperimentelle dyremodeller av hjernemetastaser via intracarotid arteriell injeksjon av kreftceller forenkler mekanistiske studier av sykdommen biologi og evaluering av nye intervensjons regimer.

Abstract

Metastaser, spredning og vekst av ondartede celler i sekundære områder innenfor en pasientens kropp, utgjør> 90% av kreftrelatert dødelighet. Nylig har imponerende fremskritt i nye behandlingsformer dramatisk forlenget overlevelse og økt livskvalitet for mange kreftpasienter. Dessverre er forekomsten av hjernemetastatisk tilbakefall raskt stigende, og alle aktuelle behandlingsformer er bare palliativ. Derfor er gode eksperimentelle dyremodeller sterkt behov for å legge til rette for grundige studier av sykdommen biologi og for å vurdere nye terapeutiske regimer for preklinisk evaluering. Men den standard in vivo-metastase-analyse via haleveneinjeksjon av kreftceller produserer hovedsakelig lungemetastatiske lesjoner; dyrene vanligvis bukke til lungetumorbyrde før noen meningsfull utvekst av hjernemetastaser. Intrakardial injeksjon av tumorceller produserer metastaselesjoner til flere organ områder, inkludert hjernen; imidlertid variabiheten av tumorvekst produsert med denne modellen er stor, dempe sin nytteverdi i å vurdere terapeutisk effekt. For å generere pålitelige og konsistente dyremodeller for hjernemetastaser studie, her beskriver vi en prosedyre for å produsere eksperimentell hjernemetastaser i huset mus (Mus musculus) via intracarotid injeksjon av tumorceller. Denne tilnærmingen gjør det mulig å produsere store antall hjernemetastaser bærende mus med liknende vekst og dødelighet egenskaper, og dermed tilrettelegge for forskningsinnsatsen for å studere grunnleggende biologiske mekanismer og for å vurdere nye terapeutiske midler.

Introduction

Metastasen av kreft i det sentrale nervesystem (CNS) er en ødeleggende sykdom, og kan innebære enten hjernen parenchyma eller leptomeninges ( "hjernemetastaser" refererer til både i denne artikkelen). Det er den dominerende intrakranielle malignitet, outnumbering primære hjernesvulst etter> 10: 1 ^{1, 2.} Lungekreft, brystkreft, og melanom er de tre store neoplastiske sykdommer som gir høy forekomst av hjernemetastaser ^{tre, fire.} I de senere årene har imponerende fremskritt i romanen kreftbehandling dramatisk forlenget overlevelse og økt livskvalitet for mange kreftpasienter. Men ved gjentakelse, er forekomsten av hjernemetastaser stiger raskt. For eksempel har den anti-HER2-antistoff trastuzumab (Herceptin) viste signifikant klinisk effekt hos pasienter med HER2 + brystkreft; likevel en urovekkende trend har dukket opphos disse pasientene: inntil 1/3 av dem som ekstrakraniell systemisk sykdom i utgangspunktet dratt nytte av trastuzumab behandling senere utvikle hjernemetastaser ^{5, 6, 7.} Dessverre, pasienter med hjernemetastaser er ildfaste til nesten alle nåværende behandlinger, vanligvis opplever en traumatisk forverring av livskvalitet, og deres ett-års overlevelse etter diagnose er bare ~ 20% ^8. Eksisterende behandling for hjernemetastaser (inkludert steroider, kranie strålebehandling og kirurgisk fjerning av selekterte pasienter) er bare smertestillende ikke kurativ ^9. Derfor er hjernemetastaser fremstår som den neste imponerende utfordring i denne epoken av nye kreftbehandlingen. For å løse udekkede utfordringen pasienter møter hver dag i klinikken, må vi raskt å bedre forstå den underliggende mekanismen av hjernemetastaser og bruke denne kunnskapen til å utvikle nye behandlingsformer.

<pclass = "jove_content"> Vellykket kolonisering av hjernen ved metastatiske kreftceller krever utførelse av en rekke funksjoner formidlet av intrikate samspill av flere biologiske spillere, som bypass av blod-hjernebarrieren (BBB) ​​og unnslippe fra hjernens indre immun-forsvarsmekanismer ^10, hvorav ingen er rekapitulert i en ex vivo eller in vitro system. Derfor, riktig og trofast in vivo-modeller er avgjørende for studier av hjernemetastaser. En konvensjonell in vivo metastaser analysen introduserer kreftceller via halevenen injeksjon, som fører de fleste celler til å sette seg fast i lungene. Hjernemetastatiske lesjoner er sjelden produsert i disse modellene før dyret død forårsaket av tumorbyrde i lungene ^11. Direkte intra injeksjon av kreftceller produserer konsekvent svulst utvekst i CNS og er mye brukt i studier av primære hjernesvulst. Men such injeksjon kompromitterer BBB og forårsaker traumatisk skade på injeksjonsstedet, begge viktige punkter av interesse med hensyn til fysiologiske betydningen av denne modellen. En annen hyppig brukt kreftcelle innføring rute, intrakardiell injeksjon, er enkel å administrere og produserer eksperimentell metastaser til CNS. Imidlertid er samtidige metastaser til andre enn CNS organ områder alltid produsert og kan føre til dyr dødelighet ^11; Derfor, den høye grad av variasjon av denne modellen gjør det upassende for kvantitativ evaluering av biologiske mekanismer eller terapeutiske midler med et begrenset antall dyr.

Her beskriver vi fremgangsmåtene for å fremstille forsøkshjernemetastaser via injeksjons av kreftceller i arteria carotis communis. Vi har brukt denne tilnærmingen til å dissekere bidrag individuelle gener 'til metastatisk kaskade av hjernemetastaser og for å evaluere effekten av terapeutisk intervensjons ^{12, 13.} Hovedfordelene ved denne tilnærmingen er den høye grad av reproduserbarhet og lav grad av variasjon; Den store ulempen er raffinement og dyktighet som kreves for å utføre mikrokirurgi.

Protocol

Etikk uttalelse: Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av The University of Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Forbered kreftceller til injeksjon Seed kreftcellene en eller to dager før injeksjon. Bruk DMEM / F12 medium supplert med 10% FBS, med mindre en spesialitet medium er angitt i litteraturen for en spesiell cellelinje. På dagen for kirurgisk operasjon, høste cellene når de nå 70 – 80% konfluens ved først å vaske med serumfritt med…

Representative Results

Det er to punkter hvor kvaliteten av injeksjonen kan evalueres. Den første sjansen er av operatøren observasjon av skiftende blodkar farger under injeksjon. Lekkasje fra fattige injeksjoner kan lett observeres under dissekere mikroskop. Den jevne og sikker plassering av musen legemet (figur 1 A) og dens karotidarterie (figur 1B) på bærebomullsdott er kritiske faktorer for jevn og vellykket injeksjon i halspulsåren. Det andre punktet å vurdere injek…

Discussion

De mest kritiske trinn for vellykket hals arteriell injeksjon av kreftceller er: 1) dyp anestesi av mus i forberedelse for kirurgisk operasjon; 2) stabil plassering av halspulsåren på toppen av bomull støtte; 3) stramt ligering av arteria carotis etter vellykket injeksjon.

Deep anestesi på ~ 30 min er vanligvis nødvendig for jevn kirurgisk ytelse under dissekere mikroskop. Vi bruker kommersielt klar til bruk ketamin / xylazin cocktail for mus anestesi. For å unngå potensiell overdoser…

Materials

Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution	Sigma-Aldrich	K113
Routine Stereomicroscope Leica M50	Leica	M50	The microscope is modular and highly configurable to fit particular space requirements.
Surgical disposable scapel	Integra Miltex	4-410	to make skin incisions
Tissue Forceps – 1×2 Teeth	Fine Science Tools	11021-12	to bluntly dissect mucles
Dumont #5 – Mirror Finish Forceps	Fine Science Tools	11252-23	to separate and prepare the carotid artery for injection
Spring Scissors	Fine Science Tools	15025-10	to cut sutures
EZ Clip Kit	Stoelting	59020	for wound cloure
BD Insulin Syringe	Becton Dickinson	328438	for cell injection
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	PerkinElmer	124262