This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Denna detaljerade protokoll beskriver genomförandet av bildstyrd, laserbaserade hydrogel nedbrytning för tillverkning av vaskulära härrörande mikroflödes nätverk inbäddade i PEGDA hydrogeler. Här beskriver vi skapandet av virtuella masker som möjliggör bildstyrd laserstyrning; fotopolymerisation av en micromolded PEGDA hydrogel, som lämpar sig för mikroflödes nätverk tillverkning och tryckhöjd driven strömning; installationen och användning av en kommersiellt tillgänglig laserskanning konfokalmikroskop parat med en femtosecond pulsad Ti: S laser för att framkalla hydrogel nedbrytning; och avbildning av fabricerade mikroflödes nätverk med fluorescerande ämne och konfokalmikroskopi. En stor del av protokollet är inriktad på korrekt installation och genomförande av mikroskop programvara och mikroskop makro, eftersom dessa är viktiga steg i att använda en kommersiell mikroskop för mikroflödestillverkningsändamål som innehåller ett antal invecklade. Den bildstyrd del av denna technique medger för genomförandet av 3D-bildstaplar eller användargenererade 3D-modeller, vilket gör det möjligt för kreativ mikrofluidisk design och för tillverkning av komplexa mikroflödessystem av praktiskt taget vilken som helst konfiguration. Med en förväntad inverkan på vävnadsteknik, kan de metoder som beskrivs i detta protokoll underlätta tillverkning av avancerade biomimetiska microtissue konstruktioner för orga- och mänskliga-on-a-chip-enheter. Genom att imitera komplex arkitektur, slingrighet, storlek och täthet in vivo kärl kan väsentliga biologiska transportprocesser replikeras i dessa konstruktioner, vilket leder till mer exakt in vitro modellering av farmakokinetik och sjukdoms drog.
Kärlsystemet, som består av både lymfatiska och cardiovasculature, blanketter mycket täta nätverk som är nödvändiga för transport av näringsämnen och syre och för avlägsnande av metaboliska avfall. Följaktligen celler som bor i vaskulariserade vävnader är aldrig mer än 50-100 um bort från ett fartyg 1. Förmågan att reproducera in vivo kärl arkitektur in vitro är avgörande för att noggrant modellera in vivo transportprocesser med hjälp av manipulerade konstruktioner. Med en ny enhet för att utveckla organ-on-a-chip anordningar 2 för hög genomströmning drog screening 3,4 och sjukdom modellering 5,6, metoder skapa mikroflödes nätverk som rekapitulera in vivo-liknande transport i syntetiska eller naturliga hydrogeler ritar stort intresse. För att öka biomimicry av microtissues används i dessa enheter, har vi utvecklat en bildstyrd, laserbaserad metod hydrogel nedbrytning som utnyttjar tredimensionellal (3D) bild högar av infödda kärl som mallar för att generera kärl härrörande mikroflödes nätverk inbäddade i PEGDA hydrogeler 7. Detta protokoll beskriver användningen av en kommersiellt tillgänglig laserskanning konfokalmikroskop utrustad med en femtosecond pulsad laser för att tillverka kärl härrörande, biomimetiska mikroflödes nätverk i PEGDA hydrogeler via bildstyrd, laserbaserad nedbrytning.
Nuvarande metoder för att fluidisera hydrogeler inkluderar induktion av vaskulär 8-10 eller angiogena 10-12 endotelceller själv monterings- och mikrotillverkningstekniker för att skapa fördefinierade kanaler för endotelisering 13-16. Även om självmonterade nätverk sammanfatta densiteten och komplex arkitektur av mikrovaskulaturen, de är ofta mer genomsläpplig än in vivo nätverk 11,17,18, vilket kan vara problematiskt vid modellering transport för drogscreening applikationer. Själv monterade nätverk består av physiologtiskt relevant, kapillär stora fartyg, men de kan vara svåra att integrera med bulkvätskeflöde på grund av begränsningar i att generera större arteriole stora fartyg. Eftersom det inte finns någon direkt kontroll över sammansättningen av dessa nätverk, kan den slutliga arkitekturen variera från prov till prov, vilket gör det svårt att upprepade gånger producera nätverk med samma vätskeflöde och transportegenskaper.
För att generera 3D, hydrogel-inbäddade mikroflödes nätverk med repeterbar geometri och väldefinierade arkitektur, har ett antal mikrotillverkningstekniker utvecklats, inklusive modulanordning 13, 3D-utskrifter av offermaterial 16, direktskriv montering 14, och rundstrålande utskrift 15. Tillämpa dessa metoder, mikroflödes arkitektur, och därför vätskeflöde och transportegenskaper, kan upprepade gånger tillverkas i många konstruktioner. En viktig begränsning av dessa tillvägagångssätt är emellertid oförmågan att skapa microfluidic nätverk med kapillära stora funktioner, 4 till 10 | im 19. De flesta mikrotillverkningstekniker är ofta begränsade till funktioner som sträcker sig från 150 till 650 mikrometer i diameter 13,16. Vissa befintliga tekniker kan generera hierarkiska nät med kanaler inom en rad bred diameter, 10-300 um för direktskrivenheten 14, och 18 till 600 pm för rundstrålande utskrift 15, men de är begränsade i sin förmåga att generera täta nätverk eller att producera flera mikroflödes nätverk i närheten inom en enda konstruktion 7.
För att övervinna några av dessa begränsningar, har vi utvecklat en bildstyrd, laserbaserad teknik hydrogel nedbrytning som möjliggör repeterbar tillverkning av biomimetisk, hierarkiska mikroflödes nätverk som rekapitulera arkitektur in vivo mikrocirkulation. För att göra detta, en 790 nm, 140 femtosecond (fs) pulsad laser som arbetar vid 80 MHz är raster-avsöks in önskad 3D platser inom en hydrogel, enligt definitionen i bilder av in vivo kärl. Vi spekulerar att nedbrytningsprocessen fungerar via laserinducerad optisk uppdelning av vatten, den resulterande plasmabildningen, den efterföljande snabba termoelastisk expansion av vatten, och den lokala nedbrytning av hydrogelen som vattnet expanderar 20. Denna mekanism varierar något från laserbaserad nedbrytning av proteinbaserade hydrogeler 21-24. Till skillnad PEGDA, som har en låg multifoton tvärsnitt, proteiner har ofta en stor multifoton tvärsnitt och därför bryts ned via en multifoton absorption-inducerad kemisk brott 23. För att generera bildstyrd mikroflödes nätverk, är laser slutare styrs av bild härrör virtuella masker, som består av en mosaik av regioner av intresse 9 som definierar mikroflödes arkitektur. Med hjälp av denna metod, har vi visat förmåga att tillverka 3D vaskulär härrörande biomimetisk mikrofluidic nätverk, som sammanfatta den täta och slingrande arkitekturen i in vivo kärlsystem, i syfte att styra lokalt porositeten hos hydrogeler genom att förändra den mängd energi som avges under nedbrytning. Vi har också kunnat generera två oberoende mikroflödes nätverk som flätas samman i omedelbar närhet (15 pm) men aldrig direkt ansluta 7. Vi har också visat förmåga att endothelialize laser nedbrutna mikrokanaler genom inlägget funktionalise nedbrytning med integrinet ligering peptidsekvensen, Arginine-Glycine-Aspartic Acid-serin (RGDS), för att främja endotelcellsadhesion och lumenbildning 7.
Med detta protokoll är generering av komplexa mikroflödes nätverk i PEGDA hydrogeler möjliggörs via bildstyrd, laserbaserad nedbrytning med användning av en kommersiellt tillgänglig mikroskop tillgänglig på många universitetsområden. Som nedbrytningsprocessen styrs av digitala, virtuella masker, denna Fabricaringsteknik är mottaglig för den kreativa utformningen av mikroflödes nätverk, vilket gör att dess användning i en mängd olika tillämpningar. Vi räknar med att den metod som beskrivs här kommer att vara mest fördelaktiga i att utforma biomimetiska organismer och mänskliga-on-a-chip anordningar som kan replikera biologiska transportprocesser viktiga i modellering läkemedelstransport 2. Denna tillverkningsteknik kan också vara av intresse för generering av modeller in vitro sjukdom, inklusive cancer metastaser 5,6 och blod-hjärnbarriären modeller 25. Som laserbaserade hydrogel nedbrytning har tidigare använts för att skapa spår för ledning av neuronal utväxt 21-23, kunde bildstyrd förlängning av denna teknik vara användbar i avancerade vävnadsteknik strategier för att positionera celler i användardefinierade 3D rumsliga arrangemang.
Kritisk i åsidosätta standardfunktioner för mikroskop programvara för att möjliggöra användningen av virtuella masker för bildstyrd, laserbaserad nedbrytning, måste mikroskopet makro ställas in och manipuleras noggrant. Hur gränssnitt mikroskop programvara med mikroskop makro ibland kan vara bakvända och mycket möda har investerats i att bestämma de optimala inställningarna i båda programmen för att utveckla denna metod. En allmän förståelse för grundläggande laserskanning konfokalmikroskop användning rekommenderas, särskilt med "Stage" och "Focus" fönster för att hitta och korrekt placering av hydrogel i x, y och z dimensioner innan laserbaserad nedbrytning. Dessutom är tillverkningen av en inloppskanal kritisk för protokollet; suspenderade fluorescerande arter måste kunna ange mikroflödessystem för framgångsrik avbildning och nätverkskarakterisering. Det är viktigt att notera att detta protokoll gäller en specifik laser-skanning konfokalmikroskop konfigureras med en specifik femtosecond pulsad laser, kör specifika versioner av mikroskop programvara och mikroskopet makrot (se detaljer i den förteckning över specifika material / utrustning). Vi har upptäckt att nyare versioner av mikroskop makro saknar nödvändig kontroll och funktionalitet som krävs för bildstyrd laserstyrning. Medan andra mikroskop plattformar och pulsade laserkällor kan användas, detta protokoll gäller specifikt för detta system och kommer att behöva ändras i enlighet med plattformen, laserkällan, och programvara genomförs. De underliggande principerna i hela detta protokoll gäller dock fortfarande.
En potentiell modifiering av detta protokoll innebär att förändra hydrogelkompositionen. Här, vi utnyttjade 5 vikt%, 3,4 kDa PEGDA hydrogeler, men laserbaserade nedbrytning (för ändamål bortsett från mikroflödes nätverk generationen) har genomförts för att försämra både syntetiska och naturliga hydrogeler, inklusive PEGylerat fibrinogen 21,22 hydrogeler silkesprotein 23, och kollagen 24. Justering av lasereffekten, skanningshastighet, avståndet mellan Z-skivor, och antalet repetitioner kommer att hjälpa att bestämma de optimala parametrar för att tillverka mikroflödes nätverk i andra hydrogel formuleringar.
En strömbegränsning av tekniken är den totala volymen av hydrogel som kan brytas ned i en genomförbar tid. Att skapa öppna hålrum eller mikroflödes funktioner i hydrogel, laser uppehållstid måste vara vid eller över 8,96 ps / pixel (eller en laserskanningshastighet på 0,021 pm / iS) när man använder en laser fluens av 37,7 nJ / um 2. Med dessa inställningar, tar det 1,4 timmar att bryta ned fartyg inom en 0,014 mm 3 volym (som visas i figur 1). Med användning av en laser uppehållstid av 4,48 | is / pixel eller lägre, är den energi som levereras inte tillräckligt för full nedbrytning av hydrogelen formuleringen som användes här. Implementera en annan hydrogelsammansättning skulle kunna övervinna denna begränsning. Användningen av fotolabila geler som innehåller ljuskänsliga komponenter 34-36 eller hydrogeler som har stora multifoton tvärsnitt 21-24 är bra alternativ som skulle göra det möjligt att använda mindre energi och skulle resultera i snabbare nedbrytning. När det gäller dimensionsbegränsningar, har funktioner tillverkats upp till 1,5 mm djupt i hydrogelen 7. Djupet uppnås är en funktion av arbetsavståndet av målet och kan ökas med hjälp av ultralångdistans mål arbets optimerade för in vivo imaging. Den minsta uppmätta kanalen 7 skapas med hjälp av en 20X (NA1.0) nedsänkning i vatten mål hade en bredd av 3,3 pm och djup av 8,9 pm, vilket är i nivå med storleken av de minsta kanalerna genereras i figur 1. Medan andra labb har använt lägre NA mål 21,23,24, räknar vi med att mikroflödes nätverk med mindre funktioner kan genereras med höger NA mål på bekostnad av en minskad arbetsavstånd. Men i sista hand är upplösningen av tekniken en funktion av punktspridningsfunktionen hos den fokuserade laserstrålen, varvid laseravsökningsegenskaper, mängden energi som utvecklas av lasern, och de laser absorptionsegenskaperna hos materialet försämras.
Vidare laser egenskaper (hastighet, fluens, avståndet mellan virtuella masker, och antalet repetitioner) måste optimeras baserat på hydrogel egenskaper (tvärbindningsdensitet, makromer / monomer molekylvikt, viktprocent, och typ av hydrogel: proteinbaserade kontra syntetisk ), eftersom dessa kommer att till sin natur förändra interaktioner med lasern och därmed det slutliga utfallet av processen. Som den energi som levereras är också påverkas av objektiv som används, är ytterligare optimering krävs när du växlar mellan målen. När det gäller kostnaderna, krävs tillgång till ett mikroskop med en pulsad laser, och medan många olika objektivttanter kan användas, de med ett högt NA och långa arbetsavstånd (för in vivo imaging) kan vara dyra.
Utöver det protokoll som beskrivs här, kan mikroflödes nätverk som genereras med den här tekniken också funktionaliseras med cell lim peptider efter kanaltillverkning att inducera endotelcellsadhesion och lumen bildning 7. Dessutom kan inkorporering av cell nedbrytbart peptidsekvenser i bulkmaterialet 9 före kanalisera nedbrytning möjliggöra för studier av cellmigration in i och genom hydrogelen. För kontinuerlig fluidisering av mikroflödes nätverk inom hydrogelen, kan hydrogeler fotopolymeriseras i större fluidanordningar eller höljen, såsom visas i figurerna 2 och 3 7.
Genereringen av vaskulära nätverk via vaskulär eller angiogen självorganisering 8-12 ger en enkel metod för att inducera vascularization hela en relativt stor hydrogel volym. Även om detta tillvägagångssätt resulterar i perfusable fluidic nätverk, är det svårt att direkt styra storleken, tortuosity, densitet och totala nätverksarkitekturen. På grund av denna begränsning, kan flödesprofil och skjuvhastigheter i kärlsystemet skilja mellan experimenten. Alternativt, mikrotillverkningstekniker 13-16 möjliggör direkt kontroll över nätverksarkitektur, men begränsas ofta av deras oförmåga att generera små, kapillära stora kanaler eller tillverkning av täta nätverk som efterliknar in vivo kärl arkitektur. Medan laserbaserade hydrogel teknik nedbrytning beskrivs här har nyligen repurposed för mikroflödes generation, samtidigt övervinner det både den arkitektoniska kontroll och storleksbaserade begränsningar av befintliga metoder mikrotillverknings genom att möjliggöra skapandet av 3D biomimetiska mikroflödes nätverk som rekapitulera densiteten, slingrighet, storleksintervall, och allmänt architecture av in vivo kärl. Dessutom kan flera fluid nätverk genereras i en enda hydrogel, vilket gör att studier av transport mellan nätverk 7. För vävnadstekniska program som strävar efter att närmare replikera in vivo transportprocesser in vitro, de mycket löst hydrogel inbäddade mikroflödes nätverk som beskrivs här är väl lämpade. Vi räknar med att detta protokoll kommer att användas för att utveckla vävnadskonstruktioner som bättre efterliknar in vivo transport för användning som drogtestutrustning och in vitro sjukdomsmodeller.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |