Сила простоты: Эмбрионы морского ежа, как<em> В Vivo</em> Развивающие модели для изучения сложных Cell-к-Cell Signaling сетевых взаимодействий

Summary

Это видео статье подробно простой в методологии естественных условиях , которые могут быть использованы для систематического и эффективного характеризуют компоненты сложных сигнальных путей и регуляторных сетей во многих беспозвоночных эмбрионов.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

Генные регуляторные сети (GRNs) и пути передачи сигналов устанавливают пространственную и временную экспрессию генов во время эмбрионального развития, которые используются для создания плана взрослого животного тела. Cell-к-клетке пути передачи сигналов являются важными компонентами этих регуляторных сетей, предоставляя средства, с помощью которых клетки взаимодействуют. Эти клеточные взаимодействия установить и уточнить экспрессию регуляторных генов и дифференцировки в и среди различных территорий во время эмбриогенеза ^{1, 2.} Взаимодействие между секретируемых внеклеточных модуляторов (лиганды, антагонисты), рецепторов и ко-рецепторов контролируют деятельность путей передачи сигнала. Ассортимент внутриклеточных молекул трансдуцирует эти входы, приводящие к изменению экспрессии генов, деление, и / или формы клетки. В то время как многие из ключевых молекул, используемых при внеклеточных и внутриклеточных уровней в основных путей являютсяИзвестно, что это неполное знание обусловлено в значительной степени сложности отдельных сигнальных путей. Кроме того, различные сигнальные пути часто взаимодействуют друг с другом либо положительно , либо отрицательно на внеклеточный, внутриклеточный и транскрипционные уровни ^{3, 4, 5, 6.} Важно отметить, что основные компоненты путей передачи сигнала являются высоко консервативными у всех видов многоклеточных, и, что примечательно, большинство основных сигнальных путей , часто выполняют сходные функции развития у многих видов при сравнении организмов от тесно связанной с фил , в частности , ^{7, 8, 9, 10, 11.}

Изучение сигнализации в процессе развития является сложной задачей в любом организме, и тамнесколько серьезных проблем в изучении сигнальных путей в большинстве моделей вторичноротые (позвоночных, беспозвоночных хордовых, полухордовых и иглокожих): 1) У позвоночных существует большое число возможных лиганда и рецептора / со-модуляторов взаимодействий, внутриклеточные молекулы трансдукции, а также потенциальные взаимодействия между различными сигнальными путями из – за сложности генома ^{12, 13, 14;} 2) Комплекс морфологии и морфогенетические движения у позвоночных часто делают его более трудным для интерпретации функциональных взаимодействий внутри и среди путей передачи сигнала; 3) Анализы в большинстве не-иглокожих видов беспозвоночных вторичноротые модели ограничены короткими окнами беременности, за исключением некоторых видов оболочников ^{15, 16.}

эмбрионе морского ежа имеет несколько из указанных выше ограничений , и предлагает множество уникальных качеств для выполнения детального анализа путей передачи сигнала в естественных условиях. К ним относятся следующие: 1) Относительная простота морского ежа генома значительно уменьшает количество возможных лигандов, рецепторов / корецептором и внутриклеточной молекулы трансдукции взаимодействиях ^17; 2) GRNs контролирующие спецификации и кучность стрельбы из зародышевых листков и основных эмбриональных осей хорошо установлены в морских ежей эмбрионов, помогая в понимании нормативного контекста клеток / территории приема сигналов ^{18, 19;} 3) Многие пути передачи сигналов могут быть изучены между ранними спайности и гаструлы , когда эмбрионы состоят из одного многослойного эпителия, морфология которых легче анализировать; 4) Молекулы связаныd сигнальных путей в морских ежей легко манипулировать; 5) Многие морские ежи Gravid от 10 до 11 месяцев в год (например , Strongylocentrotus purpuratus и Lytechinus variegatus).

Здесь мы представляем метод системно и эффективно характеризуют компоненты сигнальных путей, которые определяют и модели территорий, в морских ежей эмбрионов, чтобы проиллюстрировать преимущества, которые несколько беспозвоночные модельные системы предлагают в изучении сложных молекулярных механизмов.

Protocol

1. Стратегия Высокая пропускная способность Morpholino Design Идентифицировать ген (ы) интерес (например , ген подход кандидатов, цис-регуляторными анализ, Секвенирование РНК и / или протеомические дифференциальные экраны). Используйте геномную, транскриптомики и данные экспре?…

Representative Results

В эмбрионе морского ежа мы показали , что 3 -х различных Wnt сигнальных ветвей (Wnt / β-катенин, Wnt / JNK и Wnt / PKC) 4, 25 взаимодействуют с образованием Wnt сигнальной сети , которая управляет передне-задней (AP) кучность. Одним из наиболее важных следст?…

Discussion

Методология, представленная здесь приведен пример, который иллюстрирует силу использования эмбрионов с меньшим количеством геномной и морфологической сложности, чем позвоночных животных, чтобы понять сигнальные пути трансдукции и GRNs, регулирующие фундаментальные механизмы развити…

Materials

Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G