Protokollen nedenfor beskriver metodologien for: microplastics prøvetaking på havoverflaten, separasjon av mikroplast og kjemisk identifisering av partikler. Denne protokollen er i tråd med anbefalingene for microplastics overvåking utgitt av MSFD Teknisk undergruppe på marin forsøpling.
Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an »A frame« attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.
Microplastic pollution in the sea represents a growing concern to contemporary society, due to the constant increase in plastic production and its subsequent disposal and accumulation in the marine environment1. Even if plastic macro litter would no longer enter the seas, microplastic pollution would continue to grow due to fragmentation of already existing plastic litter in the sea2. The majority of microplastic pollution studies were carried out in marine and fresh water ecosystems and mainly addressed sea surface pollution3.
The term microplastic refers to plastic particles smaller than 5 mm in size4. This term describes a heterogeneous mixture of particles, which can differ in size (from a few microns to several millimeters), color and shape (from very different shapes of fragments to long fibers). Microplastic particles can be of a primary or secondary origin5. Microplastic of primary origin is manufactured as small particles used in the cosmetics industry (pilling crème etc.) or chemical industry as precursor for other plastic products (e.g. plastic pellets used in plastic industry). Microplastic of secondary origin arise via the degradation of larger plastic pieces in the environment due to physical and chemical processes, induced by light, heat, oxygen, water and organisms6. In 2015, four types of microplastic sources were defined: larger plastic litter, cleaning products, medicines and textiles6. The main source (80 %) of larger plastic litter is assumed to be land based7. Microplastic from cosmetic products, medicines and textile enters water ecosystems through sewage and storm waters6. Microplastic particles most frequently found in water ecosystems are fragments from larger plastic litter and textile fibers8.
Microplastics have several negative effects on the environment. Their small size allows them to enter the food web through ingestion by marine organisms9, 10. Ingested particles can cause physical damage or block the digestive system of animals11. Particles can also be carriers of persistent organic pollutants (POPs). Their hydrophobic surface and favorable ratio of large surface area to small volume, enables POPs to adsorb onto the microplastics12. In the environment or digestive systems of animals who ingest them, POPs and other plastic additives can be leached from microplastic particles13.
Previous studies reported the ubiquitous presence of microplastics in the marine environment3, from the water column to the bottom sediments. The threat of microplastic pollution was already identified by the Marine Strategy Framework Directive in the EU and, consequently, mandatory monitoring of microplastics was advised14. Accordingly, the EU Technical Subgroup on Marine Litter (TSG-ML) prepared recommendations for monitoring of microplastics in the European seas15. Thus, the video guidelines for microplastics sampling are of high importance, as they support comparative monitoring and a coherent management process all over the world.
This protocol was developed within the DeFishGear project for the first monitoring of microplastic pollution in the Adriatic Sea. Recommendations from the document “Guidance on Monitoring of Marine Litter in European Seas” by TSG-ML15 were taken into account. This protocol describes the methodology for microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastics from the samples, and chemical analysis of microplastic particles to confirm that particles are from plastic material and to identify the type of plastic. Sampling was done by the use of a manta net, which is the most suitable equipment for sampling in calm waters16. Separation of microplastics from the samples was carried out by visual identification using a stereomicroscope. Isolated particles were later chemically identified using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and micro FTIR spectroscopy.
Microplastics sampling på havoverflaten ved manta net er en mye brukt metode for prøvetaking av microplastics på havoverflaten, men hittil har det ikke vært noen enhetlig metodikk. Et stort volum av vann kan filtreres gjennom manta nettet, og dermed muligheten for å innestenge et relevant antall microplastics er høy, og resultatene er oppfattet å være pålitelig. Sammenlignbare resultater mellom ulike prøver er sikret av normalisering. I vårt tilfelle ble konsentrasjonene relatert til prøveområdet ved å multiplisere trål avstand av den horisontale bredde av nettet åpningen. Et annet alternativ er å benytte en strømningsmåler, settes til nettet åpningen. Anvendelsen av en strømningsmåler er mulig siden den manta net med sine sidevinger er meget stabil på havoverflaten, og dermed hopper på bølgene er minimal. En strømningsmåler registrerer volum av filtrert vann, og således gjør det mulig for normalisering av resultater per volum av samplet vann 16.
<p class="jove_content"> De mest brukte djevel garn ha rundt 300 mikrometer maskevidde og er 3 til 4,5 m lang. Disse dimensjonene var optimalisert for å unngå tilstopping av nettet og å tillate sampling et volum vann så stor som mulig. Trålhastighet anbefales å være mellom 2-3 knop, men det er avhengig av bølgehøyde, vindstyrke og havstrømmer. Det er meget viktig at manta nettet er under tilsyn hele tiden under prøvetaking, og hvis det begynner å hoppe, må trålhastigheten bli redusert. Trål tid anbefales å være rundt 30 minutter, men er avhengig av seston konsentrasjoner. Det kan skje at seston noen ganger tresko manta nettet. I dette tilfellet trålingen må stanses umiddelbart, ellers mikroplastpartiklene kan gå tapt, og nettet kan bli skadet. Manta net er det som oftest fast fra siden av fartøyet. Dette er også den mest hensiktsmessige alternativet, mens manta nettet er sikkert ute av kjølvannet sonen. I noen undersøkelser manta netto ble løst fra akterenden av skipet17, 18, men i så fall må du være sikker på at nettet er ute av kjølvannet sonen. Avstanden, på hvilken trålen er satt for prøvetaking, må bestemmes individuelt, ettersom sonen av turbulens forårsaket av fartøyet avviker fra størrelsen på fartøyet og fra hastigheten av båten 19, 20.Separering av mikropartikler fra havoverflaten prøvene gjøres oftest bare ved visuell identifikasjon 21. Partikler større enn 1 mm kan lett identifiseres med det blotte øye, mens partikler mindre enn 1 mm krever bruk av et stereomikroskop. For å redusere muligheten for forvirrende de ikke-plast partikler med plast seg, ved hjelp av polarisering lys på stereomicroscopes anbefales. Muligheten for feilidentifisering av plast partikler blir høyere med mindre partikler. Således partikler> 0,5 mm bare kan identifiseres visuelt 21, ved anvendelse av stereomikroskopet. For partikler som er mindre enn 0,5 mmen ekstra, mer nøyaktig metode er nødvendig for eksempel mikro ATR-FTIR spektroskopi 21.
Under prosessen med microplastics atskillelse fra prøven muligheten for kontaminering av prøver med de luftbårne filamenter er meget høy. Av denne grunn, kontrollere petriskåler stående åpen på arbeidsbordet er sterkt anbefalt for identifisering av potensielle forurensnings luftbårne partikler. Nemlig, kvaliteten på dataene avhenger sterkt av: 1) presisjonen til personen som arbeider med prøven, 2) kvaliteten og forstørrelse av stereomikroskopet, og 3) mengden av organisk stoff i prøven 16. Etter visuell identifisering er det sterkt anbefalt å analysere de sorterte partikler med en av de tilgjengelige teknikker for kjemisk identifikasjon av materialet 8.
Det finnes flere metoder for identifikasjon polymer, hvorav de FTIR-spektroskopi og Raman-spektroskopi er de mest frekvently brukt 22. FTIR og Raman-spektroskopi er komplementære teknikker og deres nøyaktighet er lik. I protokollen, FTIR og mikro FTIR-spektroskopi med "attenuated total reflektans" (ATR) presentert. De er enkle å bruke og de muliggjør raske og nøyaktige resultater. Plastpolymerer besitter meget spesifikt infrarødt (IR) spektra med forskjellige båndmønstre, og dermed gjør IR-spektroskopi en optimal teknikk for identifisering av microplastics 21. Energien av IR-stråling eksiterer en spesifikk molekyl vibrasjon ved interaksjon med en prøve, som muliggjør måling av den karakteristiske IR-spektra 22. FTIR spektroskopi kan også gi ytterligere informasjon om partikler som intensiteten av oksidasjon 23 og nivå av nedbrytning 24. Mens ATR-FTIR er egnet for kjemisk identifisering av større partikler (> 0,5 mm), kan mikro ATR-FTIR-spektroskopi gir informasjon om den kjemiske struktur av partikler & #60; 0,5 mm, fordi den kombinerer funksjonen av et mikroskop og et infrarødt spektrometer.
Før bruk av FTIR og mikro FTIR spektroskopi, mikropartiklene må på forhånd tørket, ettersom vann absorberer IR-stråling 22, og renset, i tilfelle de er dekket med biofilm og / eller andre organiske og uorganiske tilhengere, som kan innvirke på IR-spektra. De fleste ikke-invasiv måte å rense prøver er ved omrøring og spyling med friskt vann 25. Hvis dette ikke er tilstrekkelig, da bruk av 30% hydrogenperoksyd er anbefalt. Alle andre metoder kan ha negative effekter på mikropartikler (f.eks ultralyd kan videre bryte partikler, kan sterkt sure eller alkaliske løsninger skade flere plast polymerer, etc.), og derfor anbefales ikke bruk. Mer lovende er bruk av en sekvensiell enzymatisk fordøyelse som en plast vennlig rensetrinn. Rensing ved hjelp av ulike tekniske enzymer (f.eks lipase, etmylase, proteinase, kitinase, cellulase, proteinase-K) har blitt brukt til å redusere en biologisk matrise av plankton og dermed viste seg å være en verdifull teknikk for å minimere matrix gjenstander under FTIR spektroskopi målinger 22.
Separasjon av microplastics av visuell identifisering og kjemisk identifisering av utvalgte partikler er begge ekstremt tidkrevende prosesser. Dette arbeidet må gjøres med en nøyaktig og tålmodig person som har erfaring med stereomikroskoper, ikke bare i å gjenkjenne plast partikler, men også i å gjenkjenne biologisk materiale. Selv en erfaren person kan ikke diskriminere alle mulige mikropartikler utvetydig fra kitin eller diatomfragmentenes 22. Derfor feilhyppigheten av visuell sortering i området fra 20% 26 70% 21 og øker med avtagende partikkelstørrelse.
The authors have nothing to disclose.
Utviklingen av denne protokollen ble grunnlagt av IPA Adriatic Grenseoverskridende samarbeidsprogram 2007-2013, innenfor DeFishGear prosjektet (1 ° str / 00010).