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Genetics

通过多色荧光跨染色体畸变稳定的检测 doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

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所有的动物研究都严格按照该指南中的建议,美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用进行。动物方案经阿肯色大学医学科学机构的动物护理和使用委员会。新鲜空气和向标准啮齿动物食物和自由饮水15小时周期 - 所有动物在20±2℃,10在标准空调动物设施收纳。抵达后,小鼠隔离举行1周,并提供认证的啮齿动物食物。

1.Radiation曝光并中期细胞的体内逮捕

  1. 揭露联合国麻醉小鼠2戈瑞全身辐射照射室。在辐照过程中,在通风良好的固定室老鼠的地方,以确保他们不会自由移动,并获得一致的剂量。
  2. 注入100微升0.05%秋水仙素溶液(c溶解的钙和镁的PBS olchicine粉末)腹膜内使用连接用1mL一次性注射器将25g针。避免直接注射到任何器官。
  3. 留在笼子里动物的骨髓细胞收获前2小时。观察疼痛或痛苦的任何迹象的动物。

2.骨髓细胞采收和密度梯度离心骨髓单个核细胞的分离

  1. 安乐死的CO 2窒息鼠标。
  2. 喷在背腹侧70%的乙醇。
  3. 就用锋利的剪刀腹部皮肤2厘米的切口。抓住钝镊子切口两侧皮肤,轻轻拉开腹部肌肉。
  4. 切下的后腿用剪刀,并立即将它们放置在预冷的PBS,4%FBS。
  5. 仔细清理附着于后肢用锋利的剃刀刃和棉花纱布包扎的所有肌肉。
  6. 分离从股骨胫骨。修剪用剃刀刃每个骨骼的两个技巧。
  7. 冲洗骨髓用3mL的PBS(含4%的FBS)的使用连接到一个3毫升注射器23政针的内容,并收集在15毫升离心管中的内容。通过细胞悬浮液的至少10倍通过针,使单细胞悬浮液。
  8. 小心覆盖等体积的淋巴细胞分离介质(3mL)中对细胞悬浮液,而不会干扰细胞悬浮液和淋巴细胞分离介质之间的接口。离心在400 xg离心在室温下30分钟。
  9. 小心收集血沉棕黄层,而不会干扰其它层和传输在新的15毫升离心管中。

3.中期细胞价差的制备

  1. 加入10 mL的PBS含有血沉棕黄层的管。
  2. 离心在400 xg离心在室温下5分钟。
  3. 小心取出上清液。然后分手Ť他细胞沉淀,轻轻敲击,并添加10毫升的PBS。
  4. 离心在400 xg离心在室温下5分钟。
  5. 而不干扰细胞团块除去上清,打散沉淀,并添加4mL的预热低渗0.075 1M氢氯化物溶液。通过添加温和持续振荡下跌低渗溶液滴。
  6. 孵育细胞20分钟,在37℃的水浴中。
  7. 低渗处理后,添加固定剂的等体积(4mL)中(甲醇:冰醋酸,3:1体积/体积)中的15毫升管中并通过反相管轻轻混匀。
  8. 离心在400 xg离心在室温下5分钟并弃上清。
  9. 分手的细胞沉淀用攻丝接着温和涡流几秒钟,并通过与恒定振荡滴加入3毫升固定剂溶液滴。
  10. 孵育在室温下30分钟,然后在400 xg离心离心5分钟。
  11. 除去上清液,分手绅士细胞沉淀乐攻,加3毫升新鲜固定液。
  12. 离心在400 xg离心在室温下5分钟,并除去上清液。分手轻轻敲击细胞沉淀,并加入新鲜的3毫升固定液。
  13. 重复步骤3.12两倍多。
  14. 离心在400 xg离心在室温下5分钟,并除去上清液而不扰乱细胞沉淀。然后加入400〜600μL固定液和吹打调匀。
  15. 滴30微升固定的细胞上以45°角倾斜的预清洗和湿载玻片并允许滑动到空气完全干燥过夜。

通过渔业部4小鼠染色体绘画

  1. 染色体变性
    1. 将包含中期细胞利差2X SSC在室温下2分钟的幻灯片。
    2. 脱水串行乙醇洗涤滑板为70%每2分钟,80%,和100%。在65℃下孵育60分钟。
    3. 预热40毫升变性溶液(70%甲酰胺/ 2×SSC; pH值7.0)至70℃(±2℃)下在玻璃科普林缸30分钟。 1.5分钟 - 通过温育在预热的变性溶液滑动1变性染色体。
    4. 骤立即滑到在冰冷的70%乙醇2分钟,停止变性过程以及防止变性染色体从重新退火。然后,通过用80%乙醇洗涤2分钟脱水。重复用100%乙醇的乙醇洗涤2分钟。完全干燥后在室温下的幻灯片。
  2. 变性和探针混合物杂交
    1. 短暂离心由制造商提供的探针混合物,在80℃(±2℃)的水浴中传送探测混合液10μL到500μL的卡扣帽离心管中,和变性温育7分钟。
    2. 将带有探针混合物的离心管在水浴中于37℃10分钟。
    3. 变性探针混合物应用到与变性chromoso幻灯片MES。
    4. 仔细覆盖18毫米×18毫米的玻璃盖玻片的区域以及非常轻轻按压盖玻片滑动消除任何可见的气泡。密封用橡胶水泥盖玻片的所有四个侧面和在用于杂交的潮湿室中在37℃孵育12小时,在黑暗中16小时。
  3. 杂交后清洗和检测
    1. 小心取出橡胶水泥和盖玻片。
    2. 在74℃(±2℃)下5分钟在预温0.4X SSC地方滑动。
    3. 在2分钟的洗涤溶液II(4×SSC / 0.1%吐温-20)洗涤滑动。
    4. 放置用DAPI复染(1.5微克/毫升)的抗褪色封固剂的20微升,用玻璃盖玻片覆盖。轻轻按下与实验室组织盖玻片,以去除气泡和多余的安装解决方案。用指甲油密封盖玻片的边缘。
    5. 使用配备有适当的过滤器的荧光显微镜视图幻灯片。

    5.光谱核型分析小鼠染色体的(SKY)

    1. 染色体和探针变性
      1. 平衡滑动在2×SSC在室温下进行2分钟,不摇动。
      2. 脱水在乙醇系列(100%乙醇70%,80%,和),在室温下每2分钟幻灯片。空气干燥幻灯片完全去除乙醇。
      3. 在玻璃科普林缸30分钟暖40毫升变性溶液(pH 7.0 70%甲酰胺/ 2×SSC)。
      4. 孵育在1至1.5分钟预热的变性溶液滑动。
      5. 立即浸入滑动入冰冷的70%乙醇2分钟,停止变性过程以及防止变性染色体从重新退火。
      6. 通过在室温下将其放入80%乙醇中2分钟,然后为100%乙醇2分钟,脱水的幻灯片。
      7. 在设定为80℃(±2℃)水浴变性SKY探头(瓶#1由制造商提供)7分钟,然后立即放入设定为37℃,10分钟的不同水浴中。
    2. 探针杂交
      1. 添加变性SKY探针的10微升到变性染色体。
      2. 小心地将18毫米×18毫米的玻璃盖玻片冲上天空探头,以便没有气泡盖玻片被困。
      3. 密封用橡胶水泥盖玻片的边缘。
      4. 放置幻灯片在加湿遮光室并在37℃下在黑暗中孵育24小时至36小时。
    3. 杂交后的洗涤和荧光检测
      1. 不干扰盖玻片非常小心取出橡皮泥。
      2. 放置滑入预热快速洗涤液(0.4倍SSC)在72℃(±2℃)下5分钟,以恒定振荡。沉浸滑入洗涤溶液III(4×SSC / 0.1%吐温20)和孵育1分钟,同时振摇。
      3. 可选:加入80微升阻断剂的(小瓶#2由制造商提供的)上的杂交的区域中,放置一个24毫米×60毫米的塑料盖玻片,并在37℃下在黑暗中温育30分钟,在湿润的腔室中。
      4. 轻轻取出塑料盖玻片和洗涤用预热(45℃)洗涤溶液III滑动5分钟。
      5. 应用80 Cy5信号μL染色试剂(瓶#3制造商提供),放置24毫米×60毫米的塑料盖玻片,在黑暗中,在加湿室内37℃下孵育40分钟。
      6. 浸滑入含有玻璃科普林缸预热(45℃)洗涤溶液III(4×SSC / 0.1%吐温20),并在水浴中于45℃孵育2分钟,振摇。重复此洗涤步骤3次。
      7. 应用80经Cy5.5的μL染色试剂(瓶#4由制造商提供),放置24毫米×60毫米的塑料盖玻片,在黑暗中,在加湿室内37℃下孵育40分钟。
      8. 与预热洗幻灯片3次(45℃)洗涤液III。
      9. 持反对纸巾倾斜位置排出多余液体的幻灯片。添加20μL的抗褪色DAPI试剂(小瓶#5由制造商提供),并小心地将24毫米×60毫米的玻璃盖玻片而不引入任何气泡。密封盖玻片的边缘与指甲油和与配备用于捕获SKY图像的落射荧光显微镜观察。

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Representative Results

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全身照射诱导照射小鼠的骨髓细胞大量染色体畸变。当前协议是用于治疗辐射暴露后在体内的骨髓细胞的有丝分裂停滞优化,从照射小鼠,骨髓单核细胞的分离的后腿骨髓细胞的收获通过密度梯度离心,制备中期细胞价差,以及随后的检测由渔业部和SKY技术辐射诱导稳定染色体畸变。染色体画使用这些技术可用于检测和评估各种病理生理条件的危险。

图1示出了代表中期细胞与正常和异常小鼠染色体对-1,-2和-3传播。 图2显示正常和异常小鼠中期染色体的光谱核型分析。这些结果表明,电离辐射的增殖鼠骨髓细胞,其主要是由该负责自我更新和分化成不同细胞类型的干细胞和祖细胞的诱导染色体间稳定像差。在干细胞和祖细胞的细胞遗传学改变已显示与各种临床疾病,包括癌症相关联,并且被认为是疾病的严重程度和总生存期的最强预测。因此,它是符合逻辑的推断电离辐射诱导的稳定间染色体畸变可能导致癌症的发展的风险增加。

图1
图1:为检测通过渔业部在照射小鼠骨髓细胞辐射的影响。 AB显示具有正常成对声道的小鼠中期细胞传播romosome-1(红),染色体2(绿色),以及染色体-3(水性)。所有其他染色体复染用DAPI(蓝色)。 C显示涉及染色体-1,染色体1的一部分已被集成在非画(DAPI)染色体,而另一部分已经形成了一个偏心片段稳定像差。 D显示染色体2的一部分的一部分已被集成在非画染色体。 E表示涉及染色体3稳定像差。 F显示涉及所有三个画染色体稳定的畸变。断点和色结由箭头指示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2: 辐射对骨马尔影响辐照鼠标流细胞检测由SKY。上图显示C57BL / 6雌性小鼠的正常光谱核型分析(SKY)。中间面板显示涉及染色体4和染色体12上的稳定的象差。较低的面板显示了涉及染色体7和染色体10一个稳定的染色体畸变鼠标光谱核型分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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几个关键步骤,确定渔业部和天空的成功。第一个也是最关键的一步是优化体内骨髓单个核细胞有丝分裂逮捕秋水仙碱治疗。秋水仙素浓度和处理时间是单独或共同确定有效的染色体绘画有丝分裂指数以及染色体浓缩,两个重要的先决条件。高浓度的秋水仙素或更长的治疗时间导致高度浓缩的染色体,不兼容的适当变性和杂交。此外,与冷凝染色体流传中期细胞复合重排的准确识别并不是一件容易的任务来实现。在22和26 g的体重的小鼠100微升0.05%秋水仙碱2小时的腹膜内施用产生中期细胞的足够数量的具有适度冷凝染色体传播。第二个关键步骤是低渗处理。量,处理时间,和低渗溶液影响染色体形态的温度并到达载玻片染色体蔓延。对于更短的时间或在一个亚最佳温度低渗治疗可以防止相应的染色体扩展,导致与重叠染色体传播中期细胞。染色体重叠原位杂交过程中,荧光信号的特异性,和重排的正确标识下游干扰。

第三,后低渗固定是避免细胞团的形成的重要一步。固定剂应该缓慢加入向下以恒定轻轻摇动,以获得单细胞悬浮液的离心管的一侧。否则,中期细胞的利差将成为被困在团块和染色体蔓延将受到损害。然而,染色体也扩展依赖于细胞类型,温度和在T相对湿度滴加细胞悬液到玻片上的输入法。先前的研究由Spurbeck报道,淋巴细胞,60%的相对湿度和20℃的温度下带来更高的中期区18。此外,干燥的持续时间也是最佳染色体扩频的关键步骤。中期细胞扩散的干燥过快产生紧张利差有许多重叠的染色体,而在破中期非常缓慢的干燥效果染色体18。然而,邓表明染色体蔓延,主要取决于相对湿度为各种培养细胞19。在第四个重要的步骤是优化染色体变性时间。更长和更短的时间变性探针杂交产生不利影响。较长的变性导致“浮肿”的染色体,而较短的变性阻碍对染色体探头的互动。减少染色体“浮肿”的另一种方法是对年龄载玻片在室温下过夜是脱颖而出变性步骤。不用于染色体涂染载玻片立即,可以无限期地在-20 C在干燥器中储存。染色体变性时间需要与滑动年龄,围绕中​​期细胞差细胞质的量,并且在该细胞滴到载玻片湿度标准化。探针变性和杂交也是成功的涂染重要。应避免探头明亮的光线直接照射,使荧光信号不输的信号强度。

这是完善的渔业部和天空是用于检测染色体间的稳定的畸变强有力的技术。任何重排以及损失或绘染色体增益可以容易地通过这两种方法来鉴定。然而,内臂和臂间的染色体交换检测由这些技术是不可能的。内臂和臂间的交流染色体鉴定,现在都成为了可能贝科使用,分别特定染色体臂多色FISH探针和mBAND FISH探针的发展。对前核工人先前的研究已经表明,mBAND分析是一个强大的工具,以确定辐射损伤20独特的签名。此外,姐妹染色单体交换的识别,辐射损伤21的一个特征,是不可能用这些技术。此外,这两个渔业部和SKY有限油漆染色体的着丝粒区,这可能导致在双着丝粒染色体易位的误得分能力。该技术也不适于识别易位的确切断点定位。此外,荧光信号不能被永久保存,信号强度随时间减小,和荧光染色体涂染不适合由自动系统的分析。然而,荧光信号强度可以通过存储滑动保存的时间更长的时间ES在冷冻机。

染色体绘画两种改进方法已经发展到克服渔业部和天空的限制:分别是,非荧光涂染22和光谱色条带(SCAN)23。非荧光染色体绘画用在鱼画中的过氧化物酶/二氨基联苯胺(DAB)的优点包括:精确识别着丝粒区域,鉴定染色体重排由亮场显微镜,以及非荧光信号被永久保存和图像分析可以实现自动化。另一方面,由于扫描探针从特定频带的基因组DNA序列制备的染色体特异性,因此,能够准确地识别在染色体带的原点的扫描结束的SKY有利的。 SCAN也便于帧内染色体交换的识别。考虑的改进的技术的优点,这些应视为常规使用我ñ临床细胞遗传学检测。然而,制备由每个染色体对特定频带的基因组DNA序列的探针在技术上是挑战性的,并且限制在分子细胞遗传学其使用。

确定治疗组之间的差是否具有统计显著与否是分子遗传学的另一个重要方面。得分的标准,如中期细胞的数目价差计数,每个处理组,每次分析中传播中期细胞染色体计数使用的动物的数量,所用的命名法来分类像差染色体涂染后观察中确定的统计不确定性发挥关键作用治疗组之间。虽然各个实验室拥有专有的评分标准,100至300和20个中期细胞在至少3至5只小鼠40以及分隔染色体扩散得分一般建议用于确定在渔业部和SKY肛门统计意义ysis,分别为24,25。此外,命名法的用于在涂染色体分类像差的选择是用于统计评估的不确定性的一个重要参数。目前正在使用的两种流行的命名系统来描述整个染色体涂染探针检测畸变:(1)S&S分类方法由野人和辛普森26,第27和(2)涂料命名由塔克等人。 28。每个系统都依赖于不同的先决条件结构性染色体畸变的分类都有自己的优点和缺点。标S系统主要适用于像差原籍机理的解释,而涂料提供的异常绘画图案的描述。通过Knehr 等人的研究在FISH绘染色体辐射诱发染色体畸变指示该涂料的方法,如S&S系统,也可以被用来确定与一些modificati像差原点在评分标准和将是实际应用29最有用的。

双方渔业部和SKY方法都有各自的局限性。例如,渔业部允许快速得分少训练,但是,它并不筛选所有染色体用于测量像差次数揭示只是局部畸变率,根据在研究中使用的涂染色体的数目。但是,整条染色体观察绘画交流总量的一小部分可以通过最初由卢卡斯等人假设的公式估算 30和由Braselmann 进一步改性 31。这个数学公式认为画的染色体中并涂上与复染染色体之间的交流。例如,让我们在fp表示由涂染色体覆盖的基因组的分数总和1(1 F),2(f 2)3(F 3),磨片重新˚F1 = 0.0696中,f 2 = 0.0649和f 3 = 0.0570,该值代表个人染色体的雌性小鼠的基因组的内容。因此, 在fp =(F 1 + F 2 + F 3)= 0.192和复染率变为(1 - 在fp)= 0.808。涉及涂和复染染色体(F P)的交流的频率可以很容易地由二项展开式的叉积(P + Q)来计算2 = P 2 + 2PQ + Q 2,其中p = F pq =(1 - 在fp)。因此, ,P = 2PQ = 2F P(1 - 在fp)= 0.310,这意味着染色体交换的31%是画小鼠染色体-1,-2后可观察到的,和-3。因此,1 / 0.31 = 3.23细胞需要被评分到等于一带状中期细胞或一种全基因组当量。此外,无论是渔业部和天空都仅限于特异性的能力ically确定哪些基因和断点都参与了像差形成和还检测小重复,倒置和缺失。

渔业部和SKY分析的应用不仅限于基础研究。两者都经常被在临床研究中使用。这些技术也被应用到产前和产后诊断,风险评估,和不同类型的癌症的鉴别。而且,无论是技术可用于油漆相间染色体。索科洛娃用于渔业部作画相间染色体的第一次32。这些技术也可用于在意外或故意曝光后人类辐照后剂量估算和风险评估电离辐射11,33。因此,通过渔业部或天空的部分或整个基因组的分析,分别是有用的工具,以检测染色体间稳定像差各种研究。

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Acknowledgments

这项研究是由阿肯色州空间格兰特财团和国家空间生物医学研究所通过美国国家航空和航天局的支持下,授予NNX15AK32A(RP)和RE03701(MH-J),和P20 GM109005(MH-J),以及美国退伍军人管理局( MH-J)。我们感谢克里斯托弗Fettes,环境和职业健康的在阿肯色大学医学科学部计划协调员,在准备稿件的编辑协助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

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References

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通过多色荧光跨染色体畸变稳定的检测<em&gt;原位</em&gt;杂交(渔业部)和光谱核型分析(SKY)的照射小鼠
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Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

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