Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Upptäckt av Inter-kromosomala Stabila Aberrations av flera Fluorescence doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurstudier utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Djuret Protokollet godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Arkansas för medicinska vetenskaper. Alla djur inhystes i standard luftkonditionerade djuranläggning vid 20 ± 2 ° C med 10 - 15 timme cykler av frisk luft och fri tillgång till standard gnagare mat och vatten. Vid ankomsten, mössen hölls i karantän under en vecka och under förutsättning certifierad gnagarmat.

1.Radiation Exponering och in vivo Gripandet av Metaphase celler

  1. Exponera un-sövda möss till 2 Gy hela kroppen strålning i en strålningskammare. Under bestrålningen att placera möss i en väl ventilerad mottagningskammaren se till att de inte rör sig fritt och få en enhetlig dos.
  2. Injicera 100 mikroliter av 0,05% kolchicin lösning (colchicine pulver upplöst kalcium och magnesium PBS) intraperitonealt med hjälp av en 25 G-nål fäst med 1 ml engångsspruta. Undvik injektion direkt i alla organ.
  3. Lämna djuret i buren under 2 h före benmärgscellskörd. Observera djuret för några tecken på smärta eller ångest.

2. Benmärgscell Skörd och isolering av benmärg mononukleära celler genom densitetsgradientcentrifugering

  1. Euthanize musen genom CO 2 kvävning.
  2. Spray 70% etanol på rygg och ventrala sida.
  3. Gör en 2 cm snitt på bukhuden med vass sax. Ta tag i huden på vardera sidan av snittet med trubbig pincett och försiktigt dra öppna magmusklerna.
  4. Klipp av de båda bakbenen med sax och omedelbart placera dem i förväg kyld PBS med 4% FBS.
  5. Rengör försiktigt alla muskler kopplade till bakbenet med en vass rakblad och bomull gasbinda.
  6. Separera skenbenet från lårbenet. Trimma båda spetsarna av varje ben med ett rakblad.
  7. Spola innehållet i benmärgen med 3 ml PBS (med 4% FBS) med användning av en 23 G nål fäst till en 3 ml spruta och samla innehållet i ett 15 ml centrifugrör. Passera cellsuspensionen minst 10 gånger genom nålen för att göra en enkelcellsuspension.
  8. Noggrant överlagra cellsuspensionen på en lika stor volym lymfocytseparationsmedium (3 ml) utan att störa gränsytan mellan cellsuspensionen och lymfocytseparationsmedium. Centrifugera vid 400 xg under 30 min vid rumstemperatur.
  9. Samla lättcellskoncentratet försiktigt utan att störa de andra lagren och överföring i ett nytt 15 ml centrifugrör.

3. Beredning av Metaphase cell Spreads

  1. Tillsätt 10 ml PBS till röret innehållande buffy coat.
  2. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid rumstemperatur.
  3. Försiktigt bort supernatanten. bryta sedan upp than cellpelleten med att slå lätt och tillsätt 10 ml PBS.
  4. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid rumstemperatur.
  5. Avlägsna supernatanten utan att störa cellpelleten, bryta upp pelleten och tillsätt 4 ml av förvärmda hypoton 0,075 M kaliumkloridlösning. Lägg hypoton lösning droppvis med varsam konstant skakning.
  6. Inkubera cellerna under 20 min vid 37 ° C i ett vattenbad.
  7. Efter hypoton behandling, tillsätt en lika stor volym (4 mL) av fixativ (metanol: isättika, 3: 1 vol / vol) i 15 ml rör och blanda försiktigt genom att vända röret.
  8. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid rumstemperatur och häll bort supernatanten.
  9. Bryta upp cellpelleten med knacka följt av försiktig vortex under några sekunder och tillsätt 3 ml fixeringslösning droppe för droppe med konstant skakning.
  10. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur och centrifugera sedan vid 400 xg under 5 min.
  11. Avlägsna supernatanten, bryta upp cellpelleten med gentle knacka, och tillsätt 3 ml färsk fixativ.
  12. Centrifugera vid 400 xg under 5 minuter vid rumstemperatur, och avlägsna supernatanten. Bryt upp cellpelleten med försiktigt packas, och tillföra ny 3 ml fixativ.
  13. Upprepa steg 3,12 gånger mer.
  14. Centrifugera vid 400 xg under 5 minuter vid rumstemperatur, och avlägsna supernatanten utan att störa cellpelleten. Tillsätt sedan 400 till 600 mikroliter fixativ och blanda väl med pipettering.
  15. Drop 30 mikroliter fixerade celler på förhand rengjorda och våta glider lutas i 45 ° vinkel och låta bilderna lufttorka fullständigt över natten.

4. mus kromosom målning av mFISH

  1. kromosom Denaturering
    1. Placera bilden innehållande metafas cell uppslag i 2 x SSC under 2 minuter vid rumstemperatur.
    2. Torka bilden genom serie etanol tvätt under 2 minuter vardera i 70%, 80% och 100%. Inkubera i 60 min vid 65 ° C.
    3. Värm 40 ml denatureringslösning (70% formamid / 2x SSC; pH 7,0) till 70 ° C (± 2 ° C) i en glas Coplin-kärl under 30 min. Denaturera kromosomer genom att objektglaset odlas i förvärmda denatureringslösning till 1 - 1,5 min.
    4. Släck glida omedelbart i iskall 70% etanol i 2 min för att stoppa denatureringsprocessen samt att förhindra denaturerade kromosomer från att åter glödgning. Därefter dehydrera genom tvättning med 80% etanol i 2 min. Upprepa etanoltvätt med 100% etanol i 2 min. Helt torr sliden vid rumstemperatur.
  2. Denaturering och hybridisering av sondblandningen
    1. centrifugera kort sondblandning som tillhandahålls av tillverkaren, överför 10 | il av sondblandningen i en 500 mikroliter snap cap centrifugrör, och denaturera genom inkubation vid 80 ° C (± 2 ° C) i ett vattenbad i 7 min.
    2. Placera centrifugröret med sondblandningen i ett vattenbad vid 37 ° C under 10 min.
    3. Applicera denaturerad sond blandningen på bilden med denaturerad chromosomes.
    4. Noggrant täcka området med en 18 mm x 18 mm täckglas och eliminera några synliga luftbubblor genom att mycket försiktigt trycka locket glida att glida. Täta alla fyra sidor av täckglas med gummicement och inkubera under 12 h till 16 h i mörker vid 37 ° C i en fuktig kammare för hybridisering.
  3. Post Hybridisering Tvättning och detektion
    1. Försiktigt bort gummicement och täckglaset.
    2. Placera objektglaset i förvärmda 0.4x SSC vid 74 ° C (± 2 ° C) under 5 min.
    3. Tvätta objektglaset i tvättlösning II (4x SSC / 0,1% Tween-20) under 2 min.
    4. Placera 20 mikroliter av anti-fade monteringsmedium med DAPI kontrast (1,5 mikrogram / ml) och täck med ett täckglas. Tryck försiktigt på täck med lab vävnad för att avlägsna luftbubblor och överskott monteringslösning. Försegla kanterna på täckglas med nagellack.
    5. Se bilder med hjälp av en fluorescerande mikroskop utrustat med lämpliga filter.

    5. Spectral karyotypering (SKY) av muskromosomer

    1. Kromosomen och Probe denaturering
      1. Jämvikta slide i 2 x SSC vid rumstemperatur under 2 min, utan skakning.
      2. Dehydratisera sliden i en etanolserie (70%, 80% och 100% etanol) under 2 min vardera vid rumstemperatur. Lufttorka bilden för att avlägsna etanolen helt.
      3. Varm 40 ml denatureringslösning (70% formamid / 2 x SSC; pH 7,0) i en glas Coplin-kärl under 30 min.
      4. Inkubera bilden i förvärmda denatureringslösning för 1-1,5 min.
      5. Omedelbart fördjupa bilden i iskall 70% etanol i 2 min för att stoppa denatureringsprocessen samt att förhindra denaturerade kromosomer från att åter glödgning.
      6. Dehydratisera sida genom att placera den i 80% etanol under 2 min och sedan in i 100% etanol under 2 min vid rumstemperatur.
      7. Denaturera SKY sonden (flaska # 1 som tillhandahålls av tillverkaren) i ett vattenbad inställt på 80 ° C (± 2 ° C)under 7 min, och sedan omedelbart placera i en annan vattenbad inställd på 37 ° C under 10 min.
    2. probhybridisering
      1. Tillsätt 10 mikroliter av denaturerad SKY sond på de denaturerade kromosomer.
      2. Placera försiktigt en 18 mm x 18 mm täckglas på SKY sonden så att inga luftbubblor fastnar under täck.
      3. Försegla kanterna på täckglas med gummicement.
      4. Placera bilden i en fuktad ljustäta kammare och inkubera i mörker vid 37 ° C under 24 h till 36 h.
    3. Post-hybridisering Tvättning och fluorescensdetektion
      1. Demontera gummicement mycket försiktigt utan att störa täck.
      2. Placera glida in förvärmda snabba tvättlösning (0.4x SSC) vid 72 ° C (± 2 ° C) under 5 min med konstant skakning. Fördjupa glida in tvättlösning III (4x SSC / 0,1% Tween 20) och inkubera under 1 min under skakning.
      3. Valfritt: Tillsätt 80 mikroliter av blockeringsreagens(Flaska # 2 tillhandahålls av tillverkaren) på området för hybridisering, placera en 24 mm x 60 mm plasttäck, och inkubera i mörker vid 37 ° C under 30 minuter i en fuktig kammare.
      4. Försiktigt bort plasttäck och tvätta bilden med förvärmda (45 ° C) tvättlösning III i 5 min.
      5. Applicera 80 mikroliter av Cy5 färgning reagens (flaska # 3 levereras av tillverkaren), placera en 24 mm x 60 mm plasttäck, och inkubera vid 37 ° C i mörker under 40 minuter i en fuktig kammare.
      6. Doppa sliden i en glas Coplin-kärl innehållande förvärmda (45 ° C) tvättlösning III (4x SSC / 0,1% Tween 20) och inkubera vid 45 ° C i ett vattenbad under två minuter med skakning. Upprepa detta tvättsteg 3 gånger.
      7. Applicera 80 mikroliter av Cy5.5 färgningsreagens (flaska # 4 tillhandahålls av tillverkaren), placera en 24 mm x 60 mm plasttäck, och inkubera vid 37 ° C i mörker under 40 minuter i en fuktig kammare.
      8. Tvätta sliden 3 gånger med förvärmda (45 ° C) tvättlösning III.
      9. Hålla sliden i ett lutat läge mot en pappershandduk för att dränera överskottsvätska. Tillsätt 20 mikroliter anti-fade DAPI reagens (flaska # 5 från tillverkaren) och försiktigt placera en 24 mm x 60 mm täckglas utan att införa eventuella luftbubblor. Täta kanterna på täckglas med nagellack och observera med ett epifluorescensmikroskop utrustat för att fånga SKY bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Helkroppsbestrålning inducerar ett flertal kromosomavvikelser i benmärgsceller från bestrålade möss. Det nuvarande protokollet är optimerad för in vivo mitotiska arrestering av benmärgsceller efter strålningsexponering, skörd av benmärgsceller från bakbenen av bestrålade möss, isolering av benmärgsmononukleära celler genom densitetsgradientcentrifugering, utarbetande av metafas cell uppslag och efterföljande detektering av strålningsinducerade stabila kromosomavvikelser av mFISH och SKY tekniker. Kromosom målning med hjälp av dessa tekniker kan användas för att upptäcka och bedöma risken för olika patofysiologiska förhållanden.

Figur 1 visar representativa metafas cell sprids med normala och avvikande mus kromosomparen-1, -2 och -3. Figur 2 visar spektral karyotypering av normala och onormala mus metafaskromosomer.Dessa resultat visar att joniserande strålning inducerar inter-kromosomala stabila avvikelser i prolifererande murina benmärgsceller, som främst består av stam- och progenitorceller som ansvarar för självförnyelse och differentiering till olika celltyper. Cytogenetiska förändringar i stam- och progenitorceller har visat sig associera med olika kliniska sjukdomar, bland annat cancer, och anses vara de starkaste prediktorer för sjukdomens svårighetsgrad och total överlevnad. Därför är det logiskt att dra slutsatsen att joniserande strålning-inducerad stabila inter kromosomavvikelser kan medföra ökad risk för cancerutveckling.

Figur 1
Figur 1: Effekt av strålning på benmärgsceller hos en bestrålad mus såsom detekterades genom mFISH. A och B visar en mus metafas cell sprids med normala par chromosome-1 (röd), kromosom-2 (grön), och kromosom-3 (aqua). Alla andra kromosomer motfärgades med DAPI (blå). C visar stabil aberration som involverar kromosom-1, har en del av kromosom-en integrerats i en icke-målat (DAPI) kromosom, medan en annan del har bildat en acentrisk fragment. D visar en del av en del av kromosom-2 har integrerats i icke-målade kromosom. E representerar stabil aberration som involverar kromosom-3. F visar en stabil aberration som omfattar alla tre målade kromosomer. Brytpunkter och färg korsningar anges med pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Effekt av strålning på Bone Marrow Celler av bestrålat mus som detekteras av SKY. Den övre panelen visar en normal spektral karyotypering (SKY) i C57BL / 6 mus av honkön. Den mellersta panelen visar en stabil aberration som involverar kromosom-4 och kromosom-12. Den nedre panelen visar mus spektral karyotypering med en stabil kromosomavvikelse som involverar kromosom-7 och kromosom-10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flera kritiska steg bestämma framgången för mFISH och SKY. Den första och mest kritiska steget är att optimera kolchicin behandling för in vivo mitotiskt gripandet av benmärgsmononukleära celler. Colchicinet koncentration och behandlingstiden individuellt eller tillsammans bestämma mitosindex samt kromosomkondens två viktiga förutsättningar för effektiv kromosom målning. En hög kolchicin koncentration eller längre behandlingstid leder till högt kondenserade kromosomer, inkompatibla för korrekt denaturering och hybridisering. Dessutom är korrekt identifiering av komplexa omdisponeringar i metafas cell sprids med kondenserade kromosomer inte en lätt uppgift att uppnå. Intraperitoneal administrering av 100 mikroliter 0,05% kolchicin under 2 timmar i en mus med en kroppsvikt mellan 22 och 26 g ger ett tillräckligt antal meta cell sprids med måttligt kondenserade kromosomer. Den andra kritiska steget är hypoton behandling.Volymen, behandlingstid, och temperaturen för den hypotona lösningen inflytande kromosom morfologi och spridning av kromosomer på glasobjektglas. En hypoton behandling under en kortare tidsperiod eller vid en suboptimal temperatur kan förhindra rätt kromosom spridning, vilket resulterar i metafas cell sprids med överlappande kromosomer. Kromosom överlappning stör nedströms situ hybridisering process, specificiteten av fluorescerande signaler och korrekt identifiering av omarrangemang i.

För det tredje är efter hypotonisk fixering ett viktigt steg för att undvika cellklumpbildning. Fixativet skall tillsättas långsamt ned längs sidan av centrifugröret med konstant försiktig skakning för att erhålla en enkelcellsuspension. Annars kommer metafas cell sprider fastna i klumpar och kromosom spridning kommer att äventyras. Emellertid kromosom sprider också beror på celltypen, temperatur och relativ luftfuktighet vid time av att tappa cellsuspensionen på objektglas. En tidigare studie av Spurbeck rapporterade att för lymfocyter, en 60% relativ fuktighet och en 20 ° C temperaturresulterar i högre metafas området 18. Dessutom är varaktigheten av torkning också ett viktigt steg för optimal kromosom spridning. Metafas cell sprider att torka alltför snabbt producera tighta marginaler med många överlappande kromosomer, medan mycket långsamt torkresultat i trasiga metafaskromosomer 18. Emellertid Deng visade att kromosom sprider primärt beror på den relativa fuktigheten för en rad olika odlade celler 19. Den fjärde viktigt steg är att optimera kromosom denatureringstiden. En längre och kortare denatureringstiden påverka probhybridisering negativt. Längre denaturering orsakar "fluffigt" kromosomer, medan kortare denaturering hindrar växelverkan av sond till kromosomerna. Ett annat sätt att minska kromosom "påsar" är ålders glider över natten vid rumstemperatur varafören denatureringssteg. Diabilder som inte används för kromosom målning omedelbart, kan lagras på obestämd tid i en torkapparat vid -20 ° C. Kromosomdenatureringstiden måste standardiseras med glid ålder, mängden cytoplasman runt metafas cell sprider och luftfuktighet vid vilken celler tappades på bilderna. Probe denaturering och hybridisering är också viktigt för en lyckad kromosom målning. Direkt exponering av sönder till starkt ljus bör undvikas, så att fluorescerande signal inte förlorar signalintensitet.

Det är väl etablerat att mFISH och SKY är kraftfulla tekniker för att detektera inter kromosomala stabila avvikelser. Eventuella omflyttningar samt förlust eller vinst på målade kromosomer kan lätt identifieras genom dessa två metoder. Men detektion av intra-arm och inter-arm kromosomala utbyten inte är möjlig med dessa tekniker. Identifiering av intra-arm och inter-arm kromosomala utbyte har nu blivit möjligt becaanvändning av utvecklingen av, respektive, kromosom arm specifik multicolor FISH-prober och mBAND FISH-prober. En tidigare studie på tidigare kärnkraftsarbetare har visat att mBAND analys är ett kraftfullt verktyg för att identifiera unika signaturer av strålningsskador 20. Dessutom, identifiering av systerkromatidutbyte, ett kännetecken för strålskador 21, är inte möjlig med dessa tekniker. Dessutom har både mFISH och SKY begränsad förmåga att måla centromeriska regionen av kromosomer, vilket kan resultera i felaktig repning av dicentric kromosomen som translokation. De tekniker är inte heller lämpade för att identifiera den exakta brytpunkts lokalisering av translokation. Dessutom kan fluorescerande signaler inte bevaras permanent, minskar signalintensitet med tiden, och fluorescerande kromosom målning är inte lämplig för analys med ett automatiserat system. Däremot kan fluorescerande signalstyrka bevaras under en längre tid genom att lagra gledes i frysen.

Två förbättrade metoder för kromosom målning har utvecklats för att övervinna begränsningarna i mFISH och SKY: respektive icke-fluorescerande kromosom målning 22 och spektral färg banding (SCAN) 23. Fördelarna med icke-fluorescerande kromosom målning med hjälp av peroxidas / diaminobensidin (DAB) över FISH målning inkluderar korrekt identifiering av den centromeriska regionen, identifiering av kromosomal omlagring av ljusfält mikroskop, och att icke-fluorescerande signal är permanent bevaras och bildanalys kan automatiseras. Å andra sidan, är den SCAN fördelaktig jämfört SKY eftersom SCAN prober framställes från bandspecifika genomiska DNA-sekvenser för en specifik kromosom och således kan korrekt identifiera ursprunget för en kromosom-band. SCAN underlättar också identifieringen av intra-kromosomala utbyten. Med tanke på fördelarna med förbättrad teknik, bör dessa övervägas för rutinmässig användning in klinisk cytogenetisk testning. Emellertid är framställning av prober från bandspecifika genomisk DNA-sekvens för varje kromosom par tekniskt utmanande och begränsar dess användning i molekylära cytogenetik.

Fastställande av huruvida skillnaden mellan behandlingsgrupperna är statistiskt signifikant eller inte är en annan viktig aspekt av molekylära cytogenetik. Bedömningskriterier, såsom antalet meta cell sprider räknas antalet djur som används per behandlingsgrupp, kromosomantal per metafas cell spridas under analys, nomenklatur som används för att klassificera avvikelser observerades efter kromosom målning, etc. spelar en avgörande roll för att bestämma den statistiska osäkerheten mellan behandlingsgrupperna. Även om olika laboratorier har egna bedömningskriterier, poäng av 100 till 300 och 20 metafas cell sprider med 40 väl separerade kromosomer i åtminstone 3-5 möss rekommenderas generellt för att bestämma statistisk signifikans i mFISH och SKY anallys, respektive 24, 25. Dessutom är valet av nomenklatur används för att klassificera avvikelser i målade kromosomer en viktig parameter för att bedöma statist osäkerhet. Det finns två populära nomenklatur system som används för att beskriva avvikelser som upptäckts av hela kromosom målning prober: (1) S & S klassificeringsmetod av Savage och Simpson 26, 27 och (2) FÄRG nomenklatur av Tucker et al. 28. Varje system bygger på olika förutsättningar för klassificering av strukturella kromosomavvikelser och har sina egna fördelar och nackdelar. S & S-systemet är primärt lämpliga för mekanistisk tolkning av aberration ursprung, medan PAINT ger en beskrivning av onormala målning mönster. Studier av Knehr et al. på strålningsframkallade kromosomavvikelser i fisk målade kromosomer indikerar att färgen metoden, som S & S-system, kan också användas för att bestämma aberration ursprung med vissa modificatipå i kriterierna scoring och skulle vara mest användbar för praktisk tillämpning 29.

Både mFISH och SKY metoder har sina egna begränsningar. Till exempel, mFISH tillåter snabb poäng med lite träning, men det inte gå igenom alla kromosomer för att mäta frekvensen för avvikelser och avslöjar endast delvis avvikelse frekvensen, beroende på antalet målade kromosomer som används i studien. Däremot kan en del av de totala utbyten som observerats av hela kromosom målning uppskattas genom formeln ursprungligen antagna av Lucas et al. 30 och modifierades ytterligare genom Braselmann et al. 31. Denna matematiska formel anser utbyte mellan målade kromosomer och mellan målade och motfärgade kromosomer. Till exempel, låt f p representerar den fraktionella summan av genomet som täcks av de målade kromosomerna 1 (f 1), 2 (f 2), och 3 (f 3), where f 1 = 0,0696, f 2 = 0,0649, och f3 = 0,0570, värdena representerar den genomiska innehållet i enskilda kromosomer i honmöss. Därför blir f p = (f 1 + f2 + f3) = 0,192 och counterstained fraktion (1 - fp) = 0,808. Frekvensen av utbyten med målade och motfärgade kromosomer (Fp) kan lätt beräknas genom kors produkten av binomial expansion (p + q) 2 = p 2 + 2PQ + q 2, där p = fp och q = (1 - fp). Således, F P = 2PQ = 2f p (1 - f p) = 0,310, vilket innebär 31% av kromosomala utbyten är observerbar efter målning muskromosom-1, -2, och -3. Därför 1 / 0,31 = 3,23 celler måste avslutade lika en bandad metafas celler eller en hela genomet motsvarande. Vidare har såväl mFISH och SKY har begränsad förmåga att specifmatiskt identifiera vilka gener och brytpunkter är involverade i aberration bildas och även att upptäcka små dubbel, inversioner och deletioner.

Tillämpningen av mFISH och SKY analys är inte begränsad till grundforskning. Båda är regelbundet används i kliniska studier. Dessa tekniker har också använts för prenatal och postnatal diagnos, riskbedömning och identifiering av olika typer av cancer. Vidare kan både de tekniker användas för att måla interfas-kromosomer. Sokolova använde mFISH att måla interfas kromosomer för första gången 32. Dessa tekniker används också för efter strålningsdos uppskattning och riskbedömning hos människa efter oavsiktlig eller avsiktlig exponering för joniserande strålning 11, 33. Därför delvis eller helt genomanalys av mFISH eller SKY, respektive, är användbara verktyg för att upptäcka mellan kromosomala stabila avvikelser för olika studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av Arkansas Space Grant Consortium och National Space Biomedical Research Institute genom National Aeronautics and Space Administration, ger NNX15AK32A (RP) och RE03701 (MH-J), och P20 GM109005 (MH-J), och amerikanska Veterans Administration ( MH-J). Vi tackar Christopher Fettes, programkoordinatorn för avdelningen för Miljö- och Arbetshälso vid University of Arkansas för medicinska vetenskaper, för redaktionellt stöd i utarbetandet av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
Upptäckt av Inter-kromosomala Stabila Aberrations av flera Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) och Spectral karyotypering (SKY) i bestrålade möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter