We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.
Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals.
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.
Biomineralization היא סדרה מורכבת של אירועים, אשר מגשרת חבילה של פעילות הסלולר וכתוצאה מכך הייצור של מינרלי הורה להפליא 1. האתגר הוא לאפיין הן את תהליך הסלולר הדינמי ואת המבנים מינרליים מתוחכמים באמצעות שילוב של שיטות מיקרוסקופיה אופטית האלקטרון. של העלאת ה- pH התוך-תאי מעדיף את היווצרות גבישים 3 קאקו, ומכאן, זיהוי שלב בחיים כי יש pH גדל מגלה בזמן הסתיידות עשוי להיות התרחשות 2, 3.
תולעי השפופרת ממשפחת Serpulidae הם calcifiers נפוץ בים 4. זהו גם מודל חסר חוליות פופולרי עבור מחקר ימי, במיוחד biofouling 5, 6. במחקר זה, התהליך של הסתיידות בתאי mineralizing דורותbiomineralization ng הוא ציין. התהליך המהיר של מטמורפוזה כולל את הופעתה של מבני סידן פחם 7, 8.
אנו מדגימים כיצד מדידות pH הפנימיות יכול להתבצע על תולעת-שפופרת, וכיצד שלבי חיים ורקמות רלוונטיות הסתיידות יכולים להיות מוקרנים. לאחר השלב של עניין החיים מזוהה, הרקמה האחראית הסתיידות ניתן לאפיין ברזולוציה גבוהה באמצעות שיטות מיקרוסקופיה אלקטרוניות. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אנו קובעים את הזמן הדרוש סידן פחמתי להופיע לאחר אינדוקציה מותמרים. בשלב דומה של חיים לאחר מכן דמיין עם SEM-EDS להפצת רכב יסודות, ואת המינרלים שהופקדו נותחו באמצעות שתי שיטות מיקרוסקופיה אלקטרונית שונות, במיוחד SEM-EBSD ו FIB-TEM.
דימות אופטי Live הוא שיטה יעילה עבור התבוננות אירועים הסלולר ב אורגניזם רב-תאי. הנה, יון pH וסידן פנימי אינדיקטורים שימשו למדידת השטף של יונים באתרי מינרליזציה. באזורים אלה, יון שאיבה פעילה נדרשה להעלות pH ו Ca 2 + ריכוז לאפשר הסתיידות 2, 3.</…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to send a big thank you to Clemson Broadcast Productions, audio recording by J. Bright, Narration by A. D. McQuiston, Audio sweetening, K. Murphy, videography by G. Spake, Graphic arts by T. Messervy, Video editing by T. Messervy and E. Rodgers. Technical assistance and scientific advice was inspired by the advice of S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane, and R. Dineshram. This study was funded by three GRF grants from the HKSAR-RGC (Grant Numbers: 705511P, 705112P, and 17304914).
Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
35-mm-diam dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
Calcein | Sigma | C0875 | |
FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
HRTEM H500 | Hitachi | ||
SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |