Summary
Her viser vi hvordan du kan kvantifisere antallet og romlig fordeling av synaptiske aktive soner i Drosophila melanogaster fotoreseptorer, markert med en genetisk kodet molekylær markør, og deres modulering etter langvarig eksponering for lys.
Abstract
Nervesystemet har bemerkelsesverdig evne til å tilpasse seg og reagere på ulike stimuli. Dette nevrale justeringen er i stor grad oppnådd gjennom plastisitet på den synaptiske nivå. Den aktive sone (A) er den region på den presynaptiske membranen som medierer nevrotransmitter-frigjøring, og er sammensatt av en tett samling av stillas proteiner. AZS av bananflue (Drosophila) fotoreseptorer gjennomgå molekylær ombygging etter langvarig eksponering for naturlig lys fra omgivelsene. Således kan nivået av neuronal aktivitet kan flytte den molekylære sammensetning av AZ og bidra til regulering av den funksjonelle utgang.
Starter fra lyseksponering oppsett forberedelse til immunhistokjemi, denne protokollen detaljer hvordan å kvantifisere antallet, den romlige fordelingen, og delokalisering nivået av synaptiske molekyler ved AZS i Drosophila fotoreseptorer. Ved hjelp av bildeanalyse software, klynger av GFP-smeltet AZ komponent Bruchpilot ble identifisert for hver R8 fotoreseptoren (R8) axon terminalen. Oppdages Bruchpilot flekker ble automatisk tildelt individuelle R8 aksoner. For å beregne fordelingen av sted frekvens langs aksonet, gjennomførte vi en tilpasset programvare plugin. Hver axon start-punktet og sluttpunktet er manuelt definert og posisjonen for hver Bruchpilot flekk ble projisert på forbindelseslinjen mellom start- og sluttpunktet. I tillegg til antall Bruchpilot klynger, vi også kvantifisert delokalisering nivået Bruchpilot-GFP innenfor klynger. Disse målingene gjenspeiler i detalj romlig løst synaptiske dynamikk i en enkelt nervecelle under ulike miljøforhold på stimuli.
Introduction
Modulering av synaptisk funksjon bidrar til bemerkelsesverdig evne til nervesystemet til nettopp svare eller tilpasse seg endrede miljømessige stimuli. Justering av presynaptiske vesikler utgivelsen sannsynlighet er en måte å kontrollere synaptisk styrke en. Synaptic vesicle utgivelsen finner sted på Active Zone (AZ), et spesialisert område av den presynaptiske membranen 2. AZ er karakterisert ved en kassett av spesifikke proteiner 3, 4. De fleste proteiner som bidrar til AZ montering er høyt konservert i nematoder, insekter og pattedyr 5. Nylige studier tyder på at nivået av neuronal aktivitet regulerer den molekylære sammensetning av AZ, som i sin tur bidrar til regulering av den funksjonelle utgangs både in vitro og in vivo 6, 7,> 8. Vi har tidligere funnet at fotoreseptorlidelser AZS gjennomgå molekylær ombygging i Drosophila etter langvarig eksponering for naturlig lys fra omgivelsene 9. I denne tilstanden, observerte vi at antall Bruchpilot (BRP) -positivt AZS ble redusert i fotoreseptorlidelser aksoner.
BRP / CAST / elg familie proteiner er grunnleggende byggesteinene i AZS i virveldyr og virvelløse synapser 10. I Drosophila BRP mutanter, fremkalt vesikkel utgivelsen er undertrykt 11, 12. De 17 C-terminale aminosyrerester BRP er avgjørende for synaptisk vesikkel clustering på Drosophila nevromuskulær Junction (NMJ) 13, 14. Disse studiene viste den sentrale rollen til dette molekylet i AZ organisasjon og funksjon. Med en nylig utviklet genetiske verktøy, Synaptic Tagging med rekombinasjon (STAR) BRPkan observeres in vivo i spesifikke celletyper, i det endogene ekspresjonsnivåer og ved et enkelt synapse oppløsning 15. Dette verktøyet gjør det mulig å evaluere de endogene dynamikken i synapser kvantitativt i det komplekse sentralnervesystemet.
Det har vært flere studier inkludert synapse kvantifisering basert på data fra konfokalmikroskopi. Synaptiske endringer har blitt evaluert ved å måle lengden, området, volumet, densiteten og telling av antallet basert på avanserte programmer. For eksempel gir freeware ImageJ en kvantifisering metode for total synaptiske området og tiltak synaptiske tetthet på Drosophila NMJ 16. Antallet colocalization områder av pre og postsynaptisk markører er kvantifisert ved hjelp av plugin "puncta Analyzer" tilgjengelig på ImageJ programvareplattform 17. Alternativt kan en multi-parpsykososial numerisk datamiljø basert program, Synapse Detector (synd), kan automatisk spore dendritter av nerveceller merket med en fluoriserende fargestoff, og deretter kvantifiserer synaptic protein nivåer som funksjon av avstand fra cellekroppen 18. Programvaren Synaptic puncta Analysis (SynPAnal), har blitt designet for rask analyse av 2D-bilder av nevroner kjøpt fra confocal eller fluorescerende mikroskopi. Den primære funksjonen til denne programvare er automatisk og hurtig kvantifisering av tetthet og intensiteten av protein puncta 19. Nylig har en automatisk læringsbasert synapse algoritme blitt generert for kvantifisering av synaptisk nummer i 3D 20, drar nytte av 3D-visualisering-pasning Analysis (Vaa3D) programvare 21.
Kommersiell bildeanalyse programvare er også kraftige verktøy for synaptiske quantifications. For eksempel, det fluorescensmerkede nevrotransmitterreseptorer eller en presynaptisk A-komponent er kvantifisert i tre dimensjoner med enkelt-synapse oppløsning i C. elegans 22 eller Drosophila luktsystemet 23, 24, slik at hundrevis av synapser å være raskt karakteriseres innen en enkelt prøve.
Her presenterer vi en fremgangsmåte ved et tilpasset programvare for bildeanalyse plug-in implementert i en multi paradigme numerisk datamiljø som gjør det mulig å analysere halvautomatisk flere aspekter av AZS, inkludert deres antall, fordeling og graden av anrikning av molekylære komponenter til AZ. Således dette kompleks analyse tillot oss å evaluere dynamikken i synaptiske komponenter i axon terminaler under forskjellige miljøbetingelser. Vi undersøkte effekten av lyseksponering på utgangs synapsene av voksen fluefotoreseptorer. Fremgangsmåten utføres i tre trinn: 1)forberedelse for lyseksponering, 2) disseksjon, immunhistokjemi og konfokal avbildning, og 3) bildeanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eksperimentelle prosedyrer beskrevet i denne protokollen innebærer utelukkende jobbe med Drosophila og er ikke utsatt for dyrevelferd lover i Tyskland og Japan.
1. lyseksponering betingelser
- Forbered fluer som bærer sensless-flippase (sens-FLP) og bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 for å visualisere Brp-GFP i fotoreseptorlidelser R8 nevroner (R8s). Den genomiske locus koding brp innenfor en bakteriell kunstig kromosom (BAC) ble modifisert for å generere denne BRP-FSF-GFP konstruere. I fluene som bærer denne modifiserte BAC ekspresjon BRP-GFP er under kontroll av den endogene regulatoriske sekvenser, men begrenset til R8 fotoreseptorer etter sensless-flippase-formidlet fjerning av FRT-STOP-FRT kassett 15. Merk at sens-FLP sjelden uttrykker flippase i R7s.
- Holde fluene i en 12 timers liGHT / 12 timer mørke-syklus (LD) ved 25 ° C fra larvestadiet til eklosjonshormon (figur 1A).
- Samle fluene 0 - 6 timer etter eklosjonshormon og plassere dem inn i et nytt hetteglass med fly mat.
- Still ampullene inn i en gjennomsiktig stativ laget av akrylharpiks med tre trinn (en høyde på 41 cm, en base av 21 cm, en tykkelse på 4 cm og en høyde på 13 cm for hvert trinn) (figur 1B).
- Justere avstanden mellom stativet og en LED panel for å gi belysning med en gjennomsnittlig intensitet på 1000 lux ved hjelp av en digital lysmåler (figur 1C).
- Holde fluene for 1-3 d under en av følgende betingelser: konstant mørke (DD), 12 timer lys / 12 timer mørke syklus (LD), eller konstant lys (LL) ved 25 ° C i en liten inkubator (figur 1A og 1C).
2. Dissection, Immunohistochemistry og bildebehandling
- Dissekere fly hjerner med pinsett, fikse dem med 4% formaldehyde og immunfarging med det primære antistoff mot Chaoptin (01:50) og et andre antistoff for visualisering av fotoreseptorene basert på tidligere eksperimentelle prosedyrer 25. Kort:
- Fremstille 0,1% Triton X-100 i PBS (0,1% PBT). Denne oppløsning brukes til å forbedre antistoff vevspenetrering.
- Anesthetize fluer på en CO 2 pad, sortere ut riktig genotype og overføre dem til en petriskål fylt med 0,1% PBT.
- Hold deg pinsett under snabel og dra av de riktige og venstre øye henholdsvis med de andre tang.
- Fjern proboscis og luftrøret er festet til hjernen.
- Overfør hjernen med tang inn i et 1,5 ml rør inneholdende 150 mL av 0,1% PBT ved RT.
- Innen 10 min gjenta fra 2.1.3 - 2.1.5 for å få så mange hjerner som mulig.
- Tilsett 50 mL av 16% formaldehyd i røret og blandes ved pipettering.
- Inkuber hjerner i fiksativ på rommettemperatur i 50 min.
- Vask tre ganger med 200 ul 0,1% PBT med en mikropipette, betaler oppmerksomhet til å forlate hjernen i røret.
- Etter den siste vaskingen, fjerne den 0,1% PBT og legge det primære antistoff-oppløsning, fremstilt som følger: Tilsett til 196 mL av 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 i PBS) 4 ul av anti-Chaoptin antistoff (sluttfortynning 1 : 50) for visualisering av fotoreseptorene.
- Inkuber hjerner i det primære antistoffløsning ved 4 ° CO / N.
- Vask 3 ganger med 200 ul 0,1% PBT med en mikropipette.
- Etter den siste vaskingen, fjerne den 0,1% PBT og tilsett 200 ul av 0,3% PBT inneholdende et sekundært antistoff.
- Inkuber den i mørket ved 4 ° CO / N.
- Vask tre ganger med 200 ul 0,1% PBT med en mikropipette.
- For montering, sette to små dråper (2 ul hver) av et monteringsmedium med en mikropipette på midten av et objektglass på omtrent 2 cm distaNCE fra hverandre.
- Plasser to Dekk, en på hver dråpe, og la en smal åpning mellom dekk på omtrent 0,2 mm.
- Plassere 15 ul av en monteringsmedium på toppen av dekkglass og tilsett hjernen med en mikropipette inn i monteringsmedium.
- Under en dissekere mikroskop, plasserer hjernen med ventral siden opp i den trange åpningen mellom de to dekk (figur 2).
- Plasser et dekkglass på toppen og forsegle kantene av dekk bruker klar neglelakk for å fikse prøven (figur 2).
- Skaff bilder av hjernen med en konfokalmikroskop. Bruk en 63X olje nedsenking objektiv (1,4 NA) og en 2,6x digital zoom. Generere mer enn 20 optiske deler av den andre optikk ganglion medulla med en trinnstørrelse på 0,5 um.
3. generasjon av stedene, Surface objekter, oppstart poeng og endepunkter
- For å kvantifisere tall, jo distribution og delokalisering nivå BRP-GFP puncta, åpne bunken oppnås ved konfokalmikroskopi i bildeanalyse programvare og rekonstruere 3D-bilder (figur 3A). Merk at trinnet i denne studien ble utført med Imaris.
- Identifiser BRP-GFP puncta med spotdeteksjonsmodul for hver R8 axon terminalen.
- Velg "Legg til nye Spots".
- Velg "Segment bare en region av interesse" i algoritmen innstillinger. Velg en R8 axon terminalen i medulla manuelt.
- Velg kilden kanal for BRP-GFP signal.
MERK: R7 og R8 fotoreseptorlidelser aksoner ble immunolabeled med anti-Chaoptin (figur 3A). Bare R8, men inneholder Brp-GFP puncta og kunne dermed lett kan skilles (figur 3A). Videre kan endepunktet av R8 bli identifisert ved tynning av de anti-Chaoptin-positive axoner ved inngangspunkt til M3 medulla laget. - Sett anslått XY diameter to 0,35 mikrometer og krysse av "Bakgrunn subtraksjon" i stedet gjenkjenning.
- Velg "Kvalitet" i filtertype og filtrerer automatisk. Klikk deretter på finish.
- Gjenta fra 3.2.1 t- 3.2.5 for andre R axoner (Figur 3B).
- For å måle delokalisering nivå BRP-GFP i R8 aksoner, generere overflate objekter med "Surface" -funksjon for hver axon (figur 3C).
- Velg "Legg til nye overflater".
- Velg "Segment bare en region av interesse" i algoritmen innstillinger. Deretter velger du en R8 axon terminaler i medulla manuelt.
- Velg kilden kanal for fotoreseptorene.
- Kryss av "Smooth".
- Velg "Absolute Intensitet" i terskelen.
- Sjekk "Aktiver". "Seed Poeng Diameter" er 0,5 mikrometer.
- Velg filter type "Kvalitet" og "Number of voksler", og deretter filtrere autotisk.
- Gå til "Edit" og slette deler av overflater generert på andre ikke-interessante aksoner.
- Gjenta fra 3.3.1 - 3.3.8 for andre R axoner (Figur 3C). Merk Noen overflate gjenstander ble avbrutt på grunn av tynnhet og svakt signal i fotoreseptorene på M2 lag, men de ble likevel ansett som ett enkelt objekt fra start til sluttpunkt.
- Å identifisere distribusjon BRP-GFP puncta langs hver nervecelle i medulla neuropil, definere start-punktet og end-point med målepunktet funksjon (figur 3D).
- Velg "Legg til nye målepunkter". Velg deretter "Edit" og velg "Surface av objekt" å krysse med toppen av overflate stedene.
- Sett målepunkter på toppen av overflate gjenstander av R axoner i M1 lag i orden. Disse er nå definert som start-poeng (Figur 3D).
- Velg "Legg til nye målepunkter".Velg deretter "Edit" og velg "Surface av objekt" å krysse med bunnen av overflaten stedene.
- Sette målepunkter på undersiden av overflate gjenstander av R aksoner i M3 lag i rekkefølge. Disse er nå definert som endepunkter (Figur 3D).
- For å trekke bakgrunnssignalet fra GFP kanalen, generere overflate objekter, flekker, start-poeng og endepunkter for to R axoner i M6 lag (Figur 3E).
- Velg "Legg til nye overflater".
- Velg "Segment bare en region av interesse" i algoritmen innstillinger. Deretter velger du en R7 axon terminalen mellom M5 og M6 lag manuelt.
- Velg kilden kanal på fotoreseptoren.
- Kryss av "Smooth".
- Velg "Absolute Intensitet" i terskelen.
- Velg filter type "Kvalitet" og "Number of volumelementer", deretter filtrere automatisk.
- Velg "Legg til nye flekker";.
- Velg "Skip automatisk oppretting, redigere manuelt".
- Velg "Center of Object" og legge til et sted i det indre området av overflaten objekt generert fra 3.5.1 - 3.5.6.
- Gjenta fra 3.5.1 - 3.5.9 for en annen R7 axon terminalen.
- Velg "Legg til nye målepunkter". Deretter velger du "Rediger" og sette målepunkter på toppen av de to overflate objekter av tuppen av R7 axon terminalen i M6 lag. Disse er nå definert som start-poeng.
- Velg "Legg til nye målepunkter". Deretter velger du "Rediger" og sette målepunkter på bunnen av de to overflate objekter av tuppen av R7 axon terminalen i M6 lag. Disse er nå definert som endepunkter (Figur 3E).
4. Beregning av antall plasser, Fordeling av Spot Frekvens og nivå av berikelse BRP-GFP med en tilpasset Image Data Analysis Software
- Kopier filen"XtquantifySynapseSNR.m" og "funksjoner" -mappen i Imaris XT Matlab mappen. Merk at beregningen i denne studien ble utført med en tilpasset plugin implementert i Matlab. Last ned plugin fra nettsiden ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
- Åpne et datasett med n flekker, n overflater og 2 målepunktobjekter, som hver inneholder n målepunkter (utarbeidet 3,1 til 3,4). Den første målepunktet objekt definerer startposisjonene for alle aksoner. Den andre målepunkt gjenstand definerer endestilling av alle aksoner. Begge målepunktobjekter må ha det samme antall målepunkter (det vil si antallet aksoner).
- Utfør bildebehandling >> CUSTOM> atsushis synapse deteksjon Vs 6.
- Sjekk metadata og endre pikselstørrelser i bildeanalyse programvare i tilfelle det er ikke riktig.
- Velg kanal for performance av intensiteten analyse av flekker regioner og cytoplasmatiske regioner (kanalen med Brp-GFP).
- Definer filnavnet for å eksportere resultatene.
- Definer antallet hyller og axon lengde i prosent. Skriv inn antall binger som "10" og utvalg av binger som "100%" (4A og 4B).
- Definer regioner av flekker og andre cytoplasmatiske regioner for BRP-GFP delokalisering analyse. Oppgi flekker radius som "0,35 mikrometer" og bredde på området som "50 mikrometer". Radiusen flekker definerer regionen for puncta GFP signal (0,35 mikrometer diameter, sentrert på en punctum). Bredden på området definerer regionen for GFP signal i det cytoplasmatiske området (50 mikrometer diameter, sentrert på punctum, men med bare R8 og uten alle spot områder i cytoplasma) (4A og 4C).
- Vent til alle nevroner masker behandlesog eksporteres som PDF-filer (Tall 4B og 4C) og en csv bord for videre analyse i et regneark. Den csv tabellen inkluderer antall flekker, gjennomsnittlig signalintensitet i "cytoplasmatiske området" og den maksimale signalintensitet i "spot" i hver kasse for alle R8 aksoner.
- Åpne et datasett fremstilt på 3.5 for subtraksjon av bakgrunnssignalet.
- Utfør bildebehandling som beskrevet 4,3 til 4,9.
- Beregn gjennomsnittet av det totale antallet og fordelingen av BRP-GFP puncta i et regneark (Tall 4D og 4E).
- Beregne gjennomsnittet av delokalisering BRP-GFP signal i et regneark ved forholdet mellom den gjennomsnittlige intensitet i "cytoplasmatiske området" dividert med den maksimale intensitet i "spot" trekkes av den gjennomsnittlige intensitet i bakgrunnssignalet (figur 4F) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den sammensatte øye Drosophila består ~ 780 ommatidia, som hver inneholder åtte typer fotoreseptorer (R1-8). R7 og R8 prosjekt deres axoner til den andre optikken ganglion, medulla, hvor de danner synapser i lag M6 og M3, henholdsvis 26. For å undersøke effekten av langvarig eksponering for lys på den molekylære sammensetningen av fotoreseptorlidelser R8 aktive soner, vi tok fordel av Star metoden 15. Endogene uttrykk nivåer BRP ble fluorescensmerkede ved å vippe ut stoppkodon i BRP-FSF-GFP med en flippase uttrykt i R8 fotoreseptorene avledet fra sens-FLP. Fluene ble holdt for 1-3 d etter eklosjonshormon i LL, LD eller DD for samme periode på 25 ° C (figur 1A). For å eksponere fluene til 1000 Lux lys, ble fluene satt inn i en akrylharpiks stativ (figur 1 B) og holdt ved den samme avstandfra LED lyskilde i en liten inkubator (figur 1C).
Etter farging ble det dissekerte hjerne anbragt i den smale spalten mellom to dekkglass på et objektglass med den ventrale side av hjernen som vender oppover for visualisering og kvantifisering av BRP-GFP puncta (figur 2). Den resulterende Brp-GFP signal lokalisert til distinkt puncta innenfor R8 i medulla (figur 3A).
Å telle antall og måle fordelingen BRP-GFP puncta, og for å evaluere nivået delokalisering BRP-GFP signal i R8s, ble en tilpasset programvare for bildeanalyse plugin utviklet i en multi-paradigme numerisk datamiljø 9, 27. I begynnelsen ble puncta oppdaget av et sted deteksjonsfunksjon for hver R8 (figur 3B). Deretter overflatenr i hver R8 ble samlet for evaluering av delokalisering nivå (figur 3C). Til slutt har vi definert start-punkter og endepunkter på toppen av M1 sjikt og bunnen av M3 lag på hver fotoreseptoren henholdsvis for å måle fordelingen AZ (figur 3D). Overflate objekter, flekker, start-poeng og endepunkter for to R7 axon terminaler i M6 lag ble også dannet for å trekke bakgrunnssignalet fra GFP-kanal (Figur 3E). Resultatene av antall (figur 4D), distribusjons (figurene 4A, 4B og 4E) og delokalisering nivå (4A, 4C og 4F) blir automatisk beregnet ved hjelp av tilpassede plug-in skrevet på en multi-paradigme numerisk datamiljø . Vi fant at antall Brp diskret puncta ble betydelig redusert i R8 fotoreseptorene av fluer holdt i LL forhold (figur 4D og 4E). Legg tilitionally, fant vi at R8 synapser ble fordelt langs hele aksonal akselen fra M1 til M3 lag, men tettheten var høyere ved M1 og M3 lag (Figur 4E). Den delokalisering nivå BRP-GFP var uendret i alle lysforhold (Figur 4F). Dette er i motsetning til lokalisering av en fluorescerende merket kortversjon BRP (BRP-kort-kirsebær) 28, som, som vi tidligere har rapportert 9 blir tydelig diffust i LL (figur 4G). Vi foreslo at delocalized Brp-kort-kirsebær signal kan være relatert til upassende behandling av BRP-kort fragment etter demontering fra AZ 9. Blant annet testet AZ proteiner, fluorescently tagget DLiprin-a eller Drosophila Rim bindende protein (DRBP) konstruerer vise en reduksjon i antall puncta og en klar delokalisering i LL. I kontrast, fluorescently tagget Dsyd-en eller kakofoni (CAC) gjøre ikke vise en økt cytoplasma signal selv etter LL (figur 4G). Dermed måler systematisk om signalet blir cytoplasma kan være av betydning for å forstå behandlingen av AZ proteiner.
Figur 1: Utarbeidelse av betingelser for eksponering for Definert lysintensitet. (A) lyseksponering protokoller etter eklosjonshormon. DD, kontinuerlig mørket; LD, 12 timer lys / 12 timer mørke; LL, konstant eksponering for lys. Fly hjerner ble dissekert ved tidspunktene angitt i parentes (tilpasset fra en tidligere publikasjon 9). (B) Hetteglassene er innrettet i en tilpasset akryl gjennomsiktig rack. (C) Et akryl stativ og to LED-paneler er satt i en liten inkubator og justert for å eksponere fluene til en lysintensitet på 1000 lux.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fremstilling av prøven. (A) Hele montert hjerne preparater. (B - D) Skjematisk tegning av forberedelsene. (C, D) Tverrsnitt av forberedelsene. Den ventrale siden av hjernen er opp (C) mellom dekk (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Generering av stedene, Surface Objekter og målepunkter.
Figur 4: Kvantifisering av nummer, distribusjon og delokalisering nivå BRP-GFP puncta. (A) Skjematisk tegning av fremgangsmåten anvendes for å måle nivået av delokaliserte Brp-GFP signal i R8. BRP-GFP puncta blir identifisert og to områdene er definert rundt dem: "spot" området og "cytoplasmatiske" område. Linjen forbinder start- og sluttpunktene er inndelt i 10 partisjoner. (B, C) Utgang fra den tilpassede bildeanalyse programvare plugin skrevet i en multi-paradigmet numerisk datamiljø. Hver Brp-GFP punctum koordinat er anslått til en linje som representerer nervecellen fra start-point til sluttpunkt (B). Scale bar, fem mikrometer. BRP-GFP puncta blir identifisert og to områdene er definert rundt dem: "spot" området og "cytoplasma" område (C), som skjematisert i (A). (D - F) bar grafer som sammenligner det totale antall puncta (D), deres fordeling (E) og den delokalisering nivå BRP-GFP per R8 axon (F) i DD (83 axonene / 7 hjerne), LD (107 axonene / 5 hjerne) og LL (226 axoner / 15 Hjerner). (G) Bar grafer som sammenligner delokalisering nivå BRP-kort-kirsebær i LD (74 axonene / 7 hjerne) og LL (70 axonene / 5 hjerne), GFP-DLiprin-α i LD (67 axonene / 7 hjerne) og LL (52 axonene / 6 hjerner), GFP-DRBP i LD (70 axonene / 7 hjerne) og LL (83 axonene / 6 hjerner), GFP-Dsyd-en i LD (48 axonene / 5 hjerne) og LL (69 axoner / 7 hjernen), og Cac-GFP i LD (31 axonene / 5 hjerne) og LL (27 axonene / 5 Hjerner). *** P <0,0001, ** p <0,001, * p <0.0 5, ns p> 0,05; uparet t-test med Welch korreksjon tosidige. Feil Linjen viser standard feil av gjennomsnittet. Den skjematiske tegningen i (A), og dataene i (D), (E) og (G) er innrettet til fra en tidligere publikasjon 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplemental Video: Beskrivelse av databehandling Utføres med Imaris Plugin "Synapse Trafo". Diskusjon av databehandling. Denne filmen inneholder et kort foredrag for å illustrere koordinattransformasjonsdata og data behandlingstrinn som utføres av Imaris plugin "synapse_trafo".5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien viste vi hvordan vi skal forberede lysforholdene å eksponere fluer til en lik lysintensitet. Vi kvantifisert ikke bare antallet en synaptisk markør puncta men kan også romlig løse tettheten av synapser langs axoner og måle delokalisering nivå av markørproteinet i cytoplasmatiske områder. Disse tre analysene tillate oss å vurdere detaljene i synaptiske dynamikk på ett nevron nivå i ulike miljøforhold. Vår protokollen kan tilpasses ulike synaptiske proteiner, men også eventuelle data som inneholder punctate signaler.
Et kritisk trinn i protokollen er monteringen av hjernen. Drosophila fotoreseptorene projisere sine aksoner til andre syns ganglion marg. Hver fotoreseptoren axon kan skannes oversiktlig hvis de monterte hjerner ble riktig plassert på et objektglass. Korrekt montering gjør også valg av fotoreseptorer med bildeanalyse software funksjoner enklere. Hver fotoreseptoren region kan velges manuelt for å telle antallet og delokalisering nivå av puncta. Start- og sluttpunkter er også velges manuelt. Disse preparatene krever en forholdsvis lang tid før man kan gå videre til kvantifisering. Fordelen med R8 aksoner er at de er uforgrenet og hver R8 axon er atskilt. En enkel isolert nevron som dette er anbefalt for disse anvendelser, siden det er nødvendig å definere det nøyaktige område av nervecellen. I tillegg hjelper det å kvitte seg med uspesifikke puncta og overflater som stammer fra andre nerveceller. En begrensning ved denne fremgangsmåten, er imidlertid dybden av z projeksjon. Signalstyrken for puncta blir mindre i dypere lag av z stabelen. Fremstilling av transparente hjerner av vev-clearing metoder slik SeeDB2 29 kan bidra til å overvinne denne begrensning og tillate avbildning av en klar punktformet signal enda dypere i hjernen.
vår protocol kan potensielt brukes til å analysere synaptiske organisasjon på et nanoskala og med levende avbildning. Kombinere super oppløsning bildebehandling (f.eks stimulert emisjon mangel (STED) mikroskopi, stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), foto aktivert lokalisering mikroskopi (PALM), strukturert belysning mikroskopi (SIM) etc.) med teoretisk modellering har utvidet vår forståelse av struktur og molekylær dynamikk av synapser. For eksempel ble det nanoscopic organisering av Brp evaluert ved en enkelt-molekylære oppløsning med super oppløsning bildebehandling ved direkte STORM (d STORM) i Drosophila NMJ 30. Vår protokoll ble tilpasset for kvantifisering av dynamikken i en enkelt aktiv sone molekyl ved en presynaptisk aktiv sone og av en enkelt postsynaptiske reseptor ved en postsynaptisk sone for ytterligere å forstå hvordan synapser er regulert på en mekanistisk nivå. Videre kan vår protokoll benyttes for å visualisere molekylbevegelse ved synapser i levende dyr. Faktisk kan Brp-GFP bli visualisert uten å stole på farging. Dermed har presynaptisk utvikling i R8 axoner blitt fotografert i levende dyr med to-foton mikroskopi 15. Det er mulig å spore den punktformet signal av aktive sone komponenter i levende dyr ved å detektere og analysere flekker ved forskjellige tidspunkter, siden overflatene og posisjoner på spesifikke nerveceller er definert i vår protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for T. Stürner for nyttige rettelser, diskusjoner og kommentarer til manuskriptet; SL Zipursky for å gi flue aksjer; M Schölling for å utføre bildeprosessering. En del av bildeanalyse ble utført ved A. Kakita laboratorium. Dette arbeidet ble støttet av Alexander von Humboldt Foundation og JSP Fellowships for forskning Abroad (AS), JSP Fellows (SH-S.), Grant-In Aid for Oppstart (24800024), på innovative områder (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE kjernefinansiering (GT) og DZNE lysmikroskopi Facility (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
