Summary
Här visar vi hur man kan kvantifiera antalet och geografiska fördelningen av synaptiska aktiva zoner i Drosophila melanogaster fotoreceptorer, markeras med en genetiskt kodad molekylär markör, och deras modulering efter långvarig exponering för ljus.
Abstract
Nervsystemet har den anmärkningsvärda förmågan att anpassa sig och svara på olika stimuli. Denna neurala justering till stor del uppnås genom plasticitet på den synaptiska nivån. Active Zone (AZ) är den region i presynaptiska membranet som förmedlar neurotransmittorfrisättning och består av en tät samling av ställnings proteiner. AZS Drosophila melanogaster (Drosophila) fotoreceptorer undergår molekylär ombyggnad efter långvarig exponering för naturlig omgivande ljus. Sålunda kan nivån av neuronal aktivitet ordna den molekylära sammansättningen av AZ och bidra till regleringen av den funktionella utgången.
Med utgångspunkt från ljusexponering set-up förberedelse till immunohistokemi, detta protokoll beskriver hur att kvantifiera antalet, den rumsliga fördelningen och utlokalisering nivån synaptiska molekyler på AZS i Drosophila fotoreceptorer. Använda bildanalys SOFtware, kluster av GFP-smält AZ komponent Bruchpilot identifierades för varje R8 fotoreceptor (R8) axonet terminalen. Upptäckta Bruchpilot fläckarna automatiskt tilldelas enskilda R8 axoner. För att beräkna fördelningen av frekvens längs axonet, genomförde vi en kundanpassad programvara plugin. Varje axon startpunkten och slutpunkten var manuellt definierade och positionen för varje Bruchpilot plats projicerades på förbindelselinjen mellan start- och slutpunkten. Förutom antalet Bruchpilot kluster, kvantifieras vi också utlokalisering nivån Bruchpilot-GFP inom kluster. Dessa mätningar speglar i detalj spatialt upplösta synaptiska dynamik i en enda neuron under olika miljöförhållanden stimuli.
Introduction
Modulering av synaptisk funktion bidrar till den anmärkningsvärda förmågan hos nervsystemet att exakt svara eller anpassa sig till ändrade miljöstimuli. Justering av presynaptiska vesikler frigör sannolikhet är ett sätt att kontrollera synaptiska styrka en. Synaptisk vesikel frisättning äger rum vid den aktiva zonen (AZ), en specialiserad region i det presynaptiska membranet 2. AZ kännetecknas av en kassett av specifika proteiner 3, 4. De flesta proteiner som bidrar till AZ montering är mycket konserverade i nematoder, insekter och däggdjur 5. Nyligen genomförda studier tyder på att nivån på nervaktivitet reglerar den molekylära sammansättningen av AZ, vilket i sin tur bidrar till regleringen av den funktionella utgångs både in vitro och in vivo 6, 7,> 8. Vi fann tidigare att fotoreceptor AZS genomgår molekylär ombyggnad i Drosophila efter långvarig exponering för naturligt omgivningsljus 9. I detta tillstånd, observerade vi att antalet Bruchpilot (Brp) -positiv AZS reducerades i ljusmätare axoner.
BRP / CAST / ELKS familjen proteiner är grundläggande byggstenar i AZS i ryggradsdjur och ryggradslösa synapser 10. I Drosophila BRP mutanter, framkallade vesikler frisättningen undertrycks 11, 12. De 17 C-terminala aminosyraresterna i Brp är väsentliga för synaptisk vesikel klustring vid Drosophila Neuromuskulära förbindelsen (NMJ) 13, 14. Dessa studier visade centrala roll denna molekyl i AZ organisation och funktion. Med en nyutvecklad genetisk verktyg, Synaptic Märkning med rekombination (Star) BRPkan observeras in vivo i specifika celltyper, på endogena expressionsnivåer och vid en enda synaps upplösning 15. Detta verktyg gör det möjligt att utvärdera de endogena dynamiken i synapser kvantitativt i det komplexa centrala nervsystemet.
Det har gjorts flera studier inklusive synaps kvantifieringar baserade på data erhållna från konfokalmikroskopi. Synaptic ändringar har utvärderats genom att mäta längden, området, volym, densitet och räkna antalet baserad på avancerade program. Till exempel ger gratisprogram ImageJ en kvantifiering metod för total synaptiska området och synaptiska densitet åtgärder på Drosophila NMJ 16. Antalet colocalization platser av pre-och postsynaptiska markörer har kvantifierats med hjälp av plugin "puncta Analyzer" finns på ImageJ mjukvaruplattform 17. Alternativt kan en multi-paradigm numerisk datormiljö baserat program, Synapse Detector (synd), kan automatiskt spåra dendriter av nervceller märkta med en fluorescerande markör, och sedan kvantifierar synaptiska proteinnivåer som en funktion av avstånd från cellkroppen 18. Programvaran Synaptic puncta Analysis (SynPAnal), har utformats för snabb analys av 2D-bilder av nervceller som förvärvats från konfokala eller fluorescerande mikroskopi. Den primära funktionen av denna programvara är automatisk och snabb kvantifiering av densitet och intensitet av protein puncta 19. Nyligen har en automatisk inlärning baserad synaps detekteringsalgoritmen genererats för kvantifiering av synaptisk antal i 3D 20, att dra nytta av 3D-visualisering-Assisted analys (Vaa3D) programvara 21.
Kommersiell bildanalys programvara är också kraftfulla verktyg för synaptiska kvantifieringar. Till exempel, den fluorescensmärkta neurotransmittorreceptorer eller en presynaptisk AZ komponent har kvantifierats i tre dimensioner med en enda synaps upplösning i C. elegans 22 eller Drosophila luktsystemet 23, 24, vilket gör att hundratals synapser att snabbt karakteriseras i ett enda prov.
Här presenterar vi en metod en anpassad bildanalys mjukvara plug-in genomförs i en multi-paradigm numerisk datormiljö som gör det möjligt att analysera halvautomatiskt flera aspekter av AZS, inklusive deras antal, fördelning och graden av anrikning av molekylära komponenter AZ. Således får denna komplexa analys oss att utvärdera dynamiken i synaptiska komponenter i axonet terminaler under olika miljöförhållanden. Vi undersökte effekten av ljusexponering på utgångs synapser av vuxna flyga fotoreceptorer. Förfarandet utförs i tre steg: 1)förberedelse för ljusexponering, 2) dissekering, immunohistokemi och konfokal avbildning, och 3) bildanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll innebär uteslutande arbetar med Drosophila och inte utsätts för lagar djurskydds i Tyskland och Japan.
1. ljusexponering Villkor
- Förbered flugor som bär sensless-flippas (sens-FLP) och bruchpilot-FRT-STOPP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 för visualisering Brp-GFP i ljusmätare R8 neuroner (R8s). Den genomiska locus kodar BRP inom en bakteriell artificiell kromosom (BAC) ändrades för att generera denna BRP-FSF-GFP konstruktion. I flugorna som bär denna modifierade BAC uttrycket av Brp-GFP är under kontroll av de endogena reglerande sekvenserna, men begränsat till R8 fotoreceptorer efter sensless-flippas -medierad avlägsnande av FRT-STOP-FRT kassetten 15. Observera att sens-FLP sällan uttrycker Flippase i R7s.
- Hålla flugorna i en 12 timmar liGHT / 12 h mörker-cykel (LD) vid 25 ° C från larvstadiet tills eclosion (Figur 1A).
- Samla flugorna 0 - 6 h efter eclosion och placera dem i en ny flaska innehållande fluga mat.
- Ställ flaskorna i en transparent ställ av akrylharts med tre steg (en höjd av 41 cm, en bas av 21 cm, en tjocklek av 4 cm och en höjd av 13 cm för varje steg) (Figur 1B).
- Justera avståndet mellan kuggstången och en LED-panel för att ge belysning med en medelintensitet av 1000 lux med användning av en digital ljusmätare (Figur 1C).
- Hålla flugorna för 1-3 d under ett av följande villkor: konstant mörker (DD), 12 timmar ljus / 12 timmar mörker-cykel (LD), eller konstant ljus (LL) vid 25 ° C i en liten inkubator (figurerna 1A och 1C).
2. Dissektion, immunohistokemi och Imaging
- Dissekera fly hjärnor med pincett, fixa dem med 4% formaldehyde och immunostain med den primära antikroppen mot Chaoptin (01:50) och en andra antikropp för visualisering av fotoreceptorer baserade på tidigare test 25. I korthet:
- Förbereda 0,1% Triton X-100 i PBS (0,1% PBT). Denna lösning används för att förbättra antikroppsvävnadspenetration.
- Söva flugor på en CO 2 pad, sortera ut rätt genotyp och överföra dem till en petriskål fylld med 0,1% PBT.
- Stick tången under snabel och dra bort vänster och höger öga respektive med de andra pincett.
- Avlägsna snabel och trakea fäst till hjärnan.
- Överför hjärnan med pincett till ett 1,5 ml rör innehållande 150 mikroliter av 0,1% PBT vid RT.
- Inom 10 min upprepa 2.1.3 - 2.1.5 för att få så många hjärnor som möjligt.
- Tillsätt 50 | il av 16% formaldehyd i röret och blanda genom pipettering.
- Inkubera hjärnorna i fixativ vid rums-temperatur under 50 min.
- Tvätta tre gånger med 200 mikroliter av 0,1% PBT med en mikropipett, att uppmärksamma att lämna hjärnorna i röret.
- Efter den sista tvättningen, avlägsna 0,1% PBT och lägga till den primära antikroppslösningen, framställs på följande sätt: tillsätt till 196 mikroliter av 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 i PBS) 4 mikroliter av anti-Chaoptin antikropp (slutlig spädning 1 : 50) för visualisering av fotoreceptorer.
- Inkubera hjärnan i den primära antikroppen lösning vid 4 ° CO / N.
- Tvätta 3x med 200 mikroliter 0,1% PBT med en mikropipett.
- Efter den sista tvättningen, avlägsna 0,1% PBT och tillsätt 200 pl av 0,3% PBT innehållande en sekundär antikropp.
- Inkubera i mörker vid 4 ° CO / N.
- Tvätta tre gånger med 200 mikroliter av 0,1% PBT med en mikropipett.
- För montering, satte två små droppar (2 | il vardera) av ett monteringsmedium med en mikropipett vid centrum av ett objektglas vid ungefär 2 cm distaiou från varandra.
- Placera två täckglas, en på varje droppe och lämnar en smal spalt mellan täckglasen på ungefär 0,2 mm.
- Placera 15 mikroliter av en monteringsmedium ovanpå täckglas och tillsätt hjärnorna med en mikropipett in i monteringsmedium.
- Under ett dissektionsmikroskop, positionera hjärnorna med den ventrala sidan uppåt in i den smala spalten mellan de två täckglas (Figur 2).
- Placera en täck ovanpå och försegla kanterna på täck hjälp av genomskinligt nagellack för att fixera provet (Figur 2).
- Få bilder av hjärnan med en konfokalmikroskop. Använd en 63x oljeimmersion objektiv (1,4 NA) och en 2,6X digital zoom. Generera mer än 20 optiska sektioner av den andra linsen ganglion medulla med en stegstorlek av 0,5 | im.
3. Generation av fläckar, Surface objekt, Start-poäng och slutpunkter
- För att kvantifiera nummer, distribution och utlokalisering nivån BRP-GFP puncta öppnar stapeln erhålls genom konfokalmikroskopi i bildanalysprogram och återskapa 3D-bilder (figur 3a). Observera att steget i denna studie genomfördes med Imaris.
- Identifiera BRP-GFP puncta av platsen detekteringsmodulen för varje R8 axonet terminalen.
- Välj "Lägg till nya ställen".
- Välj "Segment bara ett område av intresse" i algoritmen inställningar. Välj en R8 axonet terminalen i märgen manuellt.
- Välj källkanalen av BRP-GFP signal.
OBS: R7 och R8 fotoreceptor axoner immunolabeled med anti-Chaoptin (figur 3A). Endast R8, men innehåller Brp-GFP puncta och kunde därför lätt skiljas (figur 3A). Vidare kan slutpunkten av R8 identifieras genom förtunning av anti-Chaoptin-positiva axoner vid inkörsport till M3 medulla skiktet. - Ställ den uppskattade t XY diametero 0,35 um och bocka av "Bakgrund subtraktion" i stället upptäckt.
- Välj "Kvalitet" i filter typ och filtrera automatiskt. Klicka sedan finish.
- Upprepa från 3.2.1 t- 3.2.5 för andra R axoner (Figur 3B).
- För att mäta utlokalisering nivån BRP-GFP i R8 axoner, generera yta objekt med "Surface" funktion för varje axonet (Figur 3C).
- Välj "Lägg till nya ytor".
- Välj "Segment bara ett område av intresse" i algoritmen inställningar. Välj sedan en R8 axon terminaler i märgen manuellt.
- Välj källkanalen av fotoreceptorer.
- Bocka av "Smooth".
- Välj "Absolute Intensity" i tröskeln.
- Kontrollera "Aktivera". "Groddpunkter Diameter" är 0,5 ^ m.
- Välj filtret Typ "Kvalitet" och "Antal voxlar", och sedan filtrera abonnemangstiskt.
- Gå till "Edit" och ta bort bitar av ytor som genereras på andra icke-intressanta axoner.
- Upprepa 3.3.1 - 3.3.8 för andra R axoner (Figur 3C). Notera några ytliga objekt avbröts på grund av tunnhet och svag signal i fotoreceptorer på M2 lager, men de var fortfarande betraktas som ett enda objekt från start till slutpunkter.
- Att identifiera fördelningen BRP-GFP puncta längs varje neuron i märgen neuropil definierar startpunkten och slutpunkten med mätpunkten funktionen (figur 3D).
- Välj "Lägg till nya mätpunkter". Välj sedan "Redigera" och välj "Surface objekt" att skära toppen av ytan objekt.
- Sätt mätpunkter ovanpå ytan föremål av R axoner i M1 lager i ordning. Dessa definieras nu som startpunkter (figur 3D).
- Välj "Lägg till nya mätpunkter".Välj sedan "Redigera" och välj "Surface objekt" att skära ned på ytan objekt.
- Sätta mätpunkter på botten av ytan föremål av R axoner i M3 skikt i ordning. Dessa definieras nu som slutpunkter (figur 3D).
- Att subtrahera bakgrundssignalen från GFP kanalen generera ytan objekt, fläckar, nystarpunkter och slutpunkter för två R axoner i M6 skikt (figur 3E).
- Välj "Lägg till nya ytor".
- Välj "Segment bara ett område av intresse" i algoritmen inställningar. Välj sedan en R7 axonet terminalen mellan M5 och M6 lagret manuellt.
- Välj källkanalen av ljusmätare.
- Bocka av "Smooth".
- Välj "Absolute Intensity" i tröskeln.
- Välj filtret Typ "Kvalitet" och "Antal voxlar", sedan filtrera automatiskt.
- Välj "Lägg till nya ställen";.
- Välj "Hoppa skapas automatiskt, manuellt redigera".
- Välj "Center of Object" och lägga till en plats i den inre delen av ytan objektet som genereras från 3.5.1 - 3.5.6.
- Upprepa 3.5.1 - 3.5.9 för en annan R7 axonet terminalen.
- Välj "Lägg till nya mätpunkter". Välj sedan "Redigera" och sätta mätpunkter ovanpå de två ytan föremål för toppen av R7 axonet terminalen i M6 skikt. Dessa definieras nu som startpunkter.
- Välj "Lägg till nya mätpunkter". Välj sedan "Redigera" och sätta mätpunkter på botten av de två yt föremål av spetsen på R7 axonet terminalen i M6-skiktet. Dessa definieras nu som slutpunkter (figur 3E).
4. Beräkning av antal punkter, Fördelning av frekvens och nivå för att berika Brp-GFP med en anpassad Image Data Analysis Software
- Kopiera filen"XtquantifySynapseSNR.m" och "funktioner" mapp i Matlab mappen Imaris XT. Observera att beräkningen i denna studie genomfördes med en anpassad plugin implementeras i Matlab. Ladda ner plugin från webbplatsen ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
- Öppna en datamängd med n fläckar, n ytor och 2 mätpunkt objekt, var och en innehållande n mätpunkter (framställda 3,1-3,4). Den första mätpunkten objekt definierar positionerna start för alla axoner. Den andra mätpunkten objekt definierar slutpositionen för alla axoner. Båda mätningspunktobjekt måste ha samma antal mätpunkter (som är antalet axoner).
- Utför bildbehandling >> Custom> atsushis synaps upptäckt Vs 6.
- Kontrollera metadata och ändra pixelstorlekar inom bildanalys programvara i fall det är inte korrekt.
- Välj kanal för performance av intensiteten analys av fläckar regioner och cytoplasmiska regioner (kanalen med Brp-GFP).
- Definiera filnamnet för export resultaten.
- Definiera antalet lådor och axon längd i procent. Ange antalet fack som "10" och antal fack som "100%" (figurerna 4A och 4B).
- Definiera regionerna av fläckar och andra cytoplasmiska regioner för utlokalisering analys BRP-GFP. Ange fläckar radie som "0,35 um" och bredd av omgivningen som "50 pm". Fläckarna radie definierar regionen för puncta GFP-signal (0,35 um diameter centrerad på en punctum). Bredden på omgivningen definierar regionen för GFP-signal i den cytoplasmiska området (50 um diameter centrerad på punctum, men med endast R8 och exklusive alla spot områden i cytoplasman) (figurerna 4A och 4C).
- Vänta tills alla neuron masker bearbetasoch exporteras som PDF-filer (figurerna 4B och 4C) och en csv bord för vidare analys i ett kalkylblad. Csv Tabellen omfattar antalet fläckar, den genomsnittliga signalintensiteten i "cytoplasmiska området" och den maximala signalstyrkan i "spot" i varje fack för alla R8 axoner.
- Öppna en datamängd som framställts i 3,5 för subtraktion av bakgrundssignalen.
- Utför bildbehandling som beskrivs 4,3-4,9.
- Beräkna genomsnittet av det totala antalet och fördelningen av BRP-GFP puncta i ett kalkylblad (Figurerna 4D och 4E).
- Beräkna genomsnittet av delokalisering av Brp-GFP-signal i ett kalkylblad genom förhållandet av den genomsnittliga intensiteten i "cytoplasmiska området" dividerad med den maximala intensiteten i "spot" subtraheras från medelintensiteten i bakgrundssignal (Figur 4F) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Föreningen öga Drosophila omfattar ~ 780 ommatidia, var och en innehållande åtta typer av fotoreceptorer (R1-8). R7 och R8 projekt sina axoner till den andra linsen ganglion, medulla, där de bildar synapser i lager M6 och M3, respektive 26. För att undersöka effekten av långvarig exponering för ljus på den molekylära sammansättningen av fotoreceptor R8 aktiva zoner, tog vi fördel av stjärnan metoden 15. Endogena expressionsnivåer BRP var fluorescerande genom att bläddra ut stoppkodonet i BRP-FSF-GFP med en flippas uttryckt i R8 fotoreceptorer som härrör från sens-FLP. Flugorna hölls under 1-3 dygn efter eclosion i LL, LD eller DD för samma period vid 25 ° C (Figur 1A). Att utsätta flugor till 1000 lux ljus var flugorna in i ett akrylharts rack (Figur 1B) och hålls på samma avståndfrån LED-ljuskällan i en liten inkubator (Figur 1C).
Efter immunfärgning, dissekerades hjärnorna placerades i den smala spalten mellan två täckglas på ett objektglas med den ventrala sidan av hjärnorna vända uppåt för visualisering och kvantifiering av BRP-GFP puncta (Figur 2). Den resulterande Brp-GFP signal lokaliserad till distinkt puncta inom R8 i märgen (figur 3A).
Att räkna antalet och mäta fördelningen BRP-GFP puncta, och att utvärdera utlokalisering nivån BRP-GFP signal i R8s, var en anpassad mjukvara för bildanalys plugin utvecklats i en multi-paradigm numerisk datormiljö 9, 27. Först var puncta detekteras av en plats detekteringsfunktion för varje R8 (Figur 3B). Därefter ytas varje R8 genererades för utvärdering av omlokalisering nivån (Figur 3C). Slutligen fastställde vi nystarpunkter och slutpunkter på toppen av M1 skiktet och bottnen av M3 skikt på vardera fotoreceptor respektive för att mäta AZ utgåvan (Figur 3D). Surface objekt, fläckar, nystarpunkter och slutpunkter för två R7 axon terminaler i M6 skiktet också genereras för att subtrahera bakgrundssignalen från GFP-kanal (figur 3E). Resultaten av antalet (Figur 4D), distributionen (figurerna 4A, 4B och 4E) och utlokalisering nivå (figurerna 4A, 4C och 4F) beräknas automatiskt av den anpassade plug-in skriven i en multi-paradigm numerisk datormiljö . Vi fann att antalet Brp diskreta puncta reducerades signifikant i R8 fotoreceptorer av flugor hålls i LL förhållanden (figur 4D och 4E). Lägg tillitionally, fann vi att R8 synapser delades ut längs hela axonal axeln från M1 till M3 skikt, men densiteten var högre vid M1 och M3 lager (Figur 4E). Den utlokalisering nivå BRP-GFP var oförändrad i alla ljusförhållanden (Figur 4F). Detta är i motsats till lokaliseringen av en fluorescensmärkta kort version av Brp (Brp-short-cherry) 28, som, såsom vi tidigare rapporterat 9 blir tydligt diffunderat i LL (Figur 4G). Vi föreslog att delokaliserad Brp-kort körsbär signalen kan vara relaterade till olämplig behandling av BRP-kort fragment efter demontering från AZ 9. Bland andra testade AZ proteiner, fluorescerande taggade DLiprin-a eller Drosophila Rim bindande protein (DRBP) konstruktioner uppvisar en minskning av antalet puncta och en tydlig delokalisering i LL. I kontrast, fluorescensmärkta Dsyd-1 eller Cacophony (CAC) do inte visa en ökad cytoplasma signal även efter LL (Figur 4G). Således mäter systematiskt om signalen blir cytoplasma kan vara av betydelse för att förstå behandlingen av AZ-proteiner.
Figur 1: Beredning av Villkor för Exponering för Defined ljusintensitet. (A) ljusexponering protokoll efter eclosion. DD kontinuerlig mörker; LD, 12 timmar ljus / 12 timmar mörker; LL, konstant exponering för ljus. Fly hjärnor dissekerades vid de tider som anges inom parentes (Anpassat från en tidigare publikation 9). (B) Flaskorna är inriktade i en anpassad akryl transparent rack. (C) Den akryl rack och två LED paneler läggs i en liten inkubator och justeras för att exponera flugorna till en ljusintensitet av 1000 lux.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Preparation av prover. (A) sammans monterat hjärn preparat. (B - D) Schematisk bild av förberedelserna. (C, D) Tvärsnitt av beredningarna. Den ventrala sidan av hjärnorna är upp (C) mellan täckglas (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Generation av fläckar, Surface objekt och mätpunkter.
Figur 4: Kvantifiering av nummer, distribution och utlokalisering Nivå Brp-GFP puncta. (A) Schematisk bild av förfarandet som används för att mäta graden av delokaliserade Brp-GFP signal i R8. BRP-GFP puncta identifieras och två områden definieras runt dem: "spot" område och "cytoplasmiska" område. Linjen mellan start- och slutpunkter är indelad i 10 partitioner. (B, C) Utmatning från den anpassade bildanalysmjukvara plugin skriven i en multi-paradigm numerisk datormiljö. Varje Brp-GFP punctum koordinaten beräknas en linje som representerar neuron från start-point till slutpunkten (B). Skala bar, 5 pm. BRP-GFP puncta identifieras och två områden definieras runt dem: den "spot", och den "cytoplasmiska" område (C), som schematiskt i (A). (D - F) Stapeldiagram jämföra det totala antalet puncta (D), distribution (E) och utlokalisering nivån BRP-GFP per R8 axonet (F) i DD (83 axoner / 7 hjärnor), LD (107 axoner / 5 hjärnor) och LL (226 axoner / 15 hjärnor). (G) Stapeldiagram som jämför utlokalisering nivån BRP-kort körsbär i LD (74 axoner / 7 hjärnor) och LL (70 axoner / 5 hjärnor), GFP-DLiprin-α i LD (67 axoner / 7 hjärnor) och LL (52 axoner / 6 hjärnor), GFP-DRBP i LD (70 axoner / 7 hjärnor) och LL (83 axoner / 6 hjärnor), GFP-Dsyd-1 i LD (48 axoner / 5 hjärnor) och LL (69 axoner / 7 hjärnor), och Cert-GFP i LD (31 axoner / 5 hjärnor) och LL (27 axoner / 5 hjärnor). *** P <0,0001, ** p <0,001, * p <0,0 5, ns p> 0,05; oparade t-test med Welch korrigering tvåsidiga. Felstapel visar standardfel av medelvärdet. Den schematiska ritningen i (A) och data i (D), (E) och (G) är anpassade från en tidigare publikation 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Video: Beskrivning av databearbetning utförs med Imaris Plugin "Synapse Trafo". Diskussion om databehandling. Denna video innehåller en kort föreläsning för att illustrera koordinattransformations och databearbetningssteg som utförs av Imaris plugin "synapse_trafo".5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie visade vi hur man förbereder ljusförhållandena för att exponera flugor till en lika stor ljusintensitet. Vi kvantifierade inte bara antalet av en synaptisk markör puncta men skulle också kunna rumsligt lösa densiteten hos synapser längs axoner och mäta delokalisering nivå av markörproteinet i cytoplasmiska områdena. Dessa tre bedömningar ger oss möjlighet att utvärdera information om synaptiska dynamik vid enstaka neuron nivå i olika miljöförhållanden. Vår protokoll kan anpassas till olika synaptiska proteiner utan även alla data som innehåller punktat signaler.
Ett kritiskt steg inom protokollet är monteringen av hjärnor. Drosophila fotoreceptorer projicera sina axoner till den andra linsen ganglion märgen. Varje fotoreceptor axon kan skannas rakt om de monterade hjärnor korrekt placerad på ett objektglas. Korrekt montering gör också valet av fotoreceptorer med bildanalys software funktioner lättare. Varje ljusmätare region måste väljas manuellt för att räkna antalet och utlokalisering nivå puncta. Start- och slutpunkter också väljas manuellt. Dessa preparat kräver en relativt lång tid innan man kan gå vidare till kvantifiering. Fördelen med R8 axoner är att de är ogrenade och varje R8 axon är separat. En enkel isolerad neuron som denna rekommenderas för dessa applikationer eftersom det är nödvändigt att definiera den exakta delen av neuron. Dessutom hjälper det att bli av med icke-specifik puncta och ytor som härrör från andra nervceller. En begränsning i detta tillvägagångssätt, är dock djupet på z projektion. Signalstyrkan i puncta blir mindre i djupare skikt av z stacken. Förbereda transparenta hjärnor genom vävnads rensa metoder såsom en SeeDB2 29 kan hjälpa till att övervinna denna begränsning och medger avbildning av en tydlig punktat signal ännu djupare i hjärnan.
vår protocol kan potentiellt användas för att analysera synaptiska organisation på en nanoskala och med levande avbildning. Kombinera superupplösning (t.ex. stimulerad utarmning emission (STED) mikroskopi, stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM), foto aktiverad lokalisering mikroskopi (PALM), strukturerad belysning mikroskopi (SIM) etc.) med teoretisk modellering har avancerat vår förståelse av struktur och molekyldynamik av synapser. Till exempel var det nanoskopisk organisation BRP utvärderas vid en enda molekyl upplösning med superupplösning genom direkt STORM (d STORM) på Drosophila NMJ 30. Våra protokoll anpassades för kvantifiering av dynamiken i en enda aktiv zon molekyl på en presynaptiska aktiva zonen och en enda postsynaptisk receptor på en postsynaptisk zon för att ytterligare förstå hur synapser regleras på en mekanistisk nivå. Dessutom skulle våra protokoll användas för att visualisera molekylrörelse vid synapser i levande djur. I själva verket kan Brp-GFP visualiseras utan att förlita sig på immunfärgning. Sålunda har presynaptiska utveckling i R8 axoner har avbildats i levande djur med två-foton mikroskopi 15. Det är möjligt att spåra punktat signalen av aktiva zon komponenter i levande djur genom att detektera och analysera fläckar vid olika tidpunkter eftersom ytorna och positionerna för specifika neuroner definieras i våra protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för T. Stürner för hjälp korrigeringar, diskussioner och kommentarer om manuskriptet; SL Zipursky för att ge fly lager; M Schölling för att utföra bildbehandling. En del av bildanalysen utfördes vid A. Kakita labb. Detta arbete stöddes av Alexander von Humboldt-stiftelsen och JSPS stipendier för forskning utomlands (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In- Stöd till Start-up (24.800.024), på innovativa områden (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE basfinansiering (GT) och DZNE ljusmikroskopi Facility (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
