Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحليل متشابك التحوير من Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/55176
Automatic Translation
1,2,5, 3, 4, 1,2, *4, *5
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)
* These authors contributed equally

Summary

نحن هنا تظهر كيفية تحديد عدد والتوزيع المكاني للمناطق نشطة متشابك في المستقبلات الضوئية البطن ذبابة الفاكهة، سلط الضوء مع الواسمات الجزيئية المشفرة وراثيا، وتعديل على بعد التعرض لفترات طويلة للضوء.

Abstract

الجهاز العصبي لديه قدرة ملحوظة على التكيف والاستجابة للمؤثرات المختلفة. ويتحقق هذا التعديل العصبي إلى حد كبير من خلال اللدونة على مستوى متشابك. المنطقة النشطة (أ-ي) هي المنطقة في الغشاء قبل المشبكي التي تتوسط الافراج عن العصبي ويتكون من مجموعة كثيفة من البروتينات سقالة. AZS من ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) المستقبلات الضوئية تخضع لإعادة الجزيئي بعد التعرض لفترات طويلة للضوء المحيط الطبيعي. وبالتالي فإن مستوى نشاط الخلايا العصبية يمكن إعادة ترتيب التركيب الجزيئي للمن الالف إلى الياء والمساهمة في تنظيم الانتاج وظيفية.

بدءا من التعرض للضوء إعداد انشاء لالمناعية، تفاصيل هذا البروتوكول كيفية تحديد عدد، والتوزيع المكاني، ومستوى تمركز جزيئات متشابك في AZS في المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة. عن طريق تحليل الصور البرمجtware، تم تحديد مجموعات من المكون AZ-تنصهر GFP Bruchpilot لكل R8 مبصرة (R8) محطة محور عصبي. تم تعيين الكشف عن البقع Bruchpilot تلقائيا إلى محاور R8 الفردية. لحساب توزيع تردد بقعة على طول المحور، نفذنا البرنامج المساعد البرمجيات المخصصة. وقد تم تحديد بداية نقطة لكل محور عصبي ونقطة النهاية يدويا، وكان من المتوقع على الخط الذي يربط بين بداية ونقطة النهاية موقف كل بقعة Bruchpilot. إلى جانب عدد من مجموعات Bruchpilot، ونحن أيضا كميا مستوى تمركز Bruchpilot-GFP ضمن مجموعات. وتعكس هذه القياسات بالتفصيل ديناميات متشابك حل مكانيا في الخلايا العصبية واحدة تحت ظروف بيئية مختلفة للمؤثرات.

Introduction

التشكيل وظيفة متشابك يساهم في قدرة ملحوظة في الجهاز العصبي للرد على وجه التحديد أو التكيف مع تغير المحفزات البيئية. ضبط قبل المشبكي إطلاق سراح الحويصلة احتمال هي طريقة واحدة للسيطرة على قوة متشابك 1. متشابك الافراج عن حويصلة يحدث في المنطقة النشطة (AZ)، وهي منطقة متخصصة للغشاء قبل المشبكي 2. يتميز من الألف إلى الياء من قبل كاسيت بروتينات معينة 3، 4. معظم البروتينات التي تسهم في التجمع من الالف إلى الياء والحفظ جدا في الديدان الخيطية والحشرات والثدييات 5. وتشير الدراسات الحديثة إلى أن مستوى نشاط الخلايا العصبية وينظم التركيب الجزيئي من الألف إلى الياء، وهذا بدوره يساهم في تنظيم الانتاج وظيفية على حد سواء في المختبر والمجراة 6، 7،> 8. لقد وجدنا سابقا أن AZS مبصرة تخضع إعادة الجزيئي في ذبابة الفاكهة بعد التعرض لفترات طويلة للضوء المحيط الطبيعية 9. في هذه الحالة، لاحظنا أن عدد Bruchpilot (بدر) -positive AZS تم تخفيض في المحاور مبصرة.

البروتينات بدر / CAST / عائلة الايائل هي اللبنات الأساسية للAZS في الفقاريات واللافقاريات نقاط الاشتباك العصبي 10. في المسوخ BRP ذبابة الفاكهة، أثار إطلاق سراح الحويصلة يتم منعها 11 و 12. بقايا الأحماض الأمينية C-محطة 17 من بدر ضرورية لتجميع حويصلة متشابك في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) 13، 14. وأظهرت هذه الدراسات على الدور المحوري لهذا الجزيء في المؤسسة من الألف إلى الياء وظيفة. مع أداة الوراثية التي تم تطويرها مؤخرا، متشابك توصيف مع إعادة التركيب (STAR)، بدريمكن ملاحظتها في الجسم الحي في أنواع معينة من الخلايا، في مستويات التعبير الذاتية وعلى قرار المشبك واحد 15. هذه الأداة يجعل من الممكن لتقييم ديناميات الذاتية من نقاط الاشتباك العصبي كميا في الجهاز العصبي المركزي معقدة.

كانت هناك العديد من الدراسات بما في ذلك التحديد الكمي المشبك استنادا إلى بيانات تم الحصول عليها من الفحص المجهري متحد البؤر. تم تقييم التعديلات متشابك من خلال قياس الطول، المنطقة، وحجم، وكثافة وتحصي عدد استنادا إلى تطبيقات البرمجيات المتطورة. على سبيل المثال، يوفر يماغيج مجانية طريقة القياس الكمي لمجموع مساحة متشابك والتدابير كثافة متشابك في ذبابة الفاكهة NMJ 16. وقد تم تقدير عدد المواقع colocalization من علامات قبل وبعد المشبكي باستخدام البرنامج المساعد "نقاط ومحلل" متاح على منصة برنامج ImageJ 17. بدلا من ذلك، متعدد قدم المساواةبرنامج يستند إلى adigm العددية بيئة الحوسبة، المشبك الكاشف (SYND)، ويمكن تتبع تلقائيا التشعبات من الخلايا العصبية المسماة مع علامة فلوري، ثم يقيس مستويات بروتين متشابك بوصفها وظيفة من المسافة من جسم الخلية 18. وقد تم تصميم البرنامج متشابك تحليل نقاط و(SynPAnal)، لتحليل السريع للصور 2D من الخلايا العصبية المكتسبة من متحد البؤر المجهري أو الفلورسنت. وتتمثل المهمة الرئيسية لهذا البرنامج هي الكمي التلقائي والسريع في كثافة وشدة من البروتين نقاط و19. مؤخرا، تم إنشاء القائم على التعلم خوارزمية الكشف المشبك التلقائي لتقدير عدد متشابك في 3D 20، والاستفادة من البرنامج المساعد التصور-3D تحليل (Vaa3D) 21.

صورة التجارية برامج التحليل أيضا أدوات قوية لالتحديد الكمي متشابك. على سبيل المثال، fluorescentlyتم كميا مستقبلات الناقل العصبي المسمى أو مكون من الالف إلى الياء قبل المشبكي في ثلاثة أبعاد مع الدقة المشبك واحد في C. ايليجانس 22 أو نظام ذبابة الفاكهة حاسة الشم 23، 24، مما سمح لمئات من نقاط الاشتباك العصبي إلى أن تتسم بسرعة في عينة واحدة.

هنا، فإننا نقدم وسيلة من برنامج تحليل صورة مخصصة المكونات في تنفيذها في عدة نموذج بيئة الحوسبة العددية التي تسمح لتحليل جوانب شبه تلقائيا متعددة من AZS، بما في ذلك عددهم والتوزيع ومستوى التخصيب من المكونات الجزيئية لل الألف إلى الياء. وهكذا، هذا التحليل المعقد سمح لنا لتقييم ديناميات مكونات متشابك في محطات محوار تحت ظروف بيئية مختلفة. نحن التحقيق في تأثير التعرض للضوء على نقاط الاشتباك العصبي الناتج من خلايا مستقبلة للضوء ذبابة الكبار. يتم تنفيذ الإجراء في ثلاث خطوات: 1)استعدادا لالتعرض للضوء، 2) تشريح، المناعية والتصوير متحد البؤر، و3) تحليل الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الإجراءات التجريبية المبينة في هذا البروتوكول تنطوي على العمل بشكل حصري مع ذبابة الفاكهة ولا تخضع لقوانين الرفق بالحيوان في ألمانيا واليابان.

1. شروط التعرض للضوء

  1. إعداد الذباب التي تحمل sensless-flippase (السيناتور-FLP) وbruchpilot-FRT-إيقاف-FRT-GFP (بدر-بينه وبين GFP) 15 لتصور بدر-GFP في مبصرة الخلايا العصبية R8 (R8s). تم تعديل بدر ترميز موضع الجينومية داخل الصبغي الاصطناعي البكتيري (BAC) لتوليد هذا البناء بدر-بينه وبين GFP. في الذباب يحمل هذا BAC تعديل تعبير عن بدر-GFP تحت سيطرة تسلسل التنظيمية الذاتية، ولكن تقتصر على المستقبلات الضوئية R8 بعد sensless-flippase إزالة بوساطة من الكاسيت FRT-إيقاف-FRT 15. لاحظ أن السيناتور-FLP نادرا ما تعبر عن flippase في R7S.
  2. الحفاظ على الذباب في لى 12 ساعةGHT / 12 ح دورة الظلام (LD) عند 25 درجة مئوية من مرحلة اليرقة حتى eclosion (الشكل 1A).
  3. جمع الذباب 0-6 ساعة بعد eclosion ووضعها في قارورة جديدة تحتوي على المواد الغذائية الطاير.
  4. تعيين قارورة الى حامل شفافة مصنوعة من راتنج الأكريليك مع ثلاث خطوات (ارتفاع 41 سم، وقاعدة من 21 سم، بسمك 4 سم وارتفاعه 13 سم لكل خطوة) (الشكل 1B).
  5. ضبط المسافة بين الرف ولوحة الصمام لتوفير الإضاءة مع كثافة متوسطة من 1000 لوكس باستخدام ضوء متر الرقمية (الشكل 1C).
  6. الحفاظ على الذباب ل1-3 د تحت أحد الشروط التالية: ظلام مستمر (DD)، 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام (LD)، أو ضوء ثابت (LL) عند 25 درجة مئوية في حاضنة صغيرة (الشكلان 1A و1C).

2. تشريح، المناعية والتصوير

  1. تشريح أدمغة الطاير مع ملقط، اصلاحها مع 4٪ فوrmaldehyde وimmunostain مع الأجسام المضادة الأولية ضد Chaoptin (01:50)، والأجسام المضادة الثاني لرؤية خلايا مستقبلة للضوء على أساس الإجراءات التجريبية السابقة 25. موجز:
    1. تحضير 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (0.1٪ PBT). يستخدم هذا الحل لتحسين اختراق الأنسجة الأجسام المضادة.
    2. تخدير الذباب على وسادة CO 2، فرز الوراثي الصحيح ونقلها إلى طبق بتري مليئة 0.1٪ PBT.
    3. عصا ملقط تحت خرطوم وسحب قبالة اليمين واليسار عيون على التوالي مع ملقط الأخرى.
    4. إزالة خرطوم والقصبة الهوائية التي تعلق على الدماغ.
    5. نقل الدماغ مع ملقط في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 150 ميكرولتر من 0.1٪ PBT في RT.
    6. في غضون 10 دقيقة من تكرار 2.1.3 - 2.1.5 للحصول على أكبر عدد ممكن من العقول وقت ممكن.
    7. إضافة 50 ميكرولتر من 16٪ الفورمالديهايد في أنبوب ومزيج من قبل pipetting.
    8. احتضان العقول في تثبيتي في الغرفةدرجة الحرارة لمدة 50 دقيقة.
    9. يغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBT مع micropipette، مع إيلاء اهتمام لمغادرة العقول في الأنبوب.
    10. بعد غسل الماضي، وإزالة PBT 0.1٪ وإضافة محلول الأجسام المضادة الأولية، أعدت على النحو التالي: إضافة إلى 196 ميكرولتر من 0.3٪ PBT (0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) 4 ميكرولتر من مكافحة Chaoptin الأجسام المضادة (التخفيف النهائي 1 : 50) لرؤية خلايا مستقبلة للضوء.
    11. احتضان العقول في حل الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات CO / N.
    12. غسل 3X مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBT مع micropipette.
    13. بعد غسل الماضي، وإزالة PBT 0.1٪ وإضافة 200 ميكرولتر من PBT 0.3٪ تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية.
    14. احتضان في الظلام في 4 درجات CO / N.
    15. يغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ PBT مع micropipette.
  2. لتركيب، ووضع قطرتين الصغيرة (2 ميكرولتر لكل منهما) من وسط تصاعد مع micropipette في وسط شريحة المجهر في حوالي 2 سم distaالامتحانات التنافسية الوطنية عن بعضها البعض.
  3. وضع اثنين coverslips، واحدة على كل قطرة وترك فجوة ضيقة بين لل coverslips ما يقرب من 0.2 مم.
  4. ضع 15 ميكرولتر من المتوسطة المتزايدة على رأس ساترة وإضافة أدمغة مع micropipette في المتوسطة المتزايدة.
  5. تحت المجهر تشريح، ضع العقول مع الجانب بطني حتى في تضييق الفجوة بين لل coverslips اثنين (الشكل 2).
  6. وضع ساترة على رأس وختم حواف ساترة باستخدام طلاء الأظافر واضحة لإصلاح العينة (الشكل 2).
  7. الحصول على صور من أدمغة مع المجهر متحد البؤر. استخدام عدسة 63X الغمر النفط موضوعية (1.4 NA) وتقريب رقمي 2.6X. توليد أكثر من 20 المقاطع البصرية من ثاني النخاع العقدة البصرية مع حجم خطوة من 0.5 ميكرون.

3. الجيل من البقع، كائنات السطحية، بدء نقاط ونهاية نقاط

  1. لتحديد عدد وتنقيبibution ومستوى تمركز بدر-GFP نقاط و، فتح كومة التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر في صورة برامج التحليل وإعادة تكوين صور 3D (الشكل 3A). لاحظ أن الخطوة في هذه الدراسة أجريت مع Imaris.
  2. التعرف على نقاط وبدر-GFP من قبل وحدة كشف النقاط لكل محطة محور عصبي R8.
    1. حدد "إضافة البقع الجديدة".
    2. حدد "الجزء فقط منطقة الفائدة" في إعدادات الخوارزمية. حدد محطة محور عصبي R8 في النخاع يدويا.
    3. حدد القناة مصدر الإشارة بدر-GFP.
      ملاحظة: تم immunolabeled وR7 وR8 محاور مبصرة مع مكافحة Chaoptin (الشكل 3A). فقط R8، على الرغم من يحتوي بدر-GFP نقاط ووبالتالي يمكن تمييزها بسهولة (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد نقطة نهاية R8 من ترقق المحاور المعادية Chaoptin إيجابية عند نقطة دخول طبقة النخاع M3.
    4. تعيين يقدر تي قطر XYس 0.35 ميكرون والتحقق من "الطرح الخلفية" في كشف النقاط.
    5. حدد "الجودة" في نوع فلتر وفلتر تلقائيا. ثم انقر فوق إنهاء.
    6. كرر من 3.2.1 تي 3.2.5 لمحاور R الأخرى (الشكل 3B).
  3. لقياس مستوى تمركز بدر-GFP في محاور R8، إنشاء كائنات السطح مع وظيفة "السطحية" لكل محور عصبي (الشكل 3C).
    1. حدد "إضافة السطوح جديدة".
    2. حدد "الجزء فقط منطقة الفائدة" في إعدادات الخوارزمية. ثم حدد محطات محوار R8 في النخاع يدويا.
    3. حدد القناة مصدر من المستقبلات الضوئية.
    4. التحقق من خارج "السلس".
    5. حدد "الكثافة المطلقة" في العتبة.
    6. تحقق "تمكين". "بذور نقاط القطر" هو 0.5 ميكرون.
    7. حدد تصفية نوع "الجودة" و "عدد voxels"، ومن ثم تصفية ومحأتوماتيكيا.
    8. انتقل إلى "تحرير" وحذف أجزاء من الأسطح التي تم إنشاؤها على محاور أخرى غير مثيرة للاهتمام.
    9. كرر من 3.3.1 - 3.3.8 لمحاور R الأخرى (الشكل 3C). توقفت ملاحظة بعض الكائنات السطح بسبب ركاكة وإشارة ضعيفة في المستقبلات الضوئية في طبقة M2، لكنها ما زالت تعتبر كائن واحد من البداية إلى نقطة النهاية.
  4. لتحديد توزيع نقاط وبدر-GFP طول كل الخلايا العصبية في النخاع neuropil، وتحديد بداية نقطة ونقطة النهاية مع وظيفة نقطة قياس (الشكل 3D).
    1. حدد "إضافة نقاط القياس الجديدة". ثم حدد "تحرير" وحدد "سطح القطعة" لتتقاطع مع الجزء العلوي من الكائنات السطح.
    2. وضع النقاط القياس على رأس الأشياء السطحية من المحاور R في طبقة M1 في النظام. وتعرف هذه الآن عن البدء في نقطة (الشكل 3D).
    3. حدد "إضافة نقاط القياس الجديدة".ثم حدد "تحرير" وحدد "سطح القطعة" لتتقاطع مع الجزء السفلي من الكائنات السطح.
    4. وضع النقاط القياس على الجزء السفلي من الأشياء السطحية من المحاور R في طبقة M3 في النظام. وتعرف هذه الآن كما في نهاية نقاط (الشكل 3D).
  5. لطرح إشارة الخلفية من القناة GFP، إنشاء كائنات السطح، والبقع، بدء نقاط والنقاط النهائية لمدة محاور R في M6 طبقة (الشكل 3E).
    1. حدد "إضافة السطوح جديدة".
    2. حدد "الجزء فقط منطقة الفائدة" في إعدادات الخوارزمية. ثم حدد محطة محور عصبي R7 بين طبقة M5 و M6 يدويا.
    3. حدد القناة مصدر مبصرة.
    4. التحقق من خارج "السلس".
    5. حدد "الكثافة المطلقة" في العتبة.
    6. حدد تصفية نوع "الجودة" و "عدد voxels"، ثم تصفية تلقائيا.
    7. حدد "إضافة البقع الجديدة"،.
    8. حدد "تخطي إنشاء التلقائي، تعديل يدويا".
    9. حدد "مركز القطعة"، وتضيف بقعة في المنطقة الداخلية من وجوه سطح المتولدة من 3.5.1 - 3.5.6.
    10. كرر من 3.5.1 - 3.5.9 لآخر محطة محور عصبي R7.
    11. حدد "إضافة نقاط القياس الجديدة". ثم حدد "تحرير" ووضع النقاط القياس على أعلى من الأشياء السطحية اثنين من غيض من محطة محور عصبي R7 في طبقة M6. وتعرف هذه الآن عن البدء في نقاط.
    12. حدد "إضافة نقاط القياس الجديدة". ثم حدد "تحرير" ووضع النقاط القياس على الجزء السفلي من الكائنات سطح اثنين من غيض من محطة محور عصبي R7 في طبقة M6. وتعرف هذه الآن كما في نهاية نقاط (الشكل 3E).

4. حساب من عدد من البقع، توزيع التردد بقعة ومستوى التخصيب من بدر-GFP مع صورة مخصصة تحليل البيانات البرمجيات

  1. نسخ ملف"XtquantifySynapseSNR.m" و "وظائف" مجلد إلى مجلد ماتلاب Imaris XT. لاحظ أن الحساب في هذه الدراسة أجريت مع البرنامج المساعد مخصصة تنفذ في Matlab. تحميل البرنامج المساعد من موقع ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
  2. فتح مجموعة بيانات مع ن البقع، ن الأسطح والأشياء 2 نقطة القياس، تحتوي على كل نقاط القياس ن (المعد 3،1-3،4). يحدد أول كائن نقطة قياس المواقف بداية لجميع المحاور. يحدد الكائن نقطة القياس الثاني ونهاية الموقف من جميع المحاور. تحتاج كل الكائنات نقطة القياس لدينا نفس العدد من النقاط القياس (وهذا هو عدد من المحاور).
  3. تنفيذ معالجة الصور >> حسب الطلب> atsushis كشف المشبك مقابل 6.
  4. تحقق الفوقية وتغيير أحجام بكسل في صورة برامج التحليل في حال كان غير صحيح.
  5. اختر قناة لالأداء الإقتصادي الأداءormance تحليل كثافة مناطق البقع والمناطق هيولي (القناة مع بدر-GFP).
  6. تحديد اسم الملف لتصدير النتائج.
  7. تحديد عدد من صناديق وطول محور عصبي في المئة. أدخل عدد من صناديق ب "10" ومجموعة من صناديق باسم "100٪" (الأرقام 4A و 4B).
  8. تحديد مناطق البقع والمناطق هيولية أخرى لتحليل تمركز بدر-GFP. دائرة نصف قطرها أدخل البقع ب "0.35 ميكرون" وعرض المنطقة ب "50 ميكرون" المحيطة بها. يحدد دائرة نصف قطرها البقع المنطقة للإشارة نقاط وGFP (0.35 ميكرون قطر، تركز على punctum واحد). عرض المنطقة المحيطة بها يحدد المنطقة للإشارة GFP في منطقة هيولي (50 ميكرون قطر، تركز على punctum، ولكن فقط بما في ذلك R8 وباستثناء جميع المجالات بقعة في السيتوبلازم) (الأرقام 4A و 4C).
  9. الانتظار حتى تتم معالجة كافة أقنعة الخلايا العصبيةوتصديرها كملفات PDF (أرقام 4B و 4C) والجدول CSV لمزيد من التحليل في جدول بيانات. ويشمل الجدول CSV عدد من النقاط، ومتوسط ​​كثافة إشارة في "منطقة هيولي" والحد الأقصى لكثافة إشارة في "بقعة" في كل حاوية لجميع محاور R8.
  10. فتح مجموعة بيانات أعد 3.5 لالطرح للإشارة الخلفية.
  11. أداء معالجة الصور كما هو موضح 4،3-4،9.
  12. حساب متوسط عدد وتوزيع نقاط وبدر-GFP في جدول بيانات (أرقام 4D و4E).
  13. حساب متوسط تمركز إشارة بدر-GFP في جدول بيانات من قبل نسبة من متوسط كثافة في "منطقة هيولي" مقسوما على أقصى قدر من الشدة في "بقعة" تطرح في متوسط الشدة في إشارة الخلفية (الشكل 4F) .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

العين مجمع ذبابة الفاكهة تضم ~ 780 ommatidia، تحتوي كل منها على ثمانية أنواع من المستقبلات الضوئية (R1-8). R7 وR8 مشروع محاور لالعقدة البصرية الثانية، النخاع، حيث أنها تشكل نقاط الاشتباك العصبي في طبقات M6 و M3، على التوالي 26. لدراسة تأثير التعرض لفترات طويلة لضوء على التركيب الجزيئي للمبصرة مناطق R8 النشطة، اتخذنا الاستفادة من طريقة نجمة 15. مستويات التعبير الذاتية للبدر وfluorescently المسمى عن طريق التقليب من كودون وقف في بدر-بينه وبين GFP مع flippase أعرب في خلايا مستقبلة للضوء R8 المستمدة من السيناتور-FLP. تم الاحتفاظ بها الذباب عن 1-3 د بعد eclosion في ليرة لبنانية، LD أو DD لنفس الفترة من الزمن عند 25 درجة مئوية (الشكل 1A). لفضح الذباب إلى 1000 لوكس ضوء، تم تعيين الذباب إلى رف راتنج الاكريليك (الشكل 1B) وأبقى على مسافة واحدةمن مصدر ضوء LED في حاضنة صغيرة (الشكل 1C).

بعد المناعية، وضعت العقول تشريح في تضييق الفجوة بين اثنين من coverslips على شريحة المجهر مع الجانب البطني من العقول التي تواجه صعودا لرؤية وتقدير من نقاط وبدر-GFP (الشكل 2). الناتج إشارة بدر-GFP المترجمة إلى نقاط واضحة داخل R8 في النخاع (الشكل 3A).

لحساب عدد وقياس توزيع بدر-GFP نقاط و، وتقييم مستوى تمركز إشارة بدر-GFP في R8s، وضعت مخصصة تحليل صورة البرنامج المساعد في متعددة نموذج بيئة الحوسبة العددية 9، 27. في البداية، تم الكشف عن نقاط والتي وظيفة كشف النقاط لكل R8 (الشكل 3B). وفي وقت لاحق، سطحتم إنشاء الصورة من كل R8 لتقييم مستوى عدم التمركز (الشكل 3C). وأخيرا، حددنا بدء نقاط والنقاط النهائية في الجزء العلوي من طبقة M1 والجزء السفلي من طبقة M3 على كل مبصرة على التوالي لقياس توزيع الالف إلى الياء (الشكل 3D). تم إنشاؤها الأشياء السطحية والبقع وبدء نقاط والنقاط النهائية لمدة محطات محوار R7 في طبقة M6 أيضا إلى طرح إشارة الخلفية من قناة GFP (الشكل 3E). نتائج عدد (الشكل 4D)، و(4A الأرقام، 4B و 4E) توزيع ومستوى عدم التمركز وتحسب (الأرقام 4A، 4C و4F) تلقائيا من قبل العرف المكونات في مكتوبة متعددة نموذج بيئة الحوسبة العددية . لقد وجدنا أن عدد بدر نقاط ومنفصلة تم تخفيض كبير في المستقبلات الضوئية R8 من الذباب أبقى في ظروف ليرة لبنانية (أرقام 4D و4E). إضافةitionally، وجدنا أن نقاط الاشتباك العصبي R8 وزعت على طول رمح محور عصبي من M1 إلى طبقة M3، ولكن كثافة أعلى في طبقات M1 و M3 (الشكل 4E). وكان مستوى عدم تمركز بدر-GFP دون تغيير في جميع ظروف الإضاءة (الشكل 4F). هذا هو على النقيض من توطين الموسومة fluorescently مقطعة من بدر (بدر القصير الكرز) 28، والتي، كما ذكرنا سابقا 9 يصبح منتشر بشكل واضح في ليرة لبنانية (الشكل 4G). اقترحنا أن إشارة بدر القصير الكرز ضلت موضعها الصحيح قد تكون ذات صلة المعالجة غير المناسب للجزء بدر القصير بعد تفكيك من الالف إلى الياء 9. بين البروتينات من الالف إلى الياء أخرى اختبارها، الموسومة fluorescently DLiprin-ألفا أو ذبابة الفاكهة ريم ملزم البروتين (DRBP) بنيات عرض انخفاضا في عدد من نقاط ووعدم تمركز واضح في ليرة لبنانية. في المقابل، الموسومة fluorescently Dsyd-1 أو النشاز (كاك) القيام يتم عرض زيادة إشارة هيولي حتى بعد يرة لبنانية (الشكل 4G). وهكذا، وقياس منهجي ما إذا كانت إشارة يصبح هيولي قد تكون ذات أهمية لفهم تجهيز البروتينات الألف إلى الياء.

شكل 1
الشكل 1: إعداد شروط التعرض لشدة الضوء معرفة. (أ) بروتوكولات التعرض للضوء بعد eclosion. DD، ظلام مستمر؛ LD، 12 ساعة ضوء / 12 ساعة الظلام. ليرة لبنانية، والتعرض المستمر للضوء. تم تشريح أدمغة يطير في الأوقات المحددة في أقواس (مقتبس من منشور السابق 9). يتم محاذاة (ب) قوارير في رفوف شفافة الاكريليك مرغوب. (ج) يتم وضع رف الاكريليك واثنين من لوحات LED في حاضنة صغيرة ويتم تعديلها لفضح الذباب لشدة الضوء من 1000 لوكس.ق / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: إعداد العينة. (A) الجامع شنت الاستعدادات الدماغ. (B - D) رسم تخطيطي من التحضيرات. (C، D) عبر أجزاء من الاستعدادات. الجانب البطني من العقول هو ما يصل (C) بين coverslips (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): جيل من البقع، كائنات السطحية ونقاط القياس. 15 باستخدام recombinase السيناتور-FLP. مكافحة Chaoptin (الأزرق) الضوء على R7 وR8 محاور مبصرة. شريط النطاق، 5 ميكرون. (ب) تحديد بدر-GFP نقاط ومن قبل وحدة كشف النقاط لكل محطة محور عصبي R8. (C) الكشف عن محور عصبي المناطق ( "الأشياء السطحية"، زرقاء) والمناطق بقعة ( "الأجسام بقعة"، البيضاء) لقياس مستوى تمركز بدر-GFP في محاور R8. (D) ونقاط بداية ونهاية نقاط يتم تعيين يدويا مع وظيفة "نقطة القياس" لتحديد اتجاه كل محور عصبي في الفضاء 3D، وتحديد نظام الإحداثيات على الذي من المتوقع الفور بدر-GFP. (E) على سطح الأشياء، والبقع، وبدء نقطة ونهاية نقاط لمدة محطات محوار R7 في طبقة M6 التي لا تتضمن R8 يتم إنشاء لطرح إشارة الخلفيةالقناة GFP. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: الكمي لعدد والتوزيع وعدم التمركز مستوى بدر-GFP نقاط و. (A) رسم تخطيطي لإجراء تستخدم لقياس مستوى ضلت موضعها الصحيح إشارة بدر-GFP في R8. يتم تحديد نقاط وبدر-GFP ويتم تحديد مجالين من حولهم: في منطقة "البقعة" ومنطقة "هيولي". وينقسم خط يربط البدء والنهاية نقطة في 10 أقسام. (B، C) الناتج من تحليل الصور المخصصة المساعد برنامج مكتوب في عدة نموذج بيئة الحوسبة العددية. الإحداثي يتوقع كل punctum بدر-GFP إلى خط تمثل الخلايا العصبية من بداية بوكثافة العمليات حتى نهاية النقطة (B). شريط النطاق، 5 ميكرون. يتم تحديد نقاط وبدر-GFP ويتم تحديد مجالين من حولهم: في "بقعة" منطقة ومنطقة "هيولي" (C)، كما schematized في الفقرة (أ). (D - F) الرسوم البيانية بار مقارنة العدد الإجمالي للنقاط و(D)، توزيعها (E) ومستوى تمركز بدر-GFP في R8 محور عصبي (F) في DD (83 محاور / 7 العقول)، دينار (107 المحاور / 5 العقول) وليرة لبنانية (226 المحاور / 15 العقول). الرسوم البيانية (G) بار مقارنة مستوى تمركز بدر القصير الكرز في LD (74 محاور / 7 العقول) وليرة لبنانية (70 محاور / 5 العقول)، GFP-DLiprin-α في LD (67 محاور / 7 العقول) وليرة لبنانية (52 محاور / 6 العقول)، GFP-DRBP في LD (70 محاور / 7 العقول) وليرة لبنانية (83 محاور / 6 العقول)، GFP-Dsyd-1 في LD (48 محاور / 5 العقول) وليرة لبنانية (69 محاور / 7 العقول)، ومؤشر كاك GFP في LD (31 محاور / 5 العقول) وليرة لبنانية (27 محاور / 5 العقول). *** ع <0.0001، ** ع <0.001 * ص <0.0 5، م ع> 0.05. أونبايريد ر اختبار مع التصحيح ولش ثنائي الطرف. ويظهر شريط الخطأ خطأ المعياري للمتوسط. يتم تكييفها الرسم التخطيطي في الفقرة (أ) والبيانات في (د) و (ه) و (G) من منشور السابق 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تكميلية الفيديو 1
فيديو التكميلي: وصف معالجة البيانات التي يقوم مع Imaris المساعد "المشبك TRAFO". مناقشة ومعالجة البيانات. يحتوي هذا الفيديو محاضرة قصيرة لتوضيح تنسيق التحول ومعالجة البيانات الخطوات التي يقوم بها Imaris المساعد "synapse_trafo".5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، وأظهرت لنا كيفية إعداد ظروف الإضاءة لفضح الذباب لشدة الضوء متساوية. نحن كميا ليس فقط على عدد من نقاط وعلامة متشابك ولكن يمكن أيضا حل مكانيا كثافة نقاط الاشتباك العصبي على طول المحاور وقياس مستوى تمركز البروتين علامة في المناطق هيولية. هذه التقييمات ثلاثة تسمح لنا لتقييم تفاصيل ديناميات متشابك على مستوى الخلايا العصبية واحد في ظروف بيئية مختلفة. يمكن تكييفها لدينا بروتوكول للبروتينات متشابك مختلفة ولكن أيضا على أي البيانات التي تحتوي على إشارات منقط.

والخطوة الحاسمة في البروتوكول هي تركيب من العقول. مبصرات ذبابة الفاكهة تتوقع محاور لثاني النخاع العقدة البصرية. كل محور عصبي مستقبلة للضوء يمكن مسحها بشكل مباشر إذا كانت العقول التي شنت تم وضعها بشكل صحيح على شريحة المجهر. أيضا يجعل من تصاعد الصحيح للاختيار من المستقبلات الضوئية مع softwa تحليل الصورإعادة ظائف أسهل. يجب أن يتم اختيار يدويا لحساب مستوى عدد وتمركز نقاط وكل منطقة مبصرة. ويتم اختيار نقاط البدء والنهاية أيضا يدويا. تتطلب هذه الاستعدادات وقتا طويلا نسبيا حتى يمكن للمرء أن الشروع في الكمي. ميزة R8 محاور هي أنها غير متفرع وكل محور عصبي R8 منفصل. ينصح الخلايا العصبية معزولة بسيطة مثل هذا واحد لهذه التطبيقات لأنه من الضروري لتحديد منطقة بالضبط من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يساعد على التخلص من نقاط وغير محددة والسطوح المستمدة من الخلايا العصبية الأخرى. وجود قيود في هذا النهج، ومع ذلك، هو عمق ض الإسقاط. قوة إشارة نقاط ويحصل أقل في الطبقات العميقة من ض المكدس. إعداد العقول شفافة عن طريق وسائل تطهير الأنسجة مثل هذا SeeDB2 29 قد تساعد على التغلب على هذا القيد وتسمح للتصوير إشارة واضحة منقط أعمق في الدماغ.

لدينا بروتومن المحتمل أن العقيد استخدامها لتحليل منظمة متشابك في مقياس النانو ومع التصوير الحي. الجمع فائقة الدقة التصوير (على سبيل المثال، وحفز نضوب الانبعاثات (STED) المجهري، ستوكاستيك البصرية إعادة الإعمار المجهري (STORM)، تنشيط الصورة توطين المجهري (النخيل)، والإضاءة منظم المجهري (SIM) وما إلى ذلك) مع النماذج النظرية تقدمت فهمنا لل هيكل وديناميكية الجزيئية من نقاط الاشتباك العصبي. على سبيل المثال، تم تقييم المنظمة نانوية من بدر في قرار واحد الجزيئية مع فائقة الدقة التصوير التي كتبها STORM المباشر (د STORM) في ذبابة الفاكهة NMJ 30. تم تكييفها لدينا بروتوكول للالكمي لديناميات جزيء منطقة نشط واحد في منطقة نشطة قبل المشبكي ومن مستقبلات بعد المشبكي واحد في منطقة بعد المشبكي إلى مزيد من فهم كيفية تنظيم نقاط الاشتباك العصبي في مستوى الآلية. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يمكن أن تستخدم لتصور الجزيئيةحركة في نقاط الاشتباك العصبي في الحيوانات الحية. في الواقع، بدر-GFP يمكن تصور دون الاعتماد على المناعية. وهكذا، تم تصوير تنمية قبل المشبكي في محاور R8 في الحيوانات الحية مع اثنين من الفوتون المجهري 15. فمن الممكن أن تتبع إشارة منقط مكونات منطقة نشطة في الحيوانات الحية عن طريق الكشف وتحليل بقع في نقاط زمنية مختلفة حيث يتم تعريف السطوح وظائف الخلايا العصبية المحددة في بروتوكول لدينا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لT. Stürner للتصحيحات مفيدة، المناقشات والتعليقات على المخطوطة. SL Zipursky لتوفير مخزون ذبابة. M Schölling لأداء معالجة الصور. تم تنفيذ جزء من تحليل الصور في مختبر A. Kakita ل. وأيد هذا العمل من قبل الكسندر فون همبولت مؤسسة وJSPS المنح الدراسية للبحوث في الخارج (AS)، JSPS الزملاء (SH-S)، المنح التحتية المعونة من أجل البدء (24800024)، على مناطق المبتكرة (25110713)، موتشيدا، تاكيدا، اينامورى، دايتشي سانكيو-، أسس توراي (TS)، DZNE التمويل الأساسي (GT) ومرفق DZNE ضوء المجهر (CM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vial Hightech, Japan MKC-20
Plug Thermo Fisher Sciehtific, USA AS-275
Customized transparent rack made of acrylic resin  Shin-Shin Corporation, Japan a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step
Cool incubator MITSUBISHI ELECTRIC, Japan CN-40A
LED panel MISUMI, Japan LEDXC170-W
Digital light meter CEM DT-1301
Fly pad Tokken, Japan TK-HA03-S
Petri dish (35 x 10 mm) Greiner Bio-One International, Germany 627102
PBS tablet Takara, Japan T900
Triton X-100 Wako, Japan 160-24751
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
1.5 mL tube Sarstedt, Germany A. 152X
Formaldehyde 16% NEM, Japan 3152
Pipetman P-200 Gilson F123601 
Pipetman P-20 Gilson F123600
Pipetman P-2 Gilson F144801
anti-chaoptin antibody DSHB 24B10
Alexa568-conjugated anti-mouse antibody Life Technologies A-11031
VECTASHIELD Mounting Medium Vector Laboratories, Inc. H-1000
Microscope slide (76 x 26 mm) Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany
Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) Zeiss, Germany 474030-9000-000
Industrial Microscopes Olympus, Japan SZ61-C-SET
Stereo Microscope Lighting Olympus, Japan KL 1600 LED
confocal microscopy Zeiss, Germany LSM780
Imaris Bitplane, Switzerland Version 7.6.4 or above
Matlab The MathWorks, Inc., USA
Excel for Mac  Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
  2. Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
  3. Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
  4. Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
  5. Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
  6. Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
  7. Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
  8. Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
  9. Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
  10. Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
  11. Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
  12. Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
  13. Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
  14. Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
  15. Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
  16. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
  17. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  18. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  19. Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
  20. Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
  21. Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
  22. Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
  23. Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
  24. Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
  25. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  26. Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
  27. Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
  28. Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
  29. Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  30. Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).

Tags

علم الأعصاب، العدد 120،
تحليل متشابك التحوير من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء بعد التعرض للضوء لفترات طويلة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sugie, A., Möhl, C.,… More

Sugie, A., Möhl, C., Hakeda-Suzuki, S., Matsui, H., Suzuki, T., Tavosanis, G. Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light. J. Vis. Exp. (120), e55176, doi:10.3791/55176 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter