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Neuroscience

Analyse Synaptische Modulation von Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/55176
Automatic Translation
1,2,5, 3, 4, 1,2, *4, *5
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)
* These authors contributed equally

Summary

Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.

Abstract

Das Nervensystem hat die bemerkenswerte Fähigkeit, auf verschiedene Reize anzupassen und zu reagieren. Diese neuronale Anpassung wird weitgehend durch Plastizität bei der synaptischen Ebene erreicht. Die aktive Zone (AZ) ist der Bereich an der präsynaptischen Membran, die die Freisetzung von Neurotransmittern vermittelt und ist von einer dichten Ansammlung von Gerüstproteine ​​bestehen. AZs von Drosophila melanogaster (Drosophila) Photorezeptoren unterziehen molekularen Remodeling nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht. Somit ist die Höhe der neuronalen Aktivität kann die molekulare Zusammensetzung der AZ neu anordnen und die Regulierung des Funktionsausgang beitragen.

Ausgehend von der Belichtung Set-up Vorbereitung auf die Immunhistochemie, Details dieses Protokoll , wie die Anzahl zu quantifizieren, um die räumliche Verteilung und die Delokalisierung Ebene synaptischer Moleküle an AZs in Drosophila Photorezeptoren. Mit Bildanalyse software, Cluster des GFP-fusionierten AZ Komponente Bruchpilot wurden für jede R8 Photorezeptor (R8) Axonterminal identifiziert. Erkannt Bruchpilot Spots wurden auf einzelne R8 Axone automatisch zugewiesen. Um die Verteilung der Frequenzkanal entlang des Axons zu berechnen, führten wir eine maßgeschneiderte Software-Plugin. Jedes Axon Startpunkt und Endpunkt wurden manuell definiert und die Position jedes Bruchpilot Stelle wurde auf der Verbindungslinie zwischen Start- und Endpunkt projiziert. Neben der Anzahl der Bruchpilot Cluster, quantifiziert wir auch die Delokalisierung Niveau der Bruchpilot-GFP innerhalb der Cluster. Diese Messungen beziehen sich im einzelnen ortsaufgelösten synaptic Dynamik in einem einzigen Neuron unter verschiedenen Umgebungsbedingungen auf Reize.

Introduction

Die Modulation der synaptischen Funktion trägt zu der bemerkenswerten Fähigkeit des Nervensystems genau zu reagieren oder auf sich ändernde Umweltstimuli anpassen. Die präsynaptischen Vesikelfreisetzung Wahrscheinlichkeit Einstellen ist eine Möglichkeit , 1 synaptischen Stärke zu steuern. Synaptische Vesikel - Freisetzung erfolgt an der aktiven Zone (AZ), einem spezialisierten Bereich der präsynaptischen Membran 2. Die AZ wird durch eine Kassette von spezifischen Proteinen charakterisiert 3, 4. Die meisten Proteine zu AZ Montage beitragen , werden in Nematoden, Insekten und Säugetieren 5 hoch konserviert. Neuere Studien legen nahe , dass das Niveau von neuronaler Aktivität der molekularen Zusammensetzung des AZ reguliert, das wiederum trägt zur Regelung der Funktionsausgang sowohl in vitro als auch in vivo 6, 7,> 8. Wir fanden vorher , dass Photorezeptor AZs molekulare Umbau in Drosophila unterzogen werden nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht 9. In diesem Zustand wurde beobachtet, dass die Anzahl der Bruchpilot (BRP) -positiven AZs in dem Photorezeptor Axone reduziert wurde.

Die Brp / CAST / ELKS Familie Proteine sind Grundbausteine von AZs in Wirbeltieren und wirbellosen Synapsen 10. Bei Drosophila brp Mutanten, evozierte Vesikelfreisetzung 11 unterdrückt wird, 12. Die 17 C-terminalen Aminosäurereste von Brp sind für synaptic vesicle clustering an der Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) 13, 14. Diese Studien zeigten, die zentrale Rolle dieses Moleküls in AZ Organisation und Funktion. Mit einem neu entwickelten genetischen Werkzeug, synaptic tagging mit Rekombinations (Stern), Brpkann in vivo in spezifische Zelltypen, bei endogenen Expressionsniveaus und bei einer einzelnen Synapse Auflösung 15 beobachtet werden. Dieses Werkzeug ermöglicht es, die endogene Dynamik der Synapsen quantitativ in dem Komplex des zentralen Nervensystems zu bewerten.

Es wurden mehrere Studien Quantifizierungen einschließlich Synapsen basierend auf Daten aus der konfokalen Mikroskopie erhalten. Synaptische Veränderungen wurden durch Messen der Länge, die Fläche, das Volumen, die Dichte und das Zählen der Anzahl basierend auf hoch entwickelten Software-Anwendungen bewertet. Zum Beispiel stellt die Freeware ImageJ eine Quantifizierungsmethode für die gesamte synaptischen Bereich und Synapsendichte Maßnahmen an der Drosophila NMJ 16. Die Anzahl der Kolokalisation Websites von Pre - und postsynaptischen Markern wurden 17 mit dem Plugin "Puncta Analyzer" auf der ImageJ Software - Plattform quantifiziert. Alternativ kann ein Multi-Paradigm numerischen Rechenumgebung basiertes Programm, Synapse Detector (SYND) können automatisch mit einem fluoreszierenden Marker markiert Dendriten von Neuronen Spuren und quantifiziert dann die synaptischen Proteinmengen als Funktion des Abstands von dem Zellenkörper 18. Die Software Synaptische Puncta Analysis (SynPAnal), hat sich für die schnelle Analyse von 2D-Bildern von Neuronen erworben von konfokalen oder Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Die primäre Funktion dieser Software ist die automatische und schnelle Quantifizierung von Dichte und Intensität der Protein puncta 19. Vor kurzem wurde eine automatische lernbasierte Synapse Erkennungsalgorithmus wurde für die Quantifizierung der synaptischen Zahl in 3D 20, erzeugt wurde 21 die Vorteile der 3D - Visualisierung-Assisted Analysis (Vaa3D) Software nehmen.

Kommerzielle Bildanalyse-Software sind auch leistungsfähige Werkzeuge für die synaptische Quantifizierungen. Zum Beispiel kann die fluoreszenzmarkiertem Neurotransmitter - Rezeptoren oder eine präsynaptische AZ Komponente in drei Dimensionen mit Einzelsiebzug Synapse Auflösung in C. elegans 22 oder der Drosophila olfaktorische System 23, 24, so dass Hunderte von Synapsen zu schnell charakterisiert innerhalb einer einzigen Probe quantifiziert.

Hier präsentieren wir eine Methode, durch eine maßgeschneiderte Bildanalyse-Software-Plug-in in einem Multi-Paradigma numerische Rechenumgebung implementiert, die halbautomatisch mehrere Aspekte der AZs analysieren können, einschließlich deren Anzahl, Verteilung und dem Grad der Anreicherung von molekularen Komponenten zu der AZ. Somit ist diese komplexe Analyse erlaubt uns, die Dynamik der synaptischen Komponenten in Axonterminalen unter verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten. Wir untersuchten die Wirkung von Licht-Exposition auf den Ausgangs Synapsen der erwachsenen Fliege Photorezeptoren. Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1)Vorbereitung zur Belichtung, 2) Dissektion, Immunhistochemie und konfokale Bildgebung und 3) Bildanalyse.

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Protocol

Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen beinhalten ausschließlich mit Drosophila funktionieren und nicht zu den Tierschutzgesetze in Deutschland und Japan unterzogen.

1. Lichtbelichtungsbedingungen

  1. Bereiten Sie Fliegen , die sinnlosen-Flippase (sens-FLP) und Bruchpilot-FRT-HALT-FRT-gfp (BRP-FSF-gfp) 15 zur Visualisierung von BRP-GFP in Photorezeptor R8 Neuronen (R8) tragen. Die genomische Locus Codierung brp innerhalb eines Bacterial Artificial Chromosome (BAC) wurde modifiziert , um dieses BRP-FSF-GFP - Konstrukt zu erzeugen. In den Fliegen dieser modifizierten BAC die Expression von BRP-GFP trägt , ist unter der Kontrolle der endogenen regulatorischen Sequenzen, aber nach sinnlosen-Flippase vermittelter Entfernung der FRT-STOPP-FRT - Kassette 15 bis R8 Photorezeptoren beschränkt. Beachten Sie, dass sens-FLP selten in R7s Flippase zum Ausdruck bringt.
  2. Halten Sie die Fliegen in einem 12 h light / 12 h Dunkel - Zyklus (LD) bei 25 ° C von der Larve bis zum Schlüpfen (1A).
  3. Sammeln Sie die Fliegen zum 0 - 6 h nach dem Schlüpfen und legen Sie sie in ein neues Fläschchen Fliege Nahrung enthält.
  4. Stellen Sie die Phiolen in eine transparente Zahnstange aus Acrylharz mit drei Stufen (einer Höhe von 41 cm, einer Basis von 21 cm, einer Dicke von 4 cm und einer Höhe von 13 cm für jeden Schritt) (1B).
  5. Stellen Sie den Abstand zwischen der Zahnstange und einem LED - Panel , die Beleuchtung mit einer durchschnittlichen Intensität von 1.000 Lux , um eine digitale Belichtungsmesser (1C) verwendet wird .
  6. Halten Sie die Fliegen für 1-3 d unter einer der folgenden Bedingungen: konstanter Dunkelheit (DD), 12 h Licht / 12 h Dunkel - Zyklus (LD) oder Dauerlicht (LL) bei 25 ° C in einem kleinen Inkubator (1A und 1C).

2. Dissection, Immunhistochemie und Imaging

  1. Präparieren Fliegen Gehirne mit einer Pinzette, fixieren Sie diese mit 4% formaldehyde und immunostain mit dem primären Antikörper gegen Chaoptin (1:50) und einem zweiten Antikörper zur Visualisierung von auf früheren experimentellen Verfahren 25 basierend Photorezeptoren. Kurz:
    1. Bereiten 0,1% Triton X-100 in PBS (0,1% PBT). Diese Lösung wird verwendet, um Antikörpergewebepenetration verbessern.
    2. Anesthetize fliegt auf einem CO 2 - Pad, sortieren Sie die richtigen Genotyp und übertragen sie in eine Petri mit 0,1% PBT gefüllten Teller.
    3. Kleben Sie die Zange unter den Rüssel und ziehen Sie die rechte und linke Auge jeweils mit den anderen Zange.
    4. Entfernen Sie den Rüssel und die Luftröhre an das Gehirn gebunden.
    5. Übertragen, um das Gehirn mit der Zange in ein 1,5 ml-Röhrchen, enthaltend 150 & mgr; l von 0,1% PBT bei RT.
    6. Innerhalb von 10 min Wiederholung von 2.1.3 - 2.1.5 so viele Gehirne wie möglich zu erhalten.
    7. In 50 & mgr; l von 16% Formaldehyd in das Röhrchen und mischen durch Pipettieren.
    8. Inkubieren Sie die Gehirne in Fixiermittel bei RaumTemperatur für 50 min.
    9. Waschen dreimal mit 200 & mgr; l von 0,1% PBT mit einer Mikropipette, Aufmerksamkeit die Gehirne in der Röhre zu verlassen.
    10. Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die 0,1% PBT und die primäre Antikörperlösung hinzufügen, wie folgt hergestellt: in den 196 & mgr; l von 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) 4 ul anti-Chaoptin Antikörper (Endverdünnung 1 : 50) für die Visualisierung von Photorezeptoren.
    11. Inkubieren Sie die Gehirne in der primären Antikörperlösung bei 4 ° CO / N.
    12. Wasch 3x mit 200 ul 0,1% PBT mit einer Mikropipette.
    13. Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die 0,1% PBT und einen sekundären Antikörper, die 200 & mgr; l der 0,3% PBT hinzuzufügen.
    14. Inkubieren bei 4 ° CO / N im Dunkeln.
    15. Waschen dreimal mit 200 ul 0,1% PBT mit einer Mikropipette.
  2. Zur Montage setzen zwei kleine Tropfen (2 ul jeweils) eines Befestigungsmediums mit einer Mikropipette in der Mitte eines Objektträgers bei etwa 2 cm distaNOA voneinander.
  3. Legen Sie zwei Deckgläser, ein auf jedem Tropfen und lassen einen schmalen Spalt zwischen den Deckgläsern von etwa 0,2 mm.
  4. Legen Sie 15 ul einer Montagemedium auf dem Deckglas und fügen Sie die Gehirne mit einer Mikropipette in die Montagemedium.
  5. Unter einem Binokular, positionieren das Gehirn mit der Bauchseite nach oben in den schmalen Spalt zwischen den beiden Deck (Abbildung 2).
  6. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack , um die Probe zu beheben (Abbildung 2).
  7. Erhalten Sie Bilder der Gehirne mit einem konfokalen Mikroskop. Verwenden Sie ein 63X -Ölimmersionsobjektiv Objektiv (1,4 NA) und ein 2.6X Digitalzoom. Erzeugen mehr als 20 optische Schnitte der zweiten Optik ganglion medulla mit einer Schrittweite von 0,5 um.

3. Die Erzeugung der Spots, Oberfläche Objekte, Startpunkte und End-Punkte

  1. Zur Quantifizierung der Zahl, die distribution und die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP puncta, öffnen Sie das durch konfokale Mikroskopie erhalten Stapel in der Analyse - Software - Image und Rekonstitution von 3D - Bildern (3A). Beachten Sie, dass der Schritt in dieser Studie wurde mit Imaris durchgeführt.
  2. Identifizieren Sie die BRP-GFP puncta durch das Punkterfassungsmodul für jeden R8 Axonterminal.
    1. Wählen Sie "Neuen Spots".
    2. Wählen Sie "Segment nur eine Region of Interest" in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie einen R8 Axonterminal in der Medulla manuell.
    3. Wählen Sie den Quellkanal des BRP-GFP-Signal.
      HINWEIS: Die R7 und R8 Photorezeptor Axone wurden mit immunmarkierten anti-Chaoptin (3A). Nur wenn enthält R8, BRP-GFP puncta und somit leicht zu unterscheiden (3A) werden könnte. Ferner könnte der Endpunkt R8 durch die Verdünnung der anti-Chaoptin-positive Axone am Eintrittspunkt in die Medulla M3 Schicht identifiziert werden.
    4. Stellen Sie den geschätzten XY Durchmesser to 0,35 um und prüfen "Hintergrund Subtraktion" im Spot-Erkennung aus.
    5. Wählen Sie "Qualität" in Filtertyp und Filter automatisch. Dann klicken Sie auf Fertig.
    6. Wiederholen von 3.2.1 t- 3.2.5 für andere R Axone (3B).
  3. Um die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP in R8 Axone messen, Oberflächenobjekte mit dem "Surface" -Funktion für jedes Axon (3C) erzeugen.
    1. Wählen Sie "Add new Oberflächen".
    2. Wählen Sie "Segment nur eine Region of Interest" in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie dann manuell einen R8 Axonterminalen in der Medulla.
    3. Wählen Sie den Quellkanal der Photorezeptoren.
    4. Abhaken "glatt".
    5. Wählen Sie "Absolute Intensität" in der Schwelle.
    6. Check "Enable". "Seed-Punkte-Durchmesser" ist 0,5 um.
    7. Wählen Sie Filtertyp "Qualität" und "Anzahl der Voxel", und dann filtern automamatisch.
    8. Gehen Sie auf "Bearbeiten" und löschen Sie die Stücke auf andere nicht interessant Axone erzeugt Oberflächen.
    9. Wiederholen von 3.3.1 - 3.3.8 für andere R Axone (3C). Hinweis wurden einige Oberflächen Objekte unterbrochen wegen der geringen Dicke und das schwache Signal in Photorezeptoren bei M2-Schicht, aber sie waren immer noch als ein einziges Objekt von Anfang bis Ende Punkte berücksichtigt.
  4. Um die Verteilung der BRP-GFP puncta entlang jedes Neuron in der Medulla neuropil identifizieren, zu definieren den Startpunkt und Endpunkt mit dem Messpunkt - Funktion (3D).
    1. Wählen Sie "Neuen Messpunkte". Wählen Sie dann "Bearbeiten" und wählen Sie "Oberfläche des Objekts" mit der Spitze der Flächenobjekte zu schneiden.
    2. Setzen Sie Messpunkte auf der Oberfläche Objekte von R Axone in M1 Schicht um. Diese sind definiert nun als Startpunkte (3D).
    3. Wählen Sie "Neuen Messpunkte".Wählen Sie dann "Bearbeiten" und wählen Sie "Oberfläche des Objekts" mit der Unterseite der Oberfläche Objekte zu schneiden.
    4. Setzen Sie Messpunkte auf der Unterseite der Oberflächenobjekte von R Axone in M3 Schicht um. Diese sind definiert nun als Endpunkte (Abbildung 3D).
  5. Um das Hintergrundsignal von der GFP - Kanal subtrahieren, erzeugen Flächenobjekte, Flecken, Start-Punkte und Endpunkte für zwei R Axone in M6 Schicht (Abbildung 3E).
    1. Wählen Sie "Add new Oberflächen".
    2. Wählen Sie "Segment nur eine Region of Interest" in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie dann ein Axon R7 Klemme zwischen M5 und M6 manuell Schicht.
    3. Wählen Sie den Quellkanal des Photorezeptors.
    4. Abhaken "glatt".
    5. Wählen Sie "Absolute Intensität" in der Schwelle.
    6. Wählen Sie Filtertyp "Qualität" und "Anzahl der Voxel", dann automatisch filtern.
    7. Wählen Sie "Neuen Spots";.
    8. Wählen Sie "automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten".
    9. Wählen Sie "Center of Object" und einen Platz im inneren Bereich der Oberfläche Objekt hinzufügen, erzeugt aus 3.5.1 - 3.5.6.
    10. Wiederholen von 3.5.1 - 3.5.9 für eine andere R7 Axonterminal.
    11. Wählen Sie "Neuen Messpunkte". Wählen Sie dann "Bearbeiten" und stellen Messpunkte auf der Oberseite der beiden Oberflächenobjekte von der Spitze des R7 Axonterminal in M6 Schicht. Diese werden nun als Startpunkte definiert.
    12. Wählen Sie "Neuen Messpunkte". Wählen Sie dann "Bearbeiten" und stellen Messpunkte auf der Unterseite der beiden Oberflächenobjekte von der Spitze des R7 Axonterminal in M6 Schicht. Diese sind definiert nun als Endpunkte (Abbildung 3E).

4. Berechnung der Anzahl der Spots, Verteilung des Spot-Frequenz und Pegel des Anreicherung von BRP-GFP mit einer angepassten Bilddatenanalyse-Software

  1. Kopieren Sie die Datei"XtquantifySynapseSNR.m" und die "Funktionen" Ordner in den Imaris XT Matlab Ordner. Beachten Sie, dass die Berechnung in dieser Studie mit einem angepassten Plugin implementiert in Matlab durchgeführt wurde. Laden Sie das Plugin von der Website ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
  2. Öffnen Sie einen Datensatz mit n-Spots, n Oberflächen und zwei Messpunktobjekte, die jeweils n Messpunkte (hergestellt 3,1 bis 3,4). Der erste Messpunkt Objekt definiert die Startpositionen für alle Axone. Der zweite Messpunkt Objekt definiert die Endposition aller Axone. Beide Messpunktobjekte müssen die gleiche Anzahl von Messpunkten zu haben (dh die Anzahl von Axonen).
  3. Führen Sie die Bildverarbeitung >> CUSTOM> atsushis Synapse Erkennung Vs 6.
  4. Überprüfen Sie Metadaten und Pixelgrößen in Bildanalyse-Software für den Fall, ändern Sie es nicht korrekt ist.
  5. Wählen Sie den Kanal für die performance der Intensitätsanalyse von Spots Regionen und Cytoplasma-Regionen (der Kanal mit BRP-GFP).
  6. Definieren Sie den Dateinamen, die Ergebnisse für den Export.
  7. Definieren Sie die Anzahl der Bins und Axonlänge in Prozent. Geben Sie die Anzahl der Behälter als "10" und den Bereich der Behälter als "100%" (4A und 4B).
  8. Definieren Sie die Bereiche der Spots und den anderen zytoplasmatischen Regionen für die BRP-GFP Delokalisierung Analyse. Geben Sie Flecken Radius als "0,35 um" und der Breite auf die Umgebung als "50 & mgr; m". Der Flecken Radius definiert den Bereich für das puncta GFP-Signal (0,35 & mgr; m Durchmesser, auf einer punctum zentriert). Die Breite Bereich der umgebenden definiert den Bereich für das GFP - Signal im Cytoplasma - Bereich (50 & mgr; m Durchmesser, auf dem punctum zentriert, aber auch nur R8 und unter Ausschluss aller Punktbereiche im Zytoplasma) (4A und 4C).
  9. Warten Sie, bis alle Neuron Masken verarbeitet werdenund exportiert als PDF - Dateien (4B und 4C) und eine CSV - Tabelle zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm . Die CSV-Tabelle enthält die Anzahl der Punkte, die mittlere Signalintensität in der "Cytoplasma-Bereich" und die maximale Signalintensität in der "Punkt" in jedem Fach für alle R8 Axone.
  10. Öffnen Sie einen Datensatz erstellt in 3.5 für die Subtraktion des Hintergrundsignals.
  11. Führen Sie die Bildverarbeitung von 4.3 - 4.9.
  12. Berechne den Mittelwert der Gesamtzahl und der Verteilung der BRP-GFP puncta in ein Tabellenkalkulationsprogramm (Figuren 4D und 4E).
  13. Berechne den Mittelwert der Delokalisierung von BRP-GFP - Signal in einer Kalkulationstabelle durch das Verhältnis der durchschnittlichen Intensität in der "zytoplasmatische Bereich" geteilt durch die maximale Intensität in der "Spot" subtrahiert durch die durchschnittliche Intensität des Hintergrundsignals (4F) .

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Representative Results

Das Facettenauge von Drosophila umfasst ~ 780 Ommatidien, die jeweils acht Typen von Photorezeptoren (R1-8). R7 und R8 Projekt ihre Axone in die zweite Optik Ganglion, der Medulla, wo sie Synapsen in Schichten M6 und M3 bilden jeweils 26. Um die Wirkung von längerer Einwirkung von Licht auf der molekularen Zusammensetzung des Photorezeptors R8 aktiven Zonen zu untersuchen, nutzten wir die STaR Methode 15. Endogene Expression von Brp wurden durch Ausflippen das Stopp - Codon in BRP-FSF-gfp mit einem Flippase ausgedrückt in R8 Photorezeptoren fluoreszenzmarkierten abgeleitet aus dem sens-FLP. 3 d nach dem Schlüpfen in LL, LD oder DD für den gleichen Zeitraum bei 25 ° C (Abbildung 1A) - Die Fliegen wurden für 1 gehalten. Um die Fliegen zu 1.000 Lux Licht ausgesetzt werden , wurden die Fliegen in einem Acrylharz - Rack (Abbildung 1B) eingestellt und gehalten im gleichen Abstandvon der LED - Lichtquelle in einem kleinen Inkubator (Abbildung 1C).

Nach Immunfärbung wurden sezierte Gehirne zwischen zwei Deckgläser auf einem Objektträger mit der ventralen Seite der Gehirne nach oben zur Visualisierung und Quantifizierung der BRP-GFP puncta (Figur 2) in den schmalen Spalt angeordnet. Das sich ergebende BRP-GFP - Signal zu deutlichen puncta innerhalb R8 in der Medulla (3A) lokalisiert.

Um die Anzahl zu zählen und die Verteilung von BRP-GFP puncta messen und die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP - Signal in R8s, eine angepasste Bildanalyse - Software - Plugin wurde in einem Multi-Paradigma numerische Rechenumgebung 9, 27 entwickelt zu bewerten. Zunächst puncta wurden für jeden R8 (3B) durch Punkterkennungsfunktion erkannt. Anschließend wurden Oberflächens jedes R8 wurden zur Bewertung der Delokalisierung Ebene (3C) erzeugt. Schließlich definiert wir beginnen Punkte und Endpunkte an der Spitze der M1 - Schicht und dem Boden der M3 - Schicht auf jedem Photorezeptor jeweils die AZ - Verteilung (3D) zu messen. Oberflächen Objekte, Flecken, Start-Punkte und Endpunkte für zwei R7 Axonterminalen in M6 Schicht erzeugt wurden auch das Hintergrundsignal von GFP - Kanal (Abbildung 3E) zu subtrahieren. Die Ergebnisse der Nummer (4D), die Verteilung (4A, 4B und 4E) und die Delokalisierung Ebene (4A, 4C und 4F) werden automatisch durch die benutzerdefinierte Plug-in in einem Multi-Paradigma numerische Rechenumgebung geschrieben berechnet . Wir fanden , dass die Anzahl der diskreten Brp puncta signifikant in R8 Photorezeptoren von Fliegen in LL Bedingungen (Figuren 4D und 4E) gehalten reduziert wurde. Hinzufügenitionally fanden wir , dass R8 Synapsen wurden entlang der axonalen Welle von der M1 zu der M3 - Schicht verteilt sind , aber die Dichte war höher bei der M1 und M3 Schichten (Figur 4E). Die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP war unverändert bei allen Lichtverhältnissen (4F). Dies steht im Gegensatz zur Lokalisierung eines fluoreszenz Kurzfassung Brp (BRP-Kurz Kirsche) 28, die markiert, wie wir zuvor 9 berichtet wird in LL (4G) deutlich gestreut. Wir schlugen vor , dass die delokalisiert BRP-Kurz Kirsche Signal auf unangemessene Verarbeitung des BRP-kurzes Fragment in Zusammenhang stehen könnten nach 9 von der AZ zu zerlegen. Unter anderen getesteten AZ Proteine, getaggt fluoreszenz DLiprin-α oder Drosophila Rim Binding Protein (DRBP) Konstrukte eine Verringerung der Anzahl von puncta und eine klare Delokalisierung in LL anzuzeigen. Im Gegensatz dazu fluoreszierend markiert Dsyd-1 oder Kakophonie (Cac) eine erhöhte zytoplasmatische Signal auch nach LL (4G) nicht angezeigt. So messen systematisch, ob das Signal zytoplasmatischen wird von Bedeutung sein könnte, die Verarbeitung von AZ Proteine ​​zu verstehen.

Abbildung 1
Abbildung 1: Herstellung von Bedingungen für die Belichtung auf definierte Lichtstärke. (A) Lichtexposition Protokolle nach dem Schlüpfen. DD, Dauerdunkel; LD, 12 h Licht / 12 h Dunkelheit; LL, ständige Exposition gegenüber Licht. Fly Gehirne wurden zu den Zeiten , in den Klammern angegeben seziert (Übernommen von einer früheren Veröffentlichung 9). (B) Phiolen werden in einem maßgeschneiderten Acryl transparent Gestell ausgerichtet sind . (C) Das Acrylgestell und zwei LED - Panels sind in einem kleinen Inkubator gestellt und angepasst , um die Fliegen zu einer Lichtintensität von 1000 Lux ausgesetzt werden .s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2: Herstellung der Probe. (A) insgesamt montiert Gehirnpräparate. (B - D) Schematische Darstellung der Zubereitungen. (C, D) Querschnitte der Zubereitungen. Die Bauchseite des Gehirns ist bis (C) zwischen Deckgläsern (D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Die Erzeugung der Spots, Oberflächenobjekte und Messpunkte. 15 mit sens-FLP - Rekombinase. Anti-Chaoptin (blau) zeigt die R7 und R8 Photorezeptor Axone. Maßstabsbalken, 5 um. (B) Identifizierung von BRP-GFP puncta durch das Punkterfassungsmodul für jeden R8 Axonterminal. (C) Erkannt Axon Regionen ( "Surface - Objekte", blau) und Spot - Regionen ( "Spot - Objekte", weiß) zur Messung der Delokalisierung Ebene von BRP-GFP in R8 Axone. (D) Die Startpunkte und Endpunkte sind mit "Messpunkt" Funktion manuell einstellen jedes Axon die Orientierung im 3D - Raum zu definieren und ein Koordinatensystem , auf das die BRP-GFP Stelle projiziert zu definieren. (E) Die Oberfläche Objekte, Flecken, Start-Punkte und Endpunkte für zwei R7 Axonterminalen bei M6 - Schicht , die R8 nicht enthalten , werden erzeugt , um das Hintergrundsignal zu subtrahierendes GFP-Kanal. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Quantifizierung der Anzahl, Verteilung und Delokalisierung Ebene von BRP-GFP Puncta. (A) Schematische Darstellung des Verfahrens verwendet , um das Niveau von delokalisiert BRP-GFP - Signal in R8 zu messen. Die BRP-GFP puncta werden identifiziert und zwei Bereiche definiert sind, um sie herum: die "Spot" Bereich und die "cytoplasmatische" -Bereich. Die Linie verbindet Start- und End-Punkte in 10 Partitionen unterteilt. (B, C) Die Ausgabe der angepassten Bildanalyse - Software - Plugin geschrieben in einem Multi-Paradigma numerische Rechenumgebung. Jede BRP-GFP punctum Koordinate auf eine Linie projiziert, die die Neuronen von Start-point bis zum Endpunkt (B). Maßstabsbalken, 5 um. Die BRP-GFP puncta werden identifiziert und zwei Bereiche sind um sie herum definiert: Die "Spot" Bereich und die "cytoplasmatische" Bereich (C), wie in (A) schematisiert. (D - F) Balkendiagramme die Gesamtzahl der puncta Vergleich (D), deren Verteilung (E) und die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP pro R8 Axon (F) in der DD (83 Axone / 7 Gehirne), LD (107 Axone / 5 Gehirne) und LL (226 Axone / 15 Gehirne). (G) Balkendiagramme die Delokalisierung Ebene von BRP-Kurz Kirsche in LD Vergleich (74 Axone / 7 Gehirne) und LL (70 Axone / 5 Gehirn), GFP-DLiprin-α in LD (67 Axone / 7 Gehirne) und LL (52 Axone / 6 Gehirne), GFP-DRBP in LD (70 Axone / 7 Gehirne) und LL (83 Axone / 6 Gehirne), GFP-Dsyd-1 in LD (48 Axone / 5 Gehirne) und LL (69 Axone / 7 Gehirne) und Cac-GFP in LD (31 Axone / 5 Gehirne) und LL (27 Axone / 5 Gehirn). *** P <0,0001, ** p <0,001, * p <0,0 5, ns p> 0,05; ungepaarten t-Test mit Welch Korrektur two-tailed. Fehlerbalken zeigt Standardfehler des Mittelwerts. Die schematische Zeichnung in (A) und die Daten in (D), (E) und (G) aus einer früheren Veröffentlichung 9 angepasst. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Supplemental Video 1
Supplemental Video: Beschreibung der mit dem Imaris Plugin "Synapse Trafos" Performed Datenverarbeitung. Diskussion der Datenverarbeitung. Dieses Video enthält einen kurzen Vortrag zur Erläuterung der von der Imaris Plugin "synapse_trafo" durchgeführt Transformation und Datenverarbeitungsschritte zu koordinieren.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download bereit.)

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Discussion

In dieser Studie haben wir gezeigt, wie die Lichtverhältnisse vorzubereiten Fliegen auf eine gleiche Lichtintensität zu belichten. Wir quantifiziert nicht nur die Anzahl der synaptischen puncta Marker könnte aber auch räumlich die Dichte von Synapsen entlang Axone lösen und die Delokalisierung Ebene des Markerproteins in zytoplasmatischen Bereichen zu messen. Diese drei Beurteilungen ermöglichen es uns, die Details der synaptischen Dynamik bei einzelnen Neurons Ebene in verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten. Unser Protokoll kann an verschiedene synaptischen Proteinen angepaßt werden, sondern auch auf alle Daten, die punktierte Signale enthält.

Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Montage der Gehirnen. Drosophila Photorezeptoren projizieren ihre Axone in die zweite Optik Ganglion Medulla. Jeder Photorezeptor axon kann ohne weiteres abgetastet werden, wenn die montierten Köpfe korrekt auf einen Objektträger gelegt wurden. Die richtige Montage ist auch die Auswahl der Photorezeptoren mit der Bildanalyse software Funktionen erleichtert. Jeder Photorezeptor Region manuell ausgewählt werden, um die Anzahl und Delokalisierung Niveau puncta zu zählen. Die Start- und Endpunkte sind auch manuell ausgewählt. Diese Präparate erfordern eine relativ lange Zeit, bis einer der Quantifizierung erfolgen kann. Der Vorteil R8 Axonen ist, dass sie unverzweigte und jedes R8 ist getrennt axon. Eine einfache isolierte neuron wie dieses ist für diese Anwendungen empfohlen, da es notwendig ist, den genauen Bereich des Neurons zu definieren. Darüber hinaus hilft dieses von anderen Neuronen, abgeleitet von unspezifischen puncta und Oberflächen loszuwerden. Eine Begrenzung bei diesem Ansatz ist jedoch die Tiefe der z-Projektion. Die Signalintensität von puncta wird weniger in tieferen Schichten der Stapel z. Herstellung von transparenten Gehirne von Gewebe-Clearing - Verfahren , wie ein SeeDB2 29 könnte helfen , diese Einschränkung zu überwinden und Abbildung eines klar punctata Signal erlauben noch tiefer im Gehirn.

Unsere Protocol kann potenziell für die Analyse der synaptischen Organisation zu einem Nanomaßstab verwendet werden und mit Live-Bildgebung. Super-Resolution Imaging - Kombination (zB stimulated emission depletion (STED) Mikroskopie, stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), Foto aktiviert Lokalisationsmikroskopie (PALM), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM) etc.) mit der theoretischen Modellierung unser Verständnis von der fortgeschritten Struktur und Moleküldynamik von Synapsen. Zum Beispiel wurde die nanoskopischen Organisation von Brp auf Einzelmolekülauflösung mit Super-Resolution - Bildgebung durch direkte STORM (d STORM) an der Drosophila NMJ 30 bewertet. wurde Unser Protokoll für die Quantifizierung der Dynamik eines einzelnen aktiven Zone Molekül an einer präsynaptischen aktiven Zone und eines einzelnen postsynaptischen Rezeptor an einer postsynaptischen Zone zu verstehen, wie Synapsen reguliert werden auf einer mechanistischen Ebene angepasst. Darüber hinaus könnte unser Protokoll verwendet werden, um molekulare zu visualisierenBewegung an den Synapsen in lebenden Tieren. In der Tat kann BRP-GFP, ohne sich auf die Immunfärbung sichtbar gemacht werden. So hat präsynaptischen Entwicklung in R8 Axone wurden 15 in lebenden Tieren mit Zwei-Photonen - Mikroskopie abgebildet. Es ist möglich, die punktförmige Signal der aktiven Zonenkomponenten in lebenden Tieren zu verschiedenen Zeitpunkten durch Erfassen und Analysieren von Flecken zu verfolgen, da die Oberflächen und die Positionen der spezifischen Neuronen in unserem Protokoll definiert sind.

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Acknowledgments

Wir danken T. Stürner für hilfreiche Korrekturen, Diskussionen und Kommentare zum Manuskript; SL Zipursky fly Aktien zu liefern; M Schölling zum Durchführen einer Bildverarbeitung. Ein Teil der Bildanalyse wurde bei A. Kakita Labor durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung und JSPS-Stipendien für Forschung unterstützt im Ausland (AS), JSPS-Stipendiaten (SH-S.), Grant-In-Hilfe für die Inbetriebnahme (24800024), auf innovative Bereiche (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE Kernfinanzierung (GT) und DZNE Einrichtung Lichtmikroskopie (CM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vial Hightech, Japan MKC-20
Plug Thermo Fisher Sciehtific, USA AS-275
Customized transparent rack made of acrylic resin  Shin-Shin Corporation, Japan a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step
Cool incubator MITSUBISHI ELECTRIC, Japan CN-40A
LED panel MISUMI, Japan LEDXC170-W
Digital light meter CEM DT-1301
Fly pad Tokken, Japan TK-HA03-S
Petri dish (35 x 10 mm) Greiner Bio-One International, Germany 627102
PBS tablet Takara, Japan T900
Triton X-100 Wako, Japan 160-24751
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
1.5 mL tube Sarstedt, Germany A. 152X
Formaldehyde 16% NEM, Japan 3152
Pipetman P-200 Gilson F123601 
Pipetman P-20 Gilson F123600
Pipetman P-2 Gilson F144801
anti-chaoptin antibody DSHB 24B10
Alexa568-conjugated anti-mouse antibody Life Technologies A-11031
VECTASHIELD Mounting Medium Vector Laboratories, Inc. H-1000
Microscope slide (76 x 26 mm) Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany
Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) Zeiss, Germany 474030-9000-000
Industrial Microscopes Olympus, Japan SZ61-C-SET
Stereo Microscope Lighting Olympus, Japan KL 1600 LED
confocal microscopy Zeiss, Germany LSM780
Imaris Bitplane, Switzerland Version 7.6.4 or above
Matlab The MathWorks, Inc., USA
Excel for Mac  Microsoft

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References

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Neuroscience Ausgabe 120, Synapse aktive Zone Bruchpilot Lichtexposition
Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht
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Sugie, A., Möhl, C.,… More

Sugie, A., Möhl, C., Hakeda-Suzuki, S., Matsui, H., Suzuki, T., Tavosanis, G. Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light. J. Vis. Exp. (120), e55176, doi:10.3791/55176 (2017).

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