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Neuroscience

के Synaptic मॉड्यूलेशन का विश्लेषण Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/55176
Automatic Translation
1,2,5, 3, 4, 1,2, *4, *5
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम कैसे नंबर और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर फोटोरिसेप्टर में synaptic सक्रिय क्षेत्रों के स्थानिक वितरण यों को दिखाने के लिए, एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग आणविक मार्कर के साथ प्रकाश डाला, और प्रकाश के लिए लंबे समय तक निवेश करने के बाद उनके मॉडुलन।

Abstract

तंत्रिका तंत्र अनुकूल और विभिन्न उत्तेजनाओं को प्रतिक्रिया करने में उल्लेखनीय क्षमता है। यह तंत्रिका समायोजन काफी हद तक synaptic स्तर पर प्लास्टिसिटी के माध्यम से हासिल की है। सक्रिय क्षेत्र (AZ) प्रीसानेप्टिक झिल्ली कि न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज मध्यस्थता और पाड़ प्रोटीन की एक घने संग्रह से बना है पर क्षेत्र है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की Azs (ड्रोसोफिला) फोटोरिसेप्टर प्राकृतिक परिवेश प्रकाश करने के लिए लंबे समय तक निवेश करने के बाद आणविक remodeling गुजरना। इस प्रकार neuronal गतिविधि के स्तर AZ की आणविक संरचना को पुनर्व्यवस्थित करने और कार्यात्मक उत्पादन के नियमन में योगदान कर सकते हैं।

Immunohistochemistry को प्रकाश जोखिम सेट-अप तैयार करने से शुरू, इस प्रोटोकॉल विवरण कैसे नंबर, स्थानिक वितरण, और delocalization ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर में Azs पर synaptic अणुओं के स्तर यों की। छवि विश्लेषण sof का प्रयोगtware, GFP जुड़े हुए AZ घटक Bruchpilot के समूहों प्रत्येक R8 फोटोरिसेप्टर (R8) अक्षतंतु टर्मिनल के लिए पहचान की गई। पता चला Bruchpilot स्पॉट स्वचालित रूप से अलग-अलग R8 एक्सोन को सौंपा गया। अक्षतंतु साथ मौके आवृत्ति के वितरण की गणना करने के लिए, हम एक स्वनिर्धारित सॉफ्टवेयर प्लगइन लागू किया है। प्रत्येक अक्षतंतु के शुरू बिंदु और अंत बिंदु मैन्युअल में परिभाषित किया गया है और प्रत्येक Bruchpilot मौके की स्थिति के शुरू और अंत बिंदु के बीच लाइन को जोड़ने पर पेश किया गया था। Bruchpilot समूहों की संख्या के अलावा, हम भी समूहों के भीतर Bruchpilot-GFP के delocalization स्तर मात्रा। इन मापों विस्तार विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में एक न्यूरॉन में spatially हल synaptic गतिशीलता उत्तेजनाओं को प्रतिबिंबित।

Introduction

synaptic समारोह के मॉडुलन तंत्रिका तंत्र की उल्लेखनीय क्षमता ठीक जवाब या पर्यावरण उत्तेजनाओं को बदलने के लिए अनुकूल करने के लिए योगदान देता है। प्रेस्य्नाप्तिक पुटिका रिहाई संभावना समायोजन अन्तर्ग्रथनी शक्ति 1 को नियंत्रित करने का एक तरीका है। Synaptic पुटिका रिहाई सक्रिय क्षेत्र (AZ), प्रीसानेप्टिक झिल्ली 2 की एक विशेष क्षेत्र में जगह लेता है। AZ विशिष्ट प्रोटीन 3 के एक कैसेट, 4 की विशेषता है। अधिकांश AZ विधानसभा के लिए योगदान दे प्रोटीन अत्यधिक नेमाटोड, कीड़े और स्तनधारियों 5 में संरक्षित कर रहे हैं। हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि neuronal गतिविधि के स्तर AZ, जो बदले में दोनों इन विट्रो और इन विवो 6, 7 में कार्यात्मक उत्पादन के नियमन के लिए योगदान की आणविक संरचना को नियंत्रित करता है> 8। हम पहले से पाया गया कि फोटोरिसेप्टर Azs प्राकृतिक परिवेश प्रकाश 9 को लंबे समय तक निवेश करने के बाद ड्रोसोफिला में आणविक remodeling गुजरना। इस हालत में, हमने देखा है कि Bruchpilot (बीआरपी) पॉजिटिव Azs की संख्या फोटोरिसेप्टर axons में कम हो गया था।

बीआरपी / कास्ट / ELKS परिवार प्रोटीन कशेरुकी और अकशेरुकी synapses 10 में Azs के मौलिक इमारत ब्लॉकों हैं। ड्रोसोफिला brp म्यूटेंट में, पैदा पुटिका रिहाई 11 को दबा दिया जाता है, 12। 17 सी टर्मिनल बीआरपी के अमीनो एसिड के अवशेष ड्रोसोफिला neuromuscular जंक्शन (NMJ) 13, 14 पर synaptic पुटिका क्लस्टरिंग के लिए आवश्यक हैं। इन अध्ययनों AZ संगठन और समारोह में इस अणु की केंद्रीय भूमिका का प्रदर्शन किया। एक हाल ही में विकसित आनुवंशिक उपकरण, पुनर्संयोजन (स्टार), बीआरपी के साथ synaptic टैगिंग के साथविशेष प्रकार की कोशिकाओं में vivo में मनाया जा सकता है, अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर पर और एक भी अन्तर्ग्रथन संकल्प 15 पर। इस उपकरण के लिए यह संभव मात्रात्मक जटिल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में synapses के अंतर्जात गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए बनाता है।

वहाँ confocal माइक्रोस्कोपी से प्राप्त आंकड़ों के आधार पर अन्तर्ग्रथन quantifications सहित कई अध्ययन किए गए हैं। Synaptic परिवर्तन लंबाई, क्षेत्र, मात्रा, घनत्व को मापने और अत्याधुनिक सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों के आधार पर संख्या की गणना के द्वारा मूल्यांकन किया गया है। उदाहरण के लिए, फ्रीवेयर ImageJ कुल synaptic क्षेत्र और ड्रोसोफिला NMJ 16 पर synaptic घनत्व उपायों के लिए एक मात्रा का ठहराव तरीका प्रदान करता है। पूर्व और पोस्टअन्तर्ग्रथनी मार्कर की colocalization साइटों की संख्या प्लगइन "puncta विश्लेषक" ImageJ सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म 17 पर उपलब्ध का उपयोग मात्रा की है। वैकल्पिक रूप से, एक बहु-बराबरadigm संख्यात्मक अभिकलन वातावरण आधारित कार्यक्रम, Synapse डिटेक्टर (synd), स्वचालित रूप से एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल न्यूरॉन्स की dendrites ट्रेस कर सकते हैं, और उसके बाद सेल शरीर में 18 से दूरी के एक समारोह के रूप में synaptic प्रोटीन का स्तर quantifies। सॉफ्टवेयर Synaptic puncta विश्लेषण (SynPAnal), confocal या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से अर्जित न्यूरॉन्स की 2 डी छवियों का तेजी से विश्लेषण के लिए डिजाइन किया गया है। इस सॉफ्टवेयर का प्राथमिक कार्य घनत्व और प्रोटीन puncta 19 की तीव्रता का स्वत: और तेजी मात्रा का ठहराव है। हाल ही में, एक स्वचालित सीखने आधारित अन्तर्ग्रथन का पता लगाने एल्गोरिथ्म 3 डी 20 में synaptic नंबर की मात्रा का ठहराव के लिए उत्पन्न किया गया है, 3 डी दृश्य की मदद से विश्लेषण (Vaa3D) सॉफ्टवेयर 21 का लाभ ले।

वाणिज्यिक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर भी synaptic quantifications के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। उदाहरण के लिए, fluorescentlyलेबल न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स या एक प्रेस्य्नाप्तिक AZ घटक सी में एकल अन्तर्ग्रथन संकल्प एलिगेंस 22 या ड्रोसोफिला घ्राण प्रणाली 23, 24, synapses के सैकड़ों की इजाजत देने के लिए तेजी से एक भी नमूना भीतर होती जा करने के साथ तीन आयामों में मात्रा निर्धारित किया गया है।

यहाँ, हम एक अनुकूलित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा एक तरीका मौजूद है प्लग में एक बहु-प्रतिमान संख्यात्मक अभिकलन वातावरण है कि उनकी संख्या, वितरण और आणविक घटकों के संवर्धन के स्तर सहित Azs के अर्द्ध स्वचालित रूप से कई पहलुओं, विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है में लागू AZ। इस प्रकार, इस जटिल विश्लेषण विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में अक्षतंतु टर्मिनलों में synaptic घटकों की गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए हमें की अनुमति दी। हम वयस्क मक्खी फोटोरिसेप्टर के उत्पादन synapses पर प्रकाश जोखिम के प्रभाव की जांच की। प्रक्रिया तीन चरणों में किया जाता है: 1)प्रकाश जोखिम, 2) विच्छेदन, immunohistochemistry और confocal इमेजिंग, और 3) छवि विश्लेषण के लिए तैयार करना।

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Protocol

प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित विशेष रूप से ड्रोसोफिला के साथ काम शामिल है और जर्मनी और जापान में पशु कल्याण कानूनों के अधीन नहीं हैं।

1. प्रकाश जोखिम की स्थिति

  1. मक्खियों कि फोटोरिसेप्टर R8 न्यूरॉन्स (R8s) में बीआरपी-GFP visualizing के लिए sensless-flippase (Sens-FLP) और bruchpilot-FRT बंद FRT-GFP (बीआरपी-एफएसएफ GFP) 15 ले जाने को तैयार है। एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) के भीतर जीनोमिक ठिकाना एन्कोडिंग brp इस बीआरपी-एफएसएफ-GFP निर्माण उत्पन्न करने के लिए संशोधित किया गया था। मक्खियों इस संशोधित बीएसी बीआरपी-GFP की अभिव्यक्ति को ले जाने में अंतर्जात विनियामक दृश्यों के नियंत्रण में है, लेकिन FRT बंद FRT कैसेट 15 की sensless-flippase मध्यस्थता हटाने के बाद R8 फोटोरिसेप्टर तक ही सीमित। ध्यान दें कि Sens-FLP शायद ही कभी R7s में flippase व्यक्त करता है।
  2. एक 12 घंटे ली में मक्खियों रखेंght / लार्वा चरण से 12 घंटे अंधेरे चक्र (एलडी) 25 डिग्री सेल्सियस पर जब तक eclosion (चित्रा 1 ए)।
  3. eclosion के बाद 6 घंटे और उन्हें उड़ान भरने भोजन युक्त एक नई शीशी में जगह - मक्खियों 0 लीजिए।
  4. एक पारदर्शी तीन चरणों (41 सेमी की ऊंचाई 21 सेमी का एक आधार, 4 सेमी की मोटाई और प्रत्येक चरण के लिए 13 सेमी की ऊंचाई) (चित्रा 1 बी) के साथ एक्रिलिक राल के बने रैक में शीशियों सेट करें।
  5. एक डिजिटल प्रकाश मीटर (चित्रा 1 सी) का उपयोग करते हुए 1,000 लक्स के एक औसत तीव्रता के साथ रोशनी प्रदान करने के लिए रैक और एक एलईडी पैनल के बीच की दूरी को समायोजित करें।
  6. के लिए 1 मक्खियों रखें - निम्न स्थितियों में से एक के तहत 3 डी: एक छोटी सी इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर लगातार अंधेरे (डीडी), 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे चक्र (एलडी), या लगातार प्रकाश (डालूँगा) (आंकड़े 1 ए और 1 सी)।

2. विच्छेदन, immunohistochemistry और इमेजिंग

  1. संदंश के साथ उड़ दिमाग काटना, 4% के लिए के साथ उन्हें ठीकrmaldehyde और Chaoptin के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी (1:50) और पिछले प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के आधार पर 25 फोटोरिसेप्टर के दृश्य के लिए एक दूसरे एंटीबॉडी के साथ immunostain। संक्षेप में:
    1. पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 (0.1% पीबीटी) तैयार करें। यह समाधान एंटीबॉडी ऊतक प्रवेश सुधार करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    2. सीओ 2 पैड पर मक्खियों anesthetize, सही जीनोटाइप को सुलझा सकते हैं और उन्हें एक पेट्री 0.1% पीबीटी साथ भरा पकवान के लिए स्थानांतरण।
    3. सूंड नीचे संदंश स्टिक और अन्य संदंश के साथ क्रमश: सही है और छोड़ दिया आँखों से दूर खींच।
    4. सूंड और श्वासनली मस्तिष्क से जुड़ी निकालें।
    5. आरटी पर 0.1% पीबीटी के 150 μL युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में संदंश के साथ मस्तिष्क स्थानांतरण।
    6. भीतर 2.1.3 से 10 मिनट दोहराने - 2.1.5 के रूप में संभव के रूप में कई दिमाग प्राप्त करने के लिए।
    7. 16% formaldehyde के 50 μL ट्यूब में जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण।
    8. कमरे में लगानेवाला में दिमाग को सेते50 मिनट के लिए तापमान।
    9. तीन बार ध्यान दे ट्यूब में दिमाग को छोड़ने के लिए, एक micropipette के साथ 0.1% पीबीटी के 200 μL के साथ धोएं।
    10. पिछले धोने के बाद, 0.1% पीबीटी हटाने और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ने के लिए, तैयार इस प्रकार है: 0.3% पीबीटी (0.3% पीबीएस में ट्राइटन X-100) विरोधी Chaoptin एंटीबॉडी के 4 μL (अंतिम कमजोर पड़ने 1 के 196 μL के लिए जोड़ : 50) फोटोरिसेप्टर के दृश्य के लिए।
    11. 4 डिग्री सीओ / एन पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में दिमाग को सेते हैं।
    12. एक micropipette के साथ 0.1% पीबीटी के 200 μL के साथ धो 3x।
    13. पिछले धोने के बाद, 0.1% पीबीटी हटाने और 0.3% एक माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त पीबीटी के 200 μL जोड़ें।
    14. 4 डिग्री सीओ / एन पर अंधेरे में यह सेते हैं।
    15. एक micropipette के साथ 0.1% पीबीटी के 200 μL के साथ तीन बार धोएं।
  2. बढ़ते के लिए, दो छोटे बूँदें एक बढ़ते मध्यम के (प्रत्येक 2 μL) एक micropipette के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड के केंद्र में लगभग 2 सेमी DISTA पर डालएक दूसरे से nce।
  3. दो coverslips, एक-एक बूंद पर रखें और लगभग 0.2 मिमी coverslips के बीच एक संकरी खाई छोड़ दें।
  4. coverslip के शीर्ष पर एक बढ़ते मध्यम के 15 μL रखें और बढ़ते मध्यम में एक micropipette के साथ दिमाग में जोड़ें।
  5. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, (चित्रा 2) दो coverslips के बीच संकरी खाई में ऊपर उदर पक्ष के साथ दिमाग की स्थिति।
  6. शीर्ष पर एक coverslip जगह और coverslip स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग नमूना (चित्रा 2) को ठीक करने के किनारों को सील।
  7. दिमाग की छवियों को एक confocal खुर्दबीन के साथ प्राप्त करते हैं। एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस (1.4 एनए) और एक 2.6X डिजिटल जूम का प्रयोग करें। 0.5 माइक्रोन से एक कदम आकार के साथ दूसरे ऑप्टिक नाड़ीग्रन्थि मज्जा के 20 से अधिक ऑप्टिकल वर्गों उत्पन्न करता है।

3. स्पॉट, भूतल वस्तुओं, शुरू अंक और अंत अंक की पीढ़ी

  1. नंबर यों, distribution और बीआरपी-GFP puncta के delocalization स्तर, ढेर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त खोलने के लिए और 3 डी छवियों (चित्रा 3) के पुनर्गठन। ध्यान दें कि इस अध्ययन में कदम Imaris के साथ प्रदर्शन किया गया था।
  2. प्रत्येक R8 अक्षतंतु टर्मिनल के लिए स्थान का पता लगाने मॉड्यूल द्वारा बीआरपी-GFP puncta को पहचानें।
    1. "नए स्पॉट जोड़ने" का चयन करें।
    2. एल्गोरिथ्म सेटिंग्स में "सेगमेंट केवल एक ब्याज के क्षेत्र" का चयन करें। मज्जा स्वयं में एक R8 अक्षतंतु टर्मिनल का चयन करें।
    3. बीआरपी-GFP संकेत के स्रोत चैनल का चयन करें।
      नोट: R7 और R8 फोटोरिसेप्टर एक्सोन विरोधी Chaoptin (चित्रा 3) के साथ immunolabeled थे। केवल R8, हालांकि, बीआरपी-GFP puncta होता है और इस तरह आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है (चित्रा 3 ए)। इसके अलावा, R8 के समापन बिंदु एम 3 मज्जा परत में प्रवेश बिंदु पर विरोधी Chaoptin पॉजिटिव एक्सोन के thinning से पहचाना जा सकता है।
    4. अनुमान XY व्यास टी सेटओ 0.35 माइक्रोन और स्थान का पता लगाने में "पृष्ठभूमि घटाव" बंद की जाँच करें।
    5. "गुणवत्ता" फिल्टर प्रकार में चयन करें और स्वचालित रूप से फिल्टर। उसके बाद समाप्त क्लिक करें।
    6. अन्य अनुसंधान एक्सोन (चित्रा 3 बी) के लिए से 3.2.1 टी 3.2.5 दोहराएँ।
  3. R8 एक्सोन में बीआरपी-GFP के delocalization स्तर को मापने के लिए, प्रत्येक अक्षतंतु (चित्रा 3 सी) के लिए "भूतल" समारोह के साथ सतह वस्तुओं उत्पन्न करते हैं।
    1. "नए सतहों जोड़े" का चयन करें।
    2. एल्गोरिथ्म सेटिंग्स में "सेगमेंट केवल एक ब्याज के क्षेत्र" का चयन करें। तो स्वयं मज्जा में एक R8 अक्षतंतु टर्मिनलों का चयन करें।
    3. फोटोरिसेप्टर का स्रोत चैनल का चयन करें।
    4. बंद की जाँच करें "चिकनी"।
    5. सीमा में "निरपेक्ष तीव्रता" का चयन करें।
    6. चेक "सक्षम"। "बीज अंक व्यास" 0.5 माइक्रोन है।
    7. चुनें फिल्टर प्रकार "गुणवत्ता" और "voxels की संख्या", और फिर अपने आप को फिल्टरबड़ी सफाई।
    8. "संपादित करें" पर जायें और अन्य गैर दिलचस्प एक्सोन पर उत्पन्न सतहों के टुकड़े को हटा दें।
    9. अन्य अनुसंधान एक्सोन (चित्रा 3 सी) के लिए 3.3.8 - 3.3.1 से दोहराएँ। नोट: कुछ सतह वस्तुओं दुबलापन और M2 परत पर फोटोरिसेप्टर में कमजोर संकेत की वजह से बाधित कर रहे थे, लेकिन वे अभी भी शुरू से अंत अंक के लिए एक ही वस्तु के रूप में माना जाता था।
  4. मज्जा neuropil में प्रत्येक न्यूरॉन साथ बीआरपी-GFP puncta के वितरण की पहचान करने के लिए, माप बिंदु समारोह (चित्रा 3 डी) के साथ शुरू बिंदु और अंत बिंदु को परिभाषित।
    1. "नई माप अंक जोड़े" का चयन करें। फिर "संपादित करें" का चयन करें और "वस्तु की सतह" का चयन सतह वस्तुओं के शीर्ष के साथ एक दूसरे को काटना।
    2. आदेश में एम 1 परत में आर axons की सतह वस्तुओं के शीर्ष पर माप अंक रखो। ये अब शुरू अंक (चित्रा 3 डी) के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।
    3. "नई माप अंक जोड़े" का चयन करें।फिर "संपादित करें" का चयन करें और "वस्तु की सतह" का चयन सतह वस्तुओं के नीचे के साथ एक दूसरे को काटना।
    4. आदेश में एम 3 परत में आर axons की सतह वस्तुओं के तल पर माप अंक रखो। ये अब अंत अंक (चित्रा 3 डी) के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।
  5. GFP चैनल से पृष्ठभूमि संकेत घटाना, M6 परत (चित्रा 3E) में दो आर एक्सोन के लिए सतह वस्तुओं, धब्बे, शुरू अंक और अंत अंक उत्पन्न करते हैं।
    1. "नए सतहों जोड़े" का चयन करें।
    2. एल्गोरिथ्म सेटिंग्स में "सेगमेंट केवल एक ब्याज के क्षेत्र" का चयन करें। तो स्वयं M5 और M6 परत के बीच एक R7 अक्षतंतु टर्मिनल का चयन करें।
    3. फोटोरिसेप्टर का स्रोत चैनल का चयन करें।
    4. बंद की जाँच करें "चिकनी"।
    5. सीमा में "निरपेक्ष तीव्रता" का चयन करें।
    6. चुनें फिल्टर प्रकार "गुणवत्ता" और "voxels की संख्या", तो स्वचालित रूप से फिल्टर।
    7. "नए स्थानों जोड़ें";।
    8. "स्वत: निर्माण जाएं, मैन्युअल रूप से संपादित" का चयन करें।
    9. "वस्तु के केंद्र" का चयन करें और 3.5.1 से उत्पन्न सतह वस्तु के भीतरी क्षेत्र में एक स्थान जोड़ - 3.5.6।
    10. एक और R7 अक्षतंतु टर्मिनल के लिए 3.5.9 - 3.5.1 से दोहराएँ।
    11. "नई माप अंक जोड़े" का चयन करें। फिर "संपादित करें" का चयन करें और M6 परत में R7 अक्षतंतु टर्मिनल की नोक के दो सतह वस्तुओं के शीर्ष पर माप अंक डाल दिया। ये अब शुरू अंक के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।
    12. "नई माप अंक जोड़े" का चयन करें। फिर "संपादित करें" का चयन करें और M6 परत में R7 अक्षतंतु टर्मिनल की नोक के दो सतह वस्तुओं के तल पर माप अंक डाल दिया। ये अब अंत अंक (चित्रा 3E) के रूप में परिभाषित कर रहे हैं।

4. स्पॉट की संख्या की गणना, स्पॉट आवृत्ति और वितरण अनुकूलित छवि डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ बीआरपी-GFP के संवर्धन का स्तर

  1. फ़ाइल की प्रतिलिपि"XtquantifySynapseSNR.m" और Imaris एक्सटी matlab फ़ोल्डर में "कार्य" फ़ोल्डर। ध्यान दें कि इस अध्ययन में गणना मैटलैब में लागू एक स्वनिर्धारित प्लगइन के साथ प्रदर्शन किया गया था। वेबसाइट (से प्लगइन डाउनलोड https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo )।
  2. n धब्बे, एन सतहों और 2 माप बिंदु वस्तुओं, प्रत्येक युक्त n माप अंक (- 3.4 3.1 से तैयार) के साथ एक डाटासेट खोलें। पहली माप बिंदु उद्देश्य सभी एक्सोन के लिए प्रारंभ पदों को परिभाषित करता है। दूसरा माप बिंदु उद्देश्य सभी एक्सोन के अंत की स्थिति को परिभाषित करता है। दोनों माप बिंदु वस्तुओं माप अंक की एक ही नंबर (कि axons की संख्या है) की आवश्यकता है।
  3. इमेज प्रोसेसिंग निष्पादित >> कस्टम> अन्तर्ग्रथन का पता लगाने के 6 बनाम atsushis।
  4. मेटाडाटा को चेक करें और मामले में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पिक्सेल आकार बदलने के लिए यह सही नहीं है।
  5. perf के लिए चैनल का चयनस्पॉट क्षेत्रों और cytoplasmic क्षेत्रों (बीआरपी-GFP के साथ चैनल) की तीव्रता विश्लेषण के ormance।
  6. परिणामों के निर्यात के लिए फ़ाइल नाम को परिभाषित करें।
  7. डिब्बे और प्रतिशत में अक्षतंतु लंबाई की संख्या को परिभाषित करें। और के रूप में "10" डिब्बे के रूप में "100%" (आंकड़े -4 ए और 4 बी) डिब्बे की सीमा की संख्या दर्ज करें।
  8. स्पॉट और बीआरपी-GFP delocalization विश्लेषण के लिए अन्य cytoplasmic क्षेत्रों के क्षेत्रों को परिभाषित करें। दर्ज धब्बे के रूप में "0.35 माइक्रोन" और आसपास के रूप में "50 माइक्रोन" क्षेत्र की चौड़ाई त्रिज्या। स्पॉट त्रिज्या puncta GFP संकेत (0.35 मीटर व्यास, एक बुंदकी पर केंद्रित) के लिए इस क्षेत्र को परिभाषित करता है। आसपास के क्षेत्र की चौड़ाई cytoplasmic क्षेत्र में GFP संकेत के लिए इस क्षेत्र को परिभाषित करता है (50 माइक्रोन व्यास, बुंदकी पर केंद्रित है, लेकिन केवल R8 सहित और कोशिका द्रव्य में सभी जगह क्षेत्रों को छोड़कर) (आंकड़े -4 ए और 4C)।
  9. रुको जब तक सभी न्यूरॉन मास्क कार्रवाई कर रहे हैंऔर पीडीएफ फाइलों (आंकड़े 4 बी और 4C) और एक स्प्रेडशीट में आगे के विश्लेषण के लिए एक सीएसवी तालिका के रूप में निर्यात किया। सीएसवी तालिका स्पॉट की संख्या, "cytoplasmic क्षेत्र" और "स्थान" सभी R8 एक्सोन के लिए प्रत्येक बिन में अधिकतम संकेत तीव्रता में औसत संकेत तीव्रता भी शामिल है।
  10. एक डाटासेट पृष्ठभूमि संकेत के घटाव के लिए 3.5 में तैयार खोलें।
  11. 4.9 - 4.3 से वर्णित के रूप में छवि प्रसंस्करण प्रदर्शन।
  12. कुल संख्या के औसत और एक स्प्रेडशीट (आंकड़े 4D और 4E) में बीआरपी-GFP puncta के वितरण की गणना।
  13. "Cytoplasmic क्षेत्र" में "स्थान" पृष्ठभूमि संकेत में औसत तीव्रता से घटाया अधिकतम तीव्रता से विभाजित में औसत तीव्रता के अनुपात से एक स्प्रेडशीट में बीआरपी-GFP संकेत के delocalization के औसत की गणना (चित्रा 4F) ।

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Representative Results

ड्रोसोफिला के यौगिक आंख शामिल ~ 780 ommatidia, (R1-8) फोटोरिसेप्टर के प्रत्येक युक्त आठ प्रकार के। R7 और R8 परियोजना के दूसरे ऑप्टिक नाड़ीग्रन्थि, मज्जा, जहां वे परतों M6 और एम 3, क्रमश: 26 में synapses के लिए फार्म उनके axons। फोटोरिसेप्टर R8 सक्रिय क्षेत्रों की आणविक संरचना पर प्रकाश करने के लिए लंबे समय तक निवेश के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम स्टार विधि 15 का फायदा उठाया। बीआरपी की अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर fluorescently एक flippase Sens-FLP से निकाली गई R8 फोटोरिसेप्टर में व्यक्त के साथ बीआरपी-एफएसएफ-GFP में स्टॉप कोडोन बाहर flipping द्वारा लेबल रहे थे। 25 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 ए) में 3 डी डालूँगा, एलडी या डीडी समय की इसी अवधि के लिए में eclosion के बाद - मक्खियों के लिए 1 रखा गया था। 1,000 लक्स प्रकाश में मक्खियों को बेनकाब करने के लिए, मक्खियों एक ऐक्रेलिक राल रैक (चित्रा 1 बी) में स्थापित किया है और एक ही दूरी पर रखा गया थाएक छोटी सी इनक्यूबेटर (चित्रा 1 सी) में एलईडी प्रकाश स्रोत से।

Immunostaining के बाद, विच्छेदित दिमाग संकरी खाई में दो coverslips के बीच एक खुर्दबीन स्लाइड पर दृश्य और बीआरपी-GFP puncta की मात्रा का ठहराव के लिए ऊपर की ओर का सामना करना पड़ दिमाग (चित्रा 2) के उदर पक्ष के साथ रखा गया था। जिसके परिणामस्वरूप बीआरपी-GFP संकेत मज्जा (चित्रा 3 ए) में R8 के भीतर अलग puncta के लिए स्थानीय।

संख्या की गिनती और बीआरपी-GFP puncta के वितरण को मापने, और R8s में बीआरपी-GFP संकेत के delocalization स्तर का मूल्यांकन करने के लिए, एक अनुकूलित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लगइन एक बहु-प्रतिमान संख्यात्मक अभिकलन वातावरण 9, 27 में विकसित किया गया था। सबसे पहले, puncta प्रत्येक R8 (चित्रा 3 बी) के लिए एक स्थान का पता लगाने समारोह से पता चला रहे थे। बाद में, सतहप्रत्येक R8 के एस delocalization स्तर (चित्रा 3 सी) के मूल्यांकन के लिए उत्पन्न किया गया। अंत में, हम क्रमश: प्रत्येक फोटोरिसेप्टर पर एम 1 परत के ऊपर और एम 3 परत के नीचे शुरू अंक और अंत अंक परिभाषित AZ वितरण (चित्रा 3 डी) को मापने के लिए। भूतल वस्तुओं, धब्बे, शुरू अंक और M6 परत में दो R7 अक्षतंतु टर्मिनलों के लिए अंत अंक भी GFP चैनल (3E चित्रा) से पृष्ठभूमि संकेत घटाना उत्पन्न किया गया। संख्या (चित्रा 4D), वितरण (आंकड़े -4 ए, 4 बी और 4E) और delocalization स्तर के परिणाम (आंकड़े -4 ए, 4C और 4F) स्वचालित रूप से कस्टम एक बहु-प्रतिमान संख्यात्मक अभिकलन वातावरण में लिखा प्लग द्वारा गणना कर रहे हैं । हमने पाया है कि बीआरपी असतत puncta की संख्या में काफी डालूँगा की स्थिति (आंकड़े 4D और 4E) में रखा मक्खियों की R8 फोटोरिसेप्टर में कम हो गया था। जोड़नाitionally, हमने पाया कि R8 synapses सभी एम 3 परत करने के लिए एम 1 से axonal शाफ्ट के साथ वितरित किए गए, लेकिन घनत्व एम 1 और एम 3 परतों (चित्रा 4E) पर अधिक था। बीआरपी-GFP के delocalization स्तर के सभी रोशनी की स्थिति (चित्रा 4F) में कोई बदलाव नहीं किया गया था। यह fluorescently बीआरपी (बीआरपी-छोटी चेरी) 28 है, जो, जैसा कि हम पहले की रिपोर्ट में स्पष्ट रूप से 9 डालूँगा (चित्रा 4 जी) में दूर तक फैला हो जाता है की लघु संस्करण टैग का स्थानीयकरण के विपरीत है। हमने सुझाव दिया है कि delocalized बीआरपी-छोटी चेरी संकेत AZ 9 से disassembling के बाद बीआरपी-छोटी टुकड़ा के अनुचित प्रसंस्करण से संबंधित हो सकता है। अन्य परीक्षण किया AZ प्रोटीन के अलावा, fluorescently DLiprin-α या ड्रोसोफिला रिम बाध्यकारी प्रोटीन (DRBP) निर्माणों puncta की संख्या में कमी और डालूँगा में एक स्पष्ट delocalization प्रदर्शित चिह्नित। इसके विपरीत, fluorescently टैग Dsyd -1 या कोलाहल (सीएसी) करना के बाद भी डालूँगा (चित्रा 4 जी) एक वृद्धि की cytoplasmic संकेत प्रदर्शित नहीं। इस प्रकार, मापने व्यवस्थित है कि क्या संकेत AZ प्रोटीन के प्रसंस्करण को समझने के लिए cytoplasmic प्रासंगिकता का हो सकता है हो जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: निर्धारित प्रकाश की तीव्रता को एक्सपोजर के लिए स्थितियां तैयार करना। (ए) eclosion के बाद प्रकाश जोखिम प्रोटोकॉल। डीडी, सतत अंधेरे; एलडी, 12 घंटे प्रकाश / 12 घंटे अंधेरे; डालूँगा, प्रकाश के लिए लगातार जोखिम। दिमाग के लिए उड़ान भरने के समय कोष्ठक (पिछले प्रकाशन 9 से अनुकूलित) में संकेत पर विच्छेदित कर रहे थे। (बी) शीशियों एक स्वनिर्धारित एक्रिलिक पारदर्शी रैक में जुड़ रहे हैं। (सी) एक्रिलिक रैक और दो पैनल का नेतृत्व एक छोटी सी मशीन में डाल दिया और 1000 लक्स की एक प्रकाश की तीव्रता को मक्खियों को बेनकाब करने के लिए समायोजित कर रहे हैं।एस / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: नमूना तैयार करना। (ए) पूरे घुड़सवार मस्तिष्क की तैयारी। (बी - डी) की तैयारी के योजनाबद्ध ड्राइंग। (सी, डी) की तैयारी के पार वर्गों। दिमाग के उदर पक्ष (सी) के बीच coverslips (डी) ऊपर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: स्पॉट, भूतल वस्तुओं और माप अंक की पीढ़ी। 15 Sens-FLP Recombinase का उपयोग कर के साथ उत्पन्न। एंटी Chaoptin (नीला) R7 और R8 फोटोरिसेप्टर एक्सोन प्रकाश डाला गया। स्केल पट्टी, 5 माइक्रोन। (ख) प्रत्येक R8 अक्षतंतु टर्मिनल के लिए स्थान का पता लगाने मॉड्यूल द्वारा बीआरपी-GFP puncta की पहचान। (सी) R8 एक्सोन में बीआरपी-GFP के delocalization स्तर को मापने के लिए क्षेत्रों ( "भूतल वस्तुओं", नीला) और मौके क्षेत्रों ( "स्पॉट वस्तुओं", सफेद) अक्षतंतु का पता चला। (डी) शुरू अंक और अंत अंक स्वयं "माप बिंदु" समारोह के साथ स्थापित कर रहे हैं 3 डी अंतरिक्ष में प्रत्येक अक्षतंतु के उन्मुखीकरण को परिभाषित करने के लिए और एक समन्वय प्रणाली पर जो बीआरपी-GFP मौके पेश कर रहे हैं परिभाषित करने के लिए। (ई) सतह वस्तुओं, धब्बे, शुरू अंक और अंत अंक M6 परत में दो R7 अक्षतंतु टर्मिनलों कि R8 शामिल नहीं है के लिए पृष्ठभूमि संकेत घटाना उत्पन्न कर रहे हैंGFP चैनल की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: संख्या, वितरण और बीआरपी-GFP puncta के Delocalization स्तर की मात्रा। (ए) प्रक्रिया R8 में delocalized बीआरपी-GFP संकेत के स्तर को मापने के लिए उपयोग की योजनाबद्ध ड्राइंग। बीआरपी-GFP puncta पहचान कर रहे हैं और दो क्षेत्रों के उनके आसपास परिभाषित कर रहे हैं: "स्थान" क्षेत्र और "cytoplasmic" क्षेत्र। प्रारंभ और अंत अंक जोड़ने लाइन 10 विभाजन में विभाजित है। (बी, सी) अनुकूलित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक बहु-प्रतिमान संख्यात्मक अभिकलन वातावरण में लिखा प्लगइन से आउटपुट। प्रत्येक बीआरपी-GFP बुंदकी समन्वय के लिए एक लाइन शुरू PO से न्यूरॉन का प्रतिनिधित्व करने का अनुमान हैअंत बिंदु करने के लिए (बी) Int। स्केल पट्टी, 5 माइक्रोन। बीआरपी-GFP puncta पहचान कर रहे हैं और दो क्षेत्रों के उनके आसपास परिभाषित कर रहे हैं: "स्थान" क्षेत्र और "cytoplasmic" क्षेत्र (सी), (A) schematized के रूप में। (डी - एफ) बार रेखांकन puncta (डी), उनके वितरण (ई) और R8 अक्षतंतु डीडी में (एफ) प्रति बीआरपी-GFP के delocalization स्तर (83 एक्सोन / 7 दिमाग), एलडी की कुल संख्या की तुलना (107 एक्सोन / 5 दिमाग) और डालूँगा (226 एक्सोन / 15 दिमाग)। (G) बार रेखांकन delocalization एलडी में बीआरपी-छोटी चेरी का स्तर (74 एक्सोन / 7 दिमाग) और डालूँगा (70 एक्सोन / 5 दिमाग) एलडी में, GFP DLiprin-α (67 एक्सोन / 7 दिमाग) और डालूँगा की तुलना (52 एक्सोन / 6 दिमाग), एलडी में GFP DRBP (70 एक्सोन / 7 दिमाग) और डालूँगा (83 एक्सोन / 6 दिमाग), GFP Dsyd -1 एलडी में (48 एक्सोन / 5 दिमाग) और डालूँगा (69 एक्सोन / 7 दिमाग), और एलडी में CAC-GFP (31 एक्सोन / 5 दिमाग) और डालूँगा (27 एक्सोन / 5 दिमाग)। *** पी <0.0001, ** पी <0.001, * पी <0.0 5, एनएस p> 0.05; वेल्च के सुधार के साथ unpaired टी परीक्षण दो पूंछ। त्रुटि बार मतलब की मानक त्रुटि से पता चलता है। (A) (ई) और (छ) योजनाबद्ध ड्राइंग और (घ) डेटा, पिछले एक प्रकाशन 9 से अनुकूलित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो 1
पूरक वीडियो: डाटा प्रोसेसिंग का विवरण Imaris प्लगइन "Synapse Trafo" के साथ प्रदर्शन किया। डाटा प्रोसेसिंग की चर्चा। इस वीडियो को वर्णन करने Imaris प्लगइन "synapse_trafo" द्वारा किया जाता परिवर्तन और डेटा प्रसंस्करण कदम के समन्वय के लिए एक छोटी व्याख्यान में शामिल है।5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

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Discussion

इस अध्ययन में, हम कैसे एक समान प्रकाश की तीव्रता को मक्खियों को बेनकाब करने के लिए प्रकाश की स्थिति तैयार करने के लिए दिखाया। हम न केवल एक synaptic मार्कर puncta की संख्या मात्रा निर्धारित है लेकिन यह भी स्थानिक एक्सोन साथ synapses के घनत्व को हल करने और cytoplasmic क्षेत्रों में मार्कर प्रोटीन के स्तर को मापने के delocalization सकता है। ये तीन आकलन हमें विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों में एक न्यूरॉन के स्तर पर synaptic गतिशीलता के विवरण का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देते हैं। हमारी प्रोटोकॉल अलग synaptic प्रोटीन के लिए बल्कि किसी भी डेटा है कि कबरा संकेतों शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम दिमाग के बढ़ते है। ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर दूसरी ऑप्टिक नाड़ीग्रन्थि मज्जा को उनके axons परियोजना। प्रत्येक फोटोरिसेप्टर अक्षतंतु straightforwardly स्कैन किया जा सकता है, तो घुड़सवार दिमाग सही ढंग से एक खुर्दबीन स्लाइड पर रखा गया था। सही बढ़ते भी छवि विश्लेषण Softwa साथ फोटोरिसेप्टर का चयन करता हैकार्यों को आसान पुन। प्रत्येक फोटोरिसेप्टर क्षेत्र puncta की संख्या और delocalization स्तर की गिनती के लिए मैन्युअल रूप से चयनित किया जाना है। प्रारंभ और अंत अंक भी मैन्युअल चुने गए हैं। जब तक एक मात्रा का ठहराव के लिए आगे बढ़ सकते हैं इन तैयारियों एक अपेक्षाकृत लंबे समय की आवश्यकता है। R8 एक्सोन का लाभ यह है कि वे unbranched कर रहे हैं और प्रत्येक R8 अक्षतंतु अलग है। इस एक जैसे एक साधारण पृथक न्यूरॉन इन अनुप्रयोगों के लिए सिफारिश की है, क्योंकि यह न्यूरॉन की सटीक क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है। साथ ही, इस अविशिष्ट puncta और सतहों अन्य न्यूरॉन्स से निकाली गई छुटकारा पाने के लिए मदद करता है। इस दृष्टिकोण में एक सीमा है, तथापि, जेड प्रक्षेपण की गहराई है। puncta के संकेत तीव्रता Z ढेर की गहरी परतों में कम हो जाता है। ऊतक समाशोधन तरीकों जैसे एक SeeDB2 29 से पारदर्शी दिमाग तैयारी इस सीमा को पार और एक स्पष्ट संकेत कबरा की इमेजिंग की अनुमति भी गहरा मस्तिष्क में मदद कर सकता है।

हमारा आद्यकर्नल संभवतः एक नैनो पैमाने पर और लाइव इमेजिंग के साथ synaptic संगठन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सुपर संकल्प इमेजिंग संयोजन (जैसे, प्रेरित उत्सर्जन कमी (STED) माइक्रोस्कोपी, स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान), फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम), संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) आदि) सैद्धांतिक मॉडलिंग के साथ के बारे में हमारी समझ को उन्नत किया गया है संरचना और synapses के आणविक गतिशीलता। उदाहरण के लिए, बीआरपी के नैनोस्कोपिक संगठन ड्रोसोफिला NMJ 30 पर प्रत्यक्ष तूफान (घ तूफान) द्वारा सुपर संकल्प इमेजिंग के साथ एक एकल आणविक संकल्प पर मूल्यांकन किया गया था। हमारी प्रोटोकॉल एक प्रेस्य्नाप्तिक सक्रिय क्षेत्र में एक और पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एक भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर आगे समझने के लिए कैसे synapses एक यंत्रवत स्तर पर विनियमित रहे हैं की एक भी सक्रिय क्षेत्र अणु की गतिशीलता की मात्रा का ठहराव के लिए अनुकूलित किया गया था। इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल आणविक कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतारहने वाले जानवरों में synapses पर आंदोलन। वास्तव में, बीआरपी-GFP immunostaining पर निर्भर बिना देखे जा सकते हैं। इस प्रकार, R8 एक्सोन में प्रेस्य्नाप्तिक विकास दो photon माइक्रोस्कोपी 15 के साथ जीवित पशुओं में imaged किया गया है। यह पता लगाने के लिए और अलग अलग समय बिंदुओं पर धब्बे का विश्लेषण करने के बाद सतहों और विशिष्ट न्यूरॉन्स की स्थिति हमारे प्रोटोकॉल में परिभाषित कर रहे हैं से रहने वाले जानवरों में सक्रिय क्षेत्र घटकों के कबरा संकेत ट्रैक करने के लिए संभव है।

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Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर उपयोगी सुधार, विचार विमर्श और टिप्पणियों के लिए टी Stürner के लिए आभारी हैं; मक्खी शेयरों को उपलब्ध कराने के लिए SL Zipursky; इमेज प्रोसेसिंग के प्रदर्शन के लिए एम Schölling। छवि विश्लेषण के भाग ए Kakita की प्रयोगशाला में किया गया था। यह काम शुरू हुआ अनुसंधान के लिए विदेश में अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन और JSPS फैलोशिप (एएस), JSPS अध्येताओं (एसएच एस।), ग्रांट-इन-एड (24800024), अभिनव क्षेत्रों पर (25110713), Mochida द्वारा समर्थित किया गया ताकेदा, Inamori, दाइची सैंक्यो-, Toray मूलाधार (टीएस), DZNE केंद्रीय वित्त पोषण (जीटी) और DZNE प्रकाश माइक्रोस्कोपी सुविधा (मुख्यमंत्री)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vial Hightech, Japan MKC-20
Plug Thermo Fisher Sciehtific, USA AS-275
Customized transparent rack made of acrylic resin  Shin-Shin Corporation, Japan a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step
Cool incubator MITSUBISHI ELECTRIC, Japan CN-40A
LED panel MISUMI, Japan LEDXC170-W
Digital light meter CEM DT-1301
Fly pad Tokken, Japan TK-HA03-S
Petri dish (35 x 10 mm) Greiner Bio-One International, Germany 627102
PBS tablet Takara, Japan T900
Triton X-100 Wako, Japan 160-24751
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
1.5 mL tube Sarstedt, Germany A. 152X
Formaldehyde 16% NEM, Japan 3152
Pipetman P-200 Gilson F123601 
Pipetman P-20 Gilson F123600
Pipetman P-2 Gilson F144801
anti-chaoptin antibody DSHB 24B10
Alexa568-conjugated anti-mouse antibody Life Technologies A-11031
VECTASHIELD Mounting Medium Vector Laboratories, Inc. H-1000
Microscope slide (76 x 26 mm) Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany
Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) Zeiss, Germany 474030-9000-000
Industrial Microscopes Olympus, Japan SZ61-C-SET
Stereo Microscope Lighting Olympus, Japan KL 1600 LED
confocal microscopy Zeiss, Germany LSM780
Imaris Bitplane, Switzerland Version 7.6.4 or above
Matlab The MathWorks, Inc., USA
Excel for Mac  Microsoft

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References

  1. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
  2. Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
  3. Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
  4. Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
  5. Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
  6. Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
  7. Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
  8. Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
  9. Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
  10. Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
  11. Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
  12. Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
  13. Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
  14. Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
  15. Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
  16. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
  17. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  18. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  19. Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
  20. Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
  21. Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
  22. Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
  23. Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
  24. Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
  25. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  26. Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
  27. Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
  28. Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
  29. Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  30. Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 120, फोटोरिसेप्टर Synapse सक्रिय क्षेत्र है Bruchpilot प्रकाश जोखिम
के Synaptic मॉड्यूलेशन का विश्लेषण<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क के बाद फोटोरिसेप्टर
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Sugie, A., Möhl, C.,… More

Sugie, A., Möhl, C., Hakeda-Suzuki, S., Matsui, H., Suzuki, T., Tavosanis, G. Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light. J. Vis. Exp. (120), e55176, doi:10.3791/55176 (2017).

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