Abstract
Zebrafisk embryoner tilbyder en ideel eksperimentelle system til at studere komplekse morfogenetiske processer på grund af deres lette tilgængelighed og optisk gennemsigtighed. Især posterior krop forlængelse er en vigtig proces i fosterudviklingen, ved hvilken flere væv deformationer handle sammen for at styre dannelsen af en stor del af kroppen akse. For at overholde denne proces ved langsigtede time-lapse billeddannelse er det nødvendigt at anvende et monterings teknik, der giver tilstrækkelig støtte til at opretholde prøver i den korrekte retning under overførsel til mikroskopet og erhvervelse. Desuden skal monteringen også tilvejebringe tilstrækkelig bevægelsesfrihed for udvæksten af den bageste organ regionen uden at påvirke dens normale udvikling. Endelig skal der være en vis grad i alsidighed monteringsmetode for at tillade billeddannelse af forskellige billeddannende set-ups. Her præsenteres en monteringsteknik til afbildning af udviklingen af posterior organ elongation i zebrafisk D. rerio. Denne teknik indebærer montering embryoner, således at hoved og blommesækken regioner er næsten udelukkende indgår i agarose, mens den bageste kroppen regionen til at forlænge og udvikle sig normalt. Vi vil vise, hvordan det kan tilpasses til opretstående, omvendt og vertikalt lys ark mikroskopi set-ups. Mens denne protokol fokuserer på montering embryoner til billeddannelse til den bageste organ, kunne det let tilpasses til direkte billedvisning af flere aspekter af zebrafisk udvikling.
Introduction
Posterior organ forlængelse er en vigtig proces af fosterudviklingen, hvorved embryo strækker sig til dannelse af en stor del af kroppen akse. Det er et eksempel på en kompleks morfogenetisk proces, hvor multiple celle adfærd handle koordineret for at generere morfogenese på niveau med individuelle væv. Disse differential væv deformationer derefter handle sammen for at generere forlængelsen af den bageste legeme ved hele strukturen niveau. For at forstå, hvordan disse processer styres og koordineres under udvikling, skal vi være i stand til at følge disse processer på flere skalaer (dvs. på niveau med molekyler, celler, celle populationer og væv), og at relatere dette direkte til morfogenese af hele strukturen .
Zebrafisk embryoner er ideelle til billedbehandling posterior krop forlængelse som deres optisk transparens og lille størrelse giver mulighed for anvendelse af minimalt invasiv lys imaging tilgange velegnet til live billeddannelse. 1 Dette er blevet dokumenteret ved en række nyere publikationer, der har kastet lys over posterior krop udvikling på niveau med molekyler, 2 enkelte celler, 3 og inter-væv adfærd, 4 samt på niveau med cellepopulationen og hele orgel. 5
Avancerede billedteknik såsom konfokal, multi-foton mikroskopi og selektiv plan belysning mikroskopi (SPIM) aktiverer den langsigtede billeddannelse af udviklingsprocesser med nedsat virkning af lys toksicitet og foto-blegning. Solide teknikker til montering af levende prøver er nødvendige for at opnå tre mål: 1) tilstrækkelig støtte til at opretholde prøver i den korrekte retning under overførsel til mikroskopet og under erhvervelse, 2) tilstrækkelig bevægelsesfrihed af prøven for at tillade udvækst af den posteriore organ regionen uden at påvirke dens normale develling, og endelig 3) en vis grad i alsidighed monteringsmetode for at tillade billeddannelse af forskellige billeddannende set-ups.
Denne protokol indfører en monteringsteknik til afbildning af udviklingen af zebrafisk D. rerio. Denne teknik indebærer montering embryoer, således at hovedet og blommesæk regioner er næsten udelukkende inkluderet i agarose, mens den bageste kropsområde til at forlænges og udvikle sig normalt. Som sådan er det også en passende metode til den langsigtede billeddannelse af andre regioner i den krop som agarose muliggør imaging ved standard lys billeddannende teknikker. Denne protokol demonstrerer montering af embryoner i en lateral retning, selv om det også muligt at montere embryoner i alterative orienteringer. Det vil yderligere vise, hvordan man kan tilpasse metoden til opretstående, inverterede og vertikale lys ark mikroskopi opsætninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af løsninger og Trukket Glass Needle
- Foretag en 25x stamopløsning af tricaine (3-amino benzoesyreethylester, også kaldet ethyl-3-aminobenzoat) ved 4 mg / ml i 20 mM Tris pH 8,8 og bringe denne løsning ved pH 7. alikvot af 4 ml og opbevares ved -20 ° C.
BEMÆRK: bedøvelsesmiddel tricaine virker fortrinsvis på neurale spændingsstyrede natriumkanaler derved blokerer muskeltrækninger og bevægelse 6. - Foretag en brugsopløsning af tricaine i en slutkoncentration på 0,17 mg / ml i E3 embryo medium. 7
BEMÆRK: Gør tricaine brugsopløsning ekstemporalt som pH-værdien af denne løsning driver. - Opløs agarose med lavt smeltepunkt til en slutkoncentration på 1,5% i E3 embryo medium i et 50 ml rør ved opvarmning af opløsningen i en mikrobølgeovn. Lad denne opløsning ækvilibrere til 42 - 45 ° C i enten et vandbad eller bench-top inkubator. Hvis forberede store retter til lodretlys ark imaging (trin 4), gør yderligere 25 ml 1% standard smeltende agarose i E3 embryo medium.
- Brug borosilikatglas med endeløse kapillærer med dimensioner på OD 1,20 mm, ID 0,69 mm, længde 10 mm.
- Hvis kapillærer er trukket på den type opvarmning-filament nål aftrækker beskrevet i tabellen af udstyr og reagenser, bruge følgende indstillinger: Varme 600, Pull 120, Velocity 50, Time 225, Pressure 500. Med et par skarpe pincet, pause nålen lige forbi det punkt, hvor den bøjer at skabe et rent og skarpt nål til orientering af embryoner og fjerne overskydende agarose. En mikro-skalpel kan også anvendes til at fjerne overskydende agarose.
2. Indlejring af embryoer til Inverted eller Upright Microscopy
- Hæv embryoner op til et passende tidspunkt i E3 embryo medium. 7
- På den krævede scenen, dechorionate embryoner med et par skarpe pincet under en kikkert dissecTing mikroskop.
- Inkuber de dechorionated embryoner i mindst 5 min i tricaine brugsopløsning.
- Når den smeltede agarose opløsningen er afkølet til 45 ° C, brug en glas Pasteur-pipette for at overføre dechorionated embryo direkte i 50 ml rør med minimal overførsel af E3-medium.
- Fjern embryo sammen med ca. 1 ml monteringsmedium og tilsæt ca.. 100 pi monteringsmedium sammen med embryoet til den centrale cirkel med en 35 mm glas-bund petriskål med en 10 mm mikrobrønd.
- Som monteringsmedium sætter, flytte embryoet til kanten af cirklen af agarose med halen vendende udad (figur 1A). Brug kapillær nål til at opretholde embryoet i den ønskede laterale retning, indtil gelen er fuldstændigt indstillet. Til billedet posterior krop udvikling, sørge for at orientere embryo i så lateral en orientering som muligt. Derfor opretholde embryo i denne position ved omhyggelige Indregulets med kapillar nål.
BEMÆRK: Flere embryoner kan tilsættes til montering skålen på dette tidspunkt, hvis det kræves. Hvis dette er tilfældet, overføre lavtsmeltende agarose i fadet først og tilsæt embryoner til centrum af agarosen dråbe. Derefter skubbe embryoner ud til kanterne af glasset ring og orientere i den ønskede position. Op til seks embryoner kan monteres på denne måde, inden agarose bliver størknet.
3. Fjernelse af overskydende agarose Omkring Posterior Krop
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver den procedure, hvorved agarose fjernes fra området omkring den bageste krop. I tilfælde af posterior krop forlængelse, er det vigtigt at sikre, at halen kan vokse-out normalt. Ved at fjerne agarosen efter embryonet er blevet fuldstændig medtaget ved agarose, er embryonet venstre omsluttet af hovedområdet og ca. halvdelen af blommesækken.
- Når agarose dråbe har sat, oversvømme petri dish med tricaine brugsopløsning.
- Under en dissektion binokulært mikroskop med et transmitteret-lys bund, justere spejl position og vinkel af indfaldende lys, således at den stærke kontrast muliggør snittene i agarose ses tydeligt i transaktionen.
- For at udføre cut 1 (figur 1), brug kapillær nål eller mikro-skalpel til at skære agarose midtvejs langs blommen, fra en position lige posteriort for dannelse hjerte felt til positionen af somit 5 (5 th anterior somit).
- Start renskæring tilstødende til dannelse hjerte som vist, og den fulde vej gennem agarose til glasset.
- Hold kapillær eller mikro-skalpel dybt i agarose, og langsomt så op og ned, mens begyndt at gøre en lang snit over embryo som vist figur 1. Skær så tæt på embryo som muligt uden at punktere fosteret eller æggeblomme.
- Dernæst gør snit 2 og 3 (Figur 1 BEMÆRK: Skæring agarosen indtil kanten af glasset cirkel (som vist i figur 1) støtte til fjernelse af agarose som en komplet blok (trin 3.6). Men dette er ikke nødvendigt.
- Starter ved skæringspunktet mellem snit 1 og 3, foretage en langsom diagonalt snit i slutningen af snittet 2 mens langsomt løfte opad for at løsne kvadratet på agarose omgiver den bageste krop.
Bemærkninger: I nogle tilfælde vil dette blive frigivet i en blok, og selve behandlingens afslutning på én gang. I andre kan det tage flere forsøg på at dis-lodge hele agarose omgiver fosteret. - Med et par skarpe pincet, fjerne løsnet blåse af agarose fra embryonet medium. Til hjælp i denne proces, flytte agarose brikkerne til den side af skålen og bruge væggen af petriskålen som støtte samtidig løftes ud agarose stykker.
Figur 1: Diagrammer over Montering Set-ups. (A) Diagrammet viser positionen af den monterede embryo i centrum glas ring af en petriskål. Til højre er en zoom på embryonet med hver efterfølgende snit gennem de omkringliggende agarose vist med dottted røde linjer. (B) De monterede embryoner er afbildet i lateral view viser lette adgang til både omvendte og opretstående mål. (C) En lignende digram viser, hvordan embryoner kan monteres til vertikal lys ark imaging set-ups. venligst click her for at se en større version af dette tal.
- Hvis muskeltrækninger ikke er helt blokeret på det tidspunkt, tilsæt dråber tricaine fra stamopløsningen af 4 mg / ml, pH 7.
4. Montering af embryoer til Vertical Light-ark Microscopy
BEMÆRK: Dette er en variation af metoden ovenfor, at skitserede giver mulighed for adgang af flere mål for billeddannelse af prøver af vertikalt orienteret SPIM. Ideen bag denne variation er at løfte prøven lidt højere end bunden af skålen, for at tillade nem adgang af to billeddannende mål.
- Forud for at prøve at montere, belægge en 100 mm plast petriskål med 1% agarose i E3 medium til en højde på 5 mm og lad det sætte.
- Placer en dråbe af 1 ml med lavt smeltepunkt agarose til midten af skålen og tillade at indstille.
- Integrer embryoner i lavt smeltepunkt agarose som i afsnit 2. Men denne gang, fjerne fosteret fra 50 ml røragarose med en mindre dråbe opløsning (0,5 ml) og placere denne lille dråbe oven på 1 ml falde i midten af skålen.
- Brug kapillær nål for at placere embryo i centrum af den lille dråbe og opretholde sin korrekte orientering, indtil gelen er indstillet.
- Oversvømme fad med tricaine brugsopløsning og fjerne det overskydende agarose som i afsnit 3, men uden at skære gennem puden på 1% standard agarose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen ovenfor skitserede detaljer en alsidig teknik til montering af zebrafisk embryoner til langsigtet tid bortfalder billeddannelse. Et eksempel på dette er vist i figur 2A og i animeret / video figur 1. Embryoner blev injiceret ved 1 celle stadiet med mRNA der koder for det fluorescerende protein photoconvertible kikumeGR. Ved 15 somite stadium de blev monteret som beskrevet ovenfor og afbildet i 12 timer på et omvendt konfokalt mikroskop med en 10X objektiv. De resulterende konfokale stakke blev maksimalt forventes at blive vist som vist. Denne film viser klart, at den bageste krop får lov til at bevæge sig frit under hele filmen og viser lignende ændringer i morfologi som set i embryoner, der har lov til at udvikle sig frit af deres chorion under normale dyrkningsbetingelser.
Et yderligere eksempel er vist i F igur 2Bog animeret / video Figur 2. Her blev embryoner injiceret i 16 celle scenen med en kombination af mRNA'er koder histon 2B-mCherry protein (som mærker kerner) og eGFP: CAAX boks (som mærker membraner, for detaljer se reference 5). De blev derefter afbildes på en opretstående multifoton mikroskop med en nedsænkning i vand 25X objektiv som vist i diagrammet i figur 1B. Billeder blev taget i 3 timer fra 10 somite fase med henblik på at visualisere cellulære adfærd under tailbud formation. Celler kan ses at være generere aktive fremspring og retningsbestemte bevægelser som de tailbud former normalt.
Figur 2: Eksempler på Time-lapse Imaging af Posterior Krop Forlængelse ved 10 x forstørrelse. (A) på hinanden følgende rammeraf en repræsentativ film dækker processen med aksial forlængelse. Embryoner er vist i sidebillede med posterior til højre side af billedet. (B) på hinanden følgende rammer af en større forstørrelse film viser individuelle celle adfærd under tailbud formation. Embryoner er vist i sidebillede med posterior til højre. Stiplede linjer skitsere den danner tailbud. Små farvede linjer viser spor af kerner til at følge enkelte celle bevægelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Animerede / Video Figur 1: Time-lapse film af Posterior Krop Forlængelse af en KikumeGR mRNA indsprøjtet Zebrafisk Embryo af konfokalmikroskopi. Embryo er vist med anterior til venstre og plakatior til højre. Billeder blev taget ved 10 min intervaller på 10X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Animerede / Video Figur 2: Time-lapse film af Posterior Krop Forlængelse af en nuklear-mCherry og Membrane-GFP Labelled Zebrafisk Embryo afbildet af to-foton mikroskopi. Embryo er vist med anterior til højre og bageste til venstre. Billeder blev taget ved 2 min intervaller på 25X forstørrelse. Farvede linjer viser spor af celler i de sidste ti tid-trin for hver sporet celle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne montage teknik gør det muligt embryoner skal holdes stille under overførsel til mikroskopet og over langsigtede time-lapse imaging eksperimenter der sigter mod følgende bageste krop forlængelse på flere længdeskalaer. Desuden er det alsidigt, idet det giver mulighed for billedbehandling på begge opretstående og omvendt mikroskopi set-ups, og et forslag er lavet til, hvordan dette kan yderligere tilpasses vertikalt orienteret SPIM.
Et kritisk trin i denne protokol er den omhyggelige fjernelse af overskydende agarose omgiver den bageste organ, som er vigtig for at tillade normal udvikling af denne struktur. Det er vigtigt at passe her i ikke at beskadige embryo, især ved fjernelse af agarose omkring toppen af blommen. Desuden skal man passe, når du fjerner det afskårne agarose blok fra hele embryo, som nogle gange er det muligt at tabe fosteret fra formen under denne proces. Af disse årsager er en lav-kapacitetsfremgangsmåde that er ikke egnet til montering af mange zebrafisk embryoner samtidigt, i modsætning til allerede offentliggjorte fremgangsmåder, der anvender 3D trykt plast forme. 8, 9 Men embryoner er meget stabile ved denne montering metode, og derfor kan transporteres til mikroskopet meget lettere, og bevarer deres 3D-orientering i hele posterior krop forlængelse.
Et andet afgørende skridt er nøjagtigheden af den oprindelige laterale orientering af embryonet, undgå antero-posterior eller dorso-ventrale hældning. Enten tilt vil hinder for sideværts vision af den bageste organ forlængelse, som er den mest bekvemme synsvinklen til yderligere analyse. Den antero-posterior tilt vil desuden resultere i den bageste organ vokser op eller ned i forhold til det horisontale plan, hvilket vil betyde erhvervelse af højere stakke i z og dermed tids- bortfalder med en lavere tidsopløsning.
Denne metode er versatile og har givet mulighed for billeddannelse af celledeling satser med brugen af Fucci linie 5, 10 samt multi-skalar morfometriske analyser. 5 Da den dramatiske samlede forskydning af tailbud under forlængelsen af den bageste kropsakse, mål kun relativt lav forstørrelse kan bruges til at fange hele processen som vist i figur 2. Dette er fordi højere forstørrelse resultere i regionen af interesse forlader synsfeltet inden for 3 - 4 timer af konvertering (Video Figur 1). En måde til yderligere at forbedre billeddannelse af tailbud er at have en automatiseret sporing algoritme, der kan spore den samlede bevægelse af tailbud og juster x, y, z position af mikroskopbordet under erhvervelse. I betragtning af den forøgede stabilitet af embryoet i alle aksiale dimensioner med monteringselementet her beskrevne fremgangsmåde, bør det være muligt at foretage enen sådan fremgangsmåde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
