Abstract
Эмбрионы рыбок данио предлагают идеальную экспериментальную систему для изучения сложных морфогенетических процессов из-за легкости их доступности и оптической прозрачности. В частности, удлинение задний корпус является важным процессом эмбрионального развития, с помощью которых множественные деформации ткани действуют вместе, чтобы направлять формирование значительной части оси тела. Для того чтобы наблюдать этот процесс долгосрочного покадровой обработки изображений необходимо использовать монтажную технику, которая позволяет достаточную поддержку, чтобы сохранить образцы в правильной ориентации во время передачи в микроскоп и приобретения. Кроме того, крепление должно также обеспечить достаточную свободу движения для разрастания области тела заднего, не влияя на его нормальное развитие. Наконец, должна быть определенная степень в универсальности метода монтажа, чтобы позволить визуализацию на различных изображений наборах. Здесь мы представляем монтажную технику для визуализации развития заднего elongatio телап в данио D. rerio. Этот метод включает в себя монтаж эмбрионов таким образом, что участки головы и желтка почти полностью включены в агарозы, оставляя вне области тела задней удлиняется и нормально развиваться. Мы покажем , как это может быть адаптирована для вертикально, перевернутый и вертикальной световой микроскопии листа Наладки. Хотя этот протокол фокусируется на монтаже эмбрионов для визуализации для заднего тела, она легко может быть адаптирована для живого изображения нескольких аспектов данио развития.
Introduction
Задней тела удлинение является важным процессом в эмбриональном развитии, с помощью которого эмбрион простирается, чтобы сформировать большую часть оси тела. Это является примером сложного морфогенетического процесса, с помощью которого несколько поведение ячеек действуют скоординировано для генерации морфогенез на уровне отдельных тканей. Эти деформации дифференциальной ткани затем действовать вместе, чтобы сформировать удлинение заднего тела на уровне целого структуры. Для того, чтобы понять , каким образом контролируются и координируются в процессе развития этих процессов, мы должны быть в состоянии следовать за этими процессами в различных масштабах (т.е. на уровне молекул, клеток, популяций и клеточные ткани) и связать это непосредственно к морфогенеза всей структуры ,
Эмбрионы рыбок данио идеально подходят для формирования изображения заднего удлинения тела, как их оптическая прозрачность и малый размер позволяет для применения минимально инвазивной визуализации света подходы хорошо подходят для Livэлектронной визуализации. 1 Об этом свидетельствует ряд недавних публикаций , которые пролили свет на развитие заднего тела на уровне молекул, 2 отдельные клетки, 3 и между тканевые поведения, 4, а также на уровне популяции клеток и целого органа. 5
Передовые методы визуализации, такие как конфокальной, многофотонной микроскопии и селективной плоскости освещения микроскопии (SPIM) включаете долгосрочную визуализацию процессов развития со снижением эффекта легкой токсичности и фото-отбелки. Надежные методы для монтажа живых образцов необходимы для достижения трех целей: 1) достаточной поддержки для сохранения образцов в правильной ориентации во время передачи в микроскоп и во время приобретения, 2) достаточная свобода передвижения образца, чтобы для вырост область задней тела, не затрагивая его нормальную Develвитие, и, наконец, 3) в определенной степени в универсальности метода монтажа, чтобы обеспечить визуализацию на различных изображений наборах.
Этот протокол вводит монтажный метод для получения изображения на развитие данио Д. rerio. Этот метод включает в себя монтаж эмбрионов таким образом, что участки головы и желтка почти полностью включены в агарозы, оставляя область тела заднюю удлиняется и нормально развиваться. Таким образом, он также является подходящим методом для долгосрочной визуализации других регионов развивающегося тела, как агароза позволяет визуализации с помощью стандартных методов визуализации света. Этот протокол демонстрирует монтаж эмбрионов в боковой ориентации, хотя также можно монтировать эмбрионов в альтеративного ориентаций. Она будет и далее показано, как адаптировать метод вертикально, перевернутых и вертикальных световых листов микроскопии установок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление растворов и потянула Стекло иглы
- Сделать 25х исходный раствор Tricaine (3-амино-этиловый эфир бензойной кислоты, называемый также этиловый эфир 3-аминобензойной кислоты) в дозе 4 мг / мл в 20 мМ Трис, рН 8,8, и довести, что раствор при рН 7. аликвоты с помощью 4 мл и хранят при -20 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: анестетик Tricaine действует преимущественно на нейронные напряжения закрытого натриевых каналов , тем самым блокируя подергивание мышц и движение 6. - Сделать рабочий раствор Tricaine при конечной концентрации 0,17 мг / мл в среде E3 эмбриона. 7
Примечание: Сделать Tricaine рабочего раствора экспромтом как рН этого раствора дрейфует. - Растворите температура плавления агарозы с низкой до конечной концентрации 1,5% в Е3 эмбриона среды в 50 мл трубки путем нагревания раствора в микроволновой печи. Пусть это решение уравновешивания до 42 - 45 ° C в любой водяной бане или настольном инкубаторе. При приготовлении больших блюд для вертикальнойсветло-лист изображений (этап 4), чтобы дополнительно 25 мл 1% -ного стандартного плавление агарозы в Е3 эмбриона среде.
- Использование боросиликатного стекла с капиллярами накаливания с размерами OD 1,20 мм, ID 0,69 мм, длина 10 мм.
- Если капилляры натянул типа нагрева нити накала иглы съемника , описанной в Таблице оборудования и реагентов, используйте следующие настройки: Тепло 600, Pull 120, скорость 50, Время 225, давление 500. С парой острых щипцов, перерыв игла просто мимо точки, в которой она сгибается для создания чистой и острой иглой для ориентировки эмбрионов и удаления избытка агарозы. Микро-скальпель также может быть использован для удаления избытка агарозы.
2. Вложение зародыши для инверсией или Upright микроскопией
- Поднимите эмбрионов до соответствующей стадии в E3 эмбриона среде. 7
- На нужной стадии, dechorionate эмбрионы с парой острых щипцов под бинокулярным dissecтин микроскоп.
- Инкубируйте dechorionated эмбрионов в течение не менее 5 мин в рабочем растворе Tricaine.
- После того, как расплавленную агарозу как раствор охлаждают до 45 ° С, используют стекло пипетки Пастера, чтобы передать dechorionated эмбриона непосредственно в 50 мл пробирку с минимальной передачей E3 среды.
- Удалить эмбрион вместе с примерно 1 мл среды монтажа и добавьте ок. 100 мкл среды монтажа вместе с эмбрионом к центральной окружности 35 мм со стеклянным дном чашки Петри с 10 мм микролунку.
- Как установка установочная среда, переместите эмбрион к краю круга агарозы с хвостом наружу (Фигура 1А). Используйте капиллярную иглу для поддержания эмбриона в желаемой боковой ориентации, пока гель полностью не установлен. Для развития задней образа тела, заботиться, чтобы сориентировать эмбриона в качестве боковой ориентации, как это возможно. Таким образом, сохранить зародыш в этом положении путем тщательного adjustmenTS с капиллярной иглой.
Примечание: Несколько эмбрионы могут быть добавлены к монтажной чашке в этот момент, в случае необходимости. Если дело обстоит именно так, перенесите легкоплавкой агарозы в чашку и добавьте первый эмбрионов к центру агарозы капли. Затем раздвинуть эмбрионы к краям стеклянного кольца и ориентируют в требуемое положение. До шести эмбрионов может быть установлен таким образом, прежде чем агароза становится затвердевает.
3. Удаление излишков агарозном вокруг тела Posterior
Примечание: В этом разделе описана процедура, с помощью которого агарозы удаляется из области, окружающей задний корпус. В случае удлинения задних тела, важно, чтобы убедиться, что хвост может подращивания нормально. Удаляя агарозы после того, как эмбрион был полностью включен агарозы, эмбрион остается обнесена области головы и примерно половину желтка.
- После агарозном падение установило, наводнение чашках диШ. с рабочим раствором Tricaine.
- Под рассекает бинокулярный микроскоп с переданным-светлым основанием, отрегулируйте положение зеркала и угла падающего света таким образом, что сильный контраст позволяет для сокращения агарозы, чтобы быть хорошо видно через операцию.
- Для выполнения вырезать 1 (рисунок 1), используйте капиллярную иглу или микро-скальпель , чтобы разрезать агарозы на полпути вдоль желтком, с позиции только позади формовочного поля сердца к положению сомит 5 (5 - й передняя сомитов).
- Начало первоначальный разрез, прилегающих к формовочной сердца, как показано, а также полный путь через агарозы к стеклу.
- Держите капилляр или микро-скальпель глубоко внутри агарозы, и медленно увидел вверх и вниз , в то время как начинают делать длинный разрез над эмбрионом , как показано на рисунке 1. Вырезать как можно ближе к эмбриону, как это возможно, не прокалывая эмбриона или желток.
- Затем, сделайте разрезы 2 и 3 (рис 1 Примечание: не Режущий агарозы до края стеклянного круга (как показано на рисунке 1) помогает при удалении агарозы в качестве полного блока (этап 3.6). Тем не менее, в этом нет необходимости.
- Начиная на пересечении разрезов 1 и 3, сделать медленный диагональный срез в направлении конца разреза 2 в то время как медленно поднимая вверх для того, чтобы сместить квадрат агарозы окружающих заднюю тела.
Примечания: В некоторых случаях это будет выпущен в одном блоке и операция завершается за один раз. В других случаях, это может занять несколько попыток дис-ложи все агарозы, окружающий зародыш. - С парой острых щипцов, удалите выбили бзамки агарозы из эмбриона среды. Чтобы помочь в этом процессе, перемещать агарозном части в сторону тарелки и использовать стенку чашки Петри в то время как поддержка подъема из агарозном куски.
Рисунок 1: Схемы Монтажное Наладки. (A) На диаграмме показано положение смонтированного эмбриона в пределах центра стеклянного кольца Петри. Справа является увеличение эмбриона с каждым последующим разрезом через окружающий агарозы показано с dottted красными линиями. (Б) смонтированные эмбрионы, показана на виде сбоку отображая легкость доступа для обоих перевернутых и вертикальных целей. (C) Аналогичный биграмма , показывающий , как эмбрионы могут быть установлены для вертикального света листа изображений Наладки. Пожалуйста , клИк здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Если подергивание мышц не полностью заблокирован в тот момент, добавьте капли Tricaine из маточного раствора 4 мг / мл, рН 7.
4. Монтаж Эмбрионы для вертикального световой микроскопии листа
Примечание: Это вариация на тему описанного выше метода, который позволяет для доступа нескольких задач для работы с изображениями образцов вертикально-ориентированной SPIM. Идея этой вариации, чтобы поднять образец немного выше, чем дно тарелки, чтобы обеспечить легкий доступ двух целей визуализации.
- До крепления образца пальто 100 мм пластиковая чашка Петри с 1% агарозы в Е3 среде до высоты 5 мм и позволяют установить.
- Поместите каплю 1 мл легкоплавкой агарозе в центр чашки и позволяют установить.
- Код для вставки эмбрионов в низкой температурой плавления агарозы как в разделе 2. Тем не менее, на этот раз, удалить эмбрион из 50 мл трубкиагарозы с меньшим каплю раствора (0,5 мл) и поместите эту небольшую каплю на верхней части по 1 мл падение в центр чашки.
- С помощью капиллярной иглы, чтобы поместить эмбрион в центре маленькой капли и поддерживать его правильную ориентацию до тех пор, пока гель не установлен.
- Наводнение блюдо с рабочим раствором Tricaine и удалить излишки агарозы, как и в разделе 3, но без разреза через подушку 1% стандартной агарозы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол описанных выше подробно универсальный метод для монтажа эмбрионов данио для длительного визуализации времени истечения. Пример этого показан на фигуре 2А , и в анимации / видео Рисунок 1. Эмбрионы вводили на стадии 1 клеток с мРНК, кодирующей photoconvertible флуоресцентный белок kikumeGR. На стадии 15 сомитов они были установлены, как описано выше, и отображены в течение 12 ч на инвертированный конфокальный микроскоп со объективом 10Х. Полученные конфокальной стеки были максимально проецируются, которые будут отображаться, как показано на рисунке. Этот фильм ясно показывает, что задняя тело может свободно перемещаться по всей продолжительности фильма и показывает аналогичные изменения в морфологии, как видно у эмбрионов, которым разрешено свободно их хориона развиваться в нормальных условиях культивирования.
Дополнительный пример показан на F igure 2Bи анимированные / видео Рисунок 2. Здесь, эмбрионы вводят на стадии 16 клеток с комбинацией мРНК , кодирующих гистонов 2B-mCherry белок (который нумерует ядра) и EGFP: CAAX коробку (что этикетки мембраны; подробнее см ссылку 5). Затем они были обследованы на вертикальном многофотонном микроскоп с погружением в воду 25X цели , как показанно на рисунке 1В. Изображения были взяты в течение 3 ч со стадии 10 сомитов для визуализации клеточных поведения во время формирования tailbud. Клетки можно увидеть, чтобы генерировать активные выступы и направления движения, как в tailbud форм нормально.
Рисунок 2: Примеры Интерв Визуализация Posterior тела Относительное удлинение при 10 - кратном увеличении. (A) последовательных кадровпредставительного фильма, охватывающего процесс осевого удлинения. Эмбрионы показаны на виде сбоку с кзади правой стороне изображения. (B) Последовательные кадры с большим увеличением фильм , показывающий поведение отдельных клеток во время формирования tailbud. Эмбрионы показаны на виде сбоку с задней справа. Пунктиром очертить образующую tailbud. Маленькие цветные линии показывают следы ядер, чтобы следовать отдельных движений клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Анимированные / Видео Рисунок 1: Время покадровой фильм Posterior тела удлинению мРНК KikumeGR Введенный эмбрионов рыбок данио конфокальной микроскопией. Эмбрион показан с передней слева и плакатаIOR вправо. Изображения были взяты с интервалом 10 мин при 10-кратным увеличением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Анимированные / видео Рисунок 2: Время покадровой фильм Posterior тела удлинению Эмбрион ядерных mCherry и мембранно-GFP Меченые данио рерио распечатанных с помощью двухфотонного микроскопии. Эмбрион показан с передней справа и задней слева. Изображения были сделаны с интервалом 2 мин при 25X увеличении. Цветные линии отображаются следы ячеек за последние десять временных шагов для каждой отслеживаемой ячейки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта монтажная техника позволяет эмбрионы должны храниться до сих пор в процессе передачи на микроскоп и более долгосрочных экспериментов покадровой обработки изображений, направленных на следующие заднего удлинения тела в различных масштабах длины. Кроме того, он является универсальным в том, что она позволяет для получения изображения на обоих в вертикальном положении и перевернутый микроскопии установки окна, и предложение делается для того, как это может быть дополнительно выполнен с возможностью вертикально ориентированной SPIM.
Важным шагом в этом протоколе является тщательное удаление избытка агарозы, окружающей задний корпус, который имеет важное значение для обеспечения возможности нормального развития этой структуры. Важно, чтобы заботиться здесь в не повреждая эмбрион, особенно при удалении агарозы вокруг верхней части желтка. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность при снятии блока вырезать агарозы из вокруг зародыша, а иногда можно потерять эмбрион из пресс-формы во время этого процесса. По этим причинам, это метод низкой пропускной способностью тхат не подходит для монтажа многих эмбрионов данио одновременно, в отличие от уже опубликованных методов, использующих 3D напечатаны пластиковых форм. 8, 9 Тем не менее, эмбрионы обладают высокой стабильностью при этом способ крепления и , следовательно , могут быть транспортированы к микроскопу гораздо проще, и сохраняют свою ориентацию 3D на протяжении удлинении задних тела.
Другим важным шагом является точность начальной боковой ориентации эмбриона, избегая любого переднезадней или спинно-вентральной наклона. Либо наклон будет препятствовать боковое видение расширения задней тела, которое является наиболее удобным углом зрения для дальнейшего анализа. Передне-задний наклон будет дополнительно результате в задней тела растет вверх или вниз по отношению к горизонтальной плоскости, что будет означать приобретение более высоких стопок в г и, таким образом временных провалов с более низким временным разрешением.
Этот метод веrsatile и позволило для визуализации скоростей клеточного деления с использованием линии Fucci 5, 10, а также мульти-скалярным морфометрического анализа. 5 Однако, учитывая резкое общее смещение tailbud во время удлинения оси задних тела, только относительно низкие цели увеличения может быть использован для захвата весь процесс, как это показано на рисунке 2. Это объясняется тем , что более сильное увеличение приводит в интересующей нас области покидает поле зрения в пределах 3 - 4 ч приобретения (Видео Рисунок 1). Таким образом, один из способов дальнейшего совершенствования визуализацию tailbud должен иметь автоматизированный алгоритм отслеживания, который может отслеживать общее движение tailbud и регулировать х, у, г положение столик микроскопа во время сбора. Учитывая повышенную устойчивость зародыша во всех осевых размеров с методом монтажа, описанного здесь, он должен быть поддающийсятакой подход.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
