Abstract
embriones de pez cebra ofrecen un sistema experimental ideal para estudiar los procesos morfogenéticos complejos debido a su facilidad de acceso y la transparencia óptica. En particular, la elongación posterior del cuerpo es un proceso esencial en el desarrollo embrionario mediante el cual múltiples deformaciones de tejido actúan juntos para dirigir la formación de una gran parte del eje del cuerpo. Con el fin de observar este proceso mediante formación de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, es necesario utilizar una técnica de montaje que permite un apoyo suficiente para mantener las muestras en la orientación correcta durante la transferencia al microscopio y de adquisición. Además, el montaje también debe proporcionar la suficiente libertad de movimiento para la derivación de la región posterior del cuerpo sin afectar su desarrollo normal. Por último, debe haber un cierto grado de versatilidad del método de montaje para permitir la formación de imágenes en diversas imágenes set-ups. A continuación, presentamos una técnica de montaje para obtener imágenes del desarrollo de elongatio posterior del cuerpon en el pez cebra D. rerio. Esta técnica consiste en embriones de tal manera que las regiones de la cabeza y del saco vitelino son casi en su totalidad incluidos en agarosa de montaje, dejando fuera de la región posterior del cuerpo para alargar y desarrollarse normalmente. Vamos a mostrar cómo esto puede ser adaptado para su posición vertical, invertida y vertical de la ficha técnica de microscopía de luz montajes. Si bien este protocolo se centra en los embriones para obtener imágenes de la parte posterior del cuerpo de montaje, que podría adaptarse fácilmente para la formación de imágenes en vivo de varios aspectos del desarrollo del pez cebra.
Introduction
Posterior elongación cuerpo es un proceso esencial en el desarrollo embrionario en la que el embrión se extiende para formar una gran parte del eje del cuerpo. Es un ejemplo de un proceso morfogenético complejo mediante el cual múltiples comportamientos celulares actúan coordinadamente para generar la morfogénesis en el nivel de los tejidos individuales. Estas deformaciones de tejido diferencial entonces actúan juntos para generar el alargamiento del cuerpo posterior en todo el nivel de la estructura. Para entender cómo estos procesos son controlados y coordinados durante el desarrollo, debemos ser capaces de seguir estos procesos en múltiples escalas (es decir, en el nivel de moléculas, células, las poblaciones de células y tejidos) y relacionar esto directamente a la morfogénesis de toda la estructura .
embriones de pez cebra son ideales para la elongación posterior del cuerpo de imagen como su transparencia óptica y pequeño tamaño permite la aplicación de impresión débil mínimamente invasiva enfoques adecuados para live imágenes. 1 Esto se ha evidenciado por una serie de publicaciones recientes que han arrojado luz sobre el desarrollo posterior del cuerpo a nivel de moléculas, 2 células individuales, 3 e inter-tejido comportamientos, 4, así como a nivel de la población de células y órganos en general. 5
Las técnicas de imagen avanzadas, como confocal, microscopía multifotónica y el plano selectiva microscopía de iluminación (SPIM) están permitiendo la formación de imágenes a largo plazo de los procesos de desarrollo, con una disminución del efecto de la toxicidad de la luz y foto-blanqueo. se requieren técnicas robustas para el montaje de muestras vivas para lograr tres objetivos: 1) el apoyo suficiente para mantener las muestras en la orientación correcta durante la transferencia al microscopio y durante la adquisición, 2) la suficiente libertad de movimiento de la muestra para permitir la derivación de la región posterior del cuerpo sin afectar a su desa normalesrrollo y, finalmente, 3) un cierto grado de versatilidad del método de montaje para permitir la formación de imágenes en diversas imágenes montajes.
Este protocolo presenta una técnica de montaje para la formación de imágenes el desarrollo del pez cebra D. rerio. Esta técnica consiste en embriones de montaje de tal manera que las regiones de la cabeza y el saco vitelino son casi totalmente incluyen en agarosa, dejando la región del cuerpo posterior para alargar y desarrollarse normalmente. Como tal, también es un método apropiado para la formación de imágenes a largo plazo de otras regiones del cuerpo en desarrollo como la agarosa permite obtener imágenes mediante técnicas de imagen la luz estándar. Este protocolo demuestra montaje de los embriones en una orientación lateral, aunque también es posible montar los embriones en orientaciones alterativas. Se mostrará aún más cómo adaptar el método para configuraciones de microscopía de luz hojas verticales, invertidos y verticales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de soluciones y sacó la aguja de cristal
- Hacer una solución 25x social de Tricaína (3-amino éster etílico del ácido benzoico, también llamado acetato de 3-aminobenzoato) a 4 mg / ml en 20 mM Tris pH 8,8, y llevar esa solución es a pH 7. Una alícuota de 4 ml y almacenar a -20 ° C.
NOTA: El Tricaína anestésico actúa preferentemente sobre los canales de sodio dependientes de voltaje neuronales bloqueando así espasmos musculares y el movimiento 6. - Hacer una solución de trabajo de tricaína a una concentración final de 0,17 mg / ml en medio de embrión E3. 7
NOTA: Hacer que el Tricaína solución de trabajo de manera extemporánea como el pH de esta solución se desplaza. - Disolver la agarosa de bajo punto de fusión a una concentración final de 1.5% en medio de embrión E3 en un tubo de 50 ml por calentamiento de la solución en un horno de microondas. Deje que esta solución se equilibre a 42 - 45 ° C, ya sea en un baño de agua o de sobremesa incubadora. Si la preparación de grandes platos para verticales-Hoja de luz de imagen (paso 4), hace 25 ml adicionales de 1% de agarosa de fusión estándar en medio de embrión E3.
- Utilizar el vidrio de borosilicato con filamento capilares con unas dimensiones de 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, longitud 10 mm.
- Si se tira de los capilares del tipo de calefacción-filamento extractor de aguja se describe en la tabla de equipos y reactivos, utilice la siguiente configuración: Calor 600, 120 Tire, Velocidad 50, Tiempo 225, 500. Presión Con un par de pinzas cortantes, ruptura la aguja justo después del punto en el que se flexiona para crear una aguja limpio y afilado para orientar embriones y eliminar el exceso de agarosa. Un micro-bisturí también se puede utilizar para eliminar el exceso de agarosa.
2. Incorporación de embriones para Microscopía vertical o invertida
- Elevar los embriones hasta la etapa apropiada en medio de embrión E3. 7
- En la etapa requerida, embriones dechorionate con un par de pinzas cortantes debajo de una disección binocularting microscopio.
- Incubar los embriones dechorionated durante al menos 5 min en la solución de trabajo de tricaína.
- Una vez que la solución de agarosa fundida se ha enfriado a 45 ° C, utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir el embrión dechorionated directamente en el tubo de 50 ml con transferencia mínima de medio E3.
- Eliminar embrión junto con aproximadamente 1 ml de medio de montaje y añadir aprox. 100 l de medio de montaje junto con el embrión al círculo central de un fondo de vidrio placa de Petri de 35 mm con un 10 mm de micropocillos.
- Como está fijando el medio de montaje, mueva el embrión hasta el borde del círculo de agarosa con la cola hacia el exterior (Figura 1A). Utilice la aguja capilar para mantener el embrión en la orientación lateral deseada hasta que el gel se ajusta por completo. Para el desarrollo posterior del cuerpo de la imagen, tener cuidado de orientar el embrión en el lateral como una orientación de lo posible. Por lo tanto, mantener el embrión en esta posición por adjustmen cuidadosasts con la aguja capilar.
NOTA: múltiples embriones se pueden añadir a la placa de montaje en este punto, si es necesario. Si este es el caso, transferir el bajo punto de fusión de agarosa en el plato primero y añadir los embriones para el centro de la gota de agarosa. A continuación, empuje los embriones a los bordes del anillo de vidrio y orientar en la posición deseada. Hasta seis embriones puede ser montado de esta manera antes de que la agarosa se solidifica.
3. Eliminación del exceso de agarosa alrededor del cuerpo posterior
NOTA: En esta sección se describe el procedimiento mediante el cual se extrae de agarosa de la región que rodea el cuerpo posterior. En el caso de la elongación posterior del cuerpo, es importante asegurarse de que la cola puede crecer de salida normalmente. Mediante la eliminación de la agarosa después de que el embrión ha sido completamente incluida por agarosa, el embrión se deja encerrado por la región de la cabeza y aproximadamente la mitad del saco vitelino.
- Una vez que la caída de agarosa se ha puesto, inundar el di Petrish con la solución de trabajo Tricaína.
- Bajo un microscopio binocular de disección con una base de luz transmitida, ajustar la posición del espejo y el ángulo de la luz incidente de tal manera que el fuerte contraste que permite que los recortes en la agarosa por verse claramente a través de la operación.
- Para realizar corte 1 (Figura 1), utilizar la aguja capilar o la micro-bisturí para cortar la mitad de camino de agarosa a lo largo de la yema, desde una posición justo posterior al campo que forman el corazón a la posición de la somite 5 (el 5º somite anterior).
- Iniciar el corte inicial adyacente al corazón formando como se muestra, y la forma completa a través de la agarosa al vidrio.
- Mantenga el capilar o micro-bisturí en lo profundo de la agarosa, y poco a poco vio arriba y abajo mientras empezando a hacer una larga incisión sobre el embrión como muestra la Figura 1. Cortar tan cerca del embrión como sea posible sin perforar el embrión o yema de huevo.
- A continuación, hacer cortes 2 y 3 (Figura 1 NOTA: Cortar la agarosa hasta que el borde del círculo de vidrio (como se muestra en la Figura 1) ayuda en la eliminación de la agarosa como un bloque completo (paso 3.6). Sin embargo, esto no es necesario.
- Comenzando en la intersección de los cortes 1 y 3, hacer un corte en diagonal lenta hacia el final del corte 2, mientras que levantar lentamente hacia arriba con el fin de desalojar la plaza de agarosa que rodea el cuerpo posterior.
Notas: En algunos casos, esto se dará a conocer en un solo bloque y la operación se completa de una sola vez. En otros, puede tomar varios intentos para dis-presenten el conjunto de agarosa que rodea al embrión. - Con un par de pinzas cortantes, retire la b desalojadocerraduras de agarosa del medio de embrión. Para ayudar en este proceso, mover las piezas de agarosa a un lado del plato y el uso de la pared de la placa de Petri como soporte mientras que el levantamiento de las piezas de agarosa.
Figura 1: Diagramas de montaje Set-ups. (A) El diagrama muestra la posición del embrión montado dentro del anillo de vidrio centro de una placa de Petri. A la derecha es un enfoque del embrión con cada corte sucesivo a través de la que rodea agarosa muestran con líneas rojas dottted. (B) Los embriones montados se diagrama en vista lateral que muestra la facilidad de acceso para ambos objetivos invertidos y verticales. (C) Un digram similar que muestra cómo los embriones pueden ser montados para la hoja de luz vertical de imagen montajes. Por favor, click aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Si espasmos musculares no está completamente bloqueado en ese punto, añadir gotas de tricaína de la solución madre de 4 mg / ml, pH 7.
4. El montaje de los embriones de Luz-Hoja vertical Microscopía
NOTA: Esta es una variación en el método descrito anteriormente que permite el acceso de múltiples objetivos para la obtención de imágenes de muestras por SPIM orientado verticalmente. La idea detrás de esta variación es levantar la muestra ligeramente más alto que el fondo del plato, para permitir un fácil acceso de los dos objetivos de formación de imágenes.
- Antes de muestrear de montaje, capa de un plástico placa de Petri de 100 mm con 1% de agarosa en medio E3 a una altura de 5 mm y dejar solidificar.
- Colocar una gota de 1 ml de agarosa de bajo punto de fusión al centro del plato y dejar solidificar.
- Insertar en embriones de agarosa de bajo punto de fusión como en el apartado 2. Sin embargo, esta vez, quitar el embrión desde el tubo de 50 mlde agarosa con una caída menor de la solución (0,5 ml) y colocar esta pequeña gota en la parte superior de la 1 ml caer en el centro del plato.
- Utilice la aguja capilar para colocar el embrión en el centro de la pequeña gota y mantener su orientación correcta hasta que se establece gel.
- Inundar el plato con la solución de trabajo Tricaína y eliminar el exceso de agarosa al igual que en la sección 3, pero sin cortar a través del colchón de agarosa al 1% estándar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El protocolo descrito anteriormente detalla una técnica versátil para el montaje de embriones de pez cebra para la imagen de lapso de tiempo a largo plazo. Un ejemplo de esto se muestra en la figura 2A y en animada / video Figura 1. Los embriones fueron inyectados en la etapa de 1 célula con ARNm que codifica la proteína fluorescente fotoconvertible kikumeGR. En la etapa 15 somite se montaron como se describió anteriormente y la imagen de 12 hr en un microscopio confocal invertido con un objetivo de 10X. Las pilas confocal resultantes se proyectan al máximo que se mostrará como se muestra. Esta película muestra claramente que el cuerpo posterior se le permite moverse libremente por toda la duración de la película y muestra cambios similares en la morfología como se observa en los embriones que se les permite desarrollarse libremente de su corion en condiciones normales de cultivo.
Un ejemplo adicional se muestra en la F igura 2By animación / vídeo de la figura 2. Aquí, los embriones fueron inyectados en la etapa de 16 células con una combinación de los ARNm que codifican la proteína histona 2B-mCherry (que las etiquetas de los núcleos) y eGFP: caja CAAX (que las etiquetas de las membranas; para más detalles, véase la referencia 5). Entonces ellos fueron imágenes en un microscopio multifotónica en posición vertical con un objetivo de inmersión en agua 25X como se esquematiza en la figura 1B. Se tomaron imágenes durante 3 horas desde la etapa 10 somite con el fin de visualizar comportamientos celulares durante tailbud formación. Las células pueden ser vistos estar generando protuberancias activos y los movimientos direccionales como las formas tailbud normalmente.
Figura 2: Ejemplos de Time-lapse del Cuerpo posterior alargamiento a 10 aumentos. (A) tramas consecutivasde una película representativa que cubre el proceso de alargamiento axial. Los embriones se muestran en la vista lateral con posterior en el lado derecho de la imagen. (B) tramas consecutivas de una película que muestra un aumento mayor comportamientos celulares individuales durante la formación tailbud. Los embriones se muestran en la vista lateral con posterior a la derecha. Las líneas de puntos describen el tailbud formando. líneas de colores pequeños muestran huellas de núcleos para seguir los movimientos celulares individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Animados / Vídeo Figura 1: Foto de intervalo de elongación posterior del cuerpo de un ARNm KikumeGR Inyectado embrión de pez cebra mediante microscopía confocal. Embrión se muestra con anterior a la izquierda y el cartelior a la derecha. Las imágenes fueron tomadas a intervalos de 10 min a un aumento de 10X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Animados / Vídeo Figura 2: Foto de intervalo de elongación posterior del cuerpo de un embrión nucleares y de membrana mCherry-GFP Etiquetado de pez cebra imágenes de microscopía de dos fotones. Embryo se muestra con anterior a la derecha y posterior a la izquierda. Las imágenes fueron tomadas a intervalos de 2 min a 25 aumentos. Líneas coloreadas muestran huellas de las células durante los últimos diez pasos de tiempo para cada célula de seguimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Esta técnica de montaje permite que los embriones que se le mantenga aún durante la transferencia al microscopio y más de los experimentos de imagen de lapso de tiempo a largo plazo destinados a la elongación posterior del cuerpo después en múltiples escalas de longitud. Además, es versátil en que permite la formación de imágenes en ambos microscopía en posición vertical e invertida montajes, y una sugerencia se hace para cómo esto puede ser adaptado además para SPIM orientado verticalmente.
Un paso crítico en este protocolo es la cuidadosa eliminación del exceso de agarosa que rodea el cuerpo posterior que es importante para permitir el normal desarrollo de esta estructura. Es importante tener cuidado aquí en no dañar el embrión, particularmente cuando la eliminación de la agarosa en la parte superior de la yema. Además, se debe tener cuidado al retirar el bloque de corte de agarosa de todo el embrión, ya que a veces es posible perder el embrión del molde durante este proceso. Por estas razones, este es un método tha bajo rendimientot no es adecuado para el montaje de muchos embriones de pez cebra de forma simultánea, en contraste ya que publicó métodos que utilizan moldes de plástico impresas en 3D. 8, 9 Sin embargo, los embriones son muy estables por este método de montaje y por lo tanto pueden ser transportados al microscopio mucho más fácil, y conservan su orientación 3D a lo largo de la elongación posterior del cuerpo.
Otro paso crítico es la precisión de la orientación lateral inicial del embrión, evitando cualquier antero-posterior o inclinación dorso-ventral. De cualquier inclinación impedirá la visión lateral de la extensión del cuerpo posterior, que es el ángulo más conveniente de vista para su posterior análisis. La inclinación antero-posterior será en consecuencia Además en el cuerpo posterior crecimiento hacia arriba o hacia abajo con respecto al plano horizontal, lo que significa la adquisición de pilas más altas en z y por lo tanto los tiempos de los lapsos con una resolución de tiempo inferior.
Este método es cincorsatile y ha permitido para formación de imágenes de las tasas de división celular con el uso de la línea Fucci 5, 10 así como los análisis morfométrico multi-escalar. 5 Sin embargo, dado el desplazamiento general dramática de la tailbud durante el alargamiento del eje del cuerpo posterior, objetivos sólo relativamente bajas de aumento se puede utilizar para capturar todo el proceso tal como se muestra en la Figura 2. Esto se debe a mayores resultados de aumento en la región de interés de abandonar el campo de visión dentro de 3 - 4 h de adquisición (Video Figura 1). Por lo tanto, una forma de mejorar aún más la formación de imágenes del tailbud es tener un algoritmo de seguimiento automatizado que puede seguir el movimiento global de la tailbud y ajustar la x, y, z de posición de la platina del microscopio durante la adquisición. Teniendo en cuenta el aumento de la estabilidad del embrión en todas las dimensiones axiales con el método de montaje descrito aquí, debe ser susceptible deTremendo acercamiento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
