Abstract
ゼブラフィッシュの胚は、アクセシビリティと光透過性の容易さのために複雑な形態形成過程を研究するための理想的な実験系を提供しています。具体的には、後部ボディ伸びは、複数の組織変形が体軸の大部分の形成を指示するために一緒に作用することにより、胚発生に不可欠なプロセスです。長期タイムラプス撮影することによって、このプロセスを観察するためには、十分な支持を顕微鏡及び取得に転送中に正しい方向で試料を維持することを可能にする実装技術を利用する必要があります。また、実装は、その正常な発達に影響を与えることなく、後部ボディ領域の伸長のための運動の十分な自由度を提供しなければなりません。最後に、多様なイメージング・セットアップにイメージングを可能にするために、実装方法の汎用性がある程度存在しなければなりません。ここでは、後部本体の開発を画像化するための実装技術を提供elongatioゼブラフィッシュD.レリオ中のn。この技術は、細長く、正常に発育する後部ボディ領域を残して、ヘッドと卵黄嚢の領域をほぼ完全にアガロース中に含まれるように胚をマウントすることを含みます。これは、直立反転および垂直光シート顕微鏡セットアップのために適合させることができる方法を紹介します。このプロトコルは、後部ボディ用イメージングのための胚をマウントするに焦点を当てているが、それは簡単にゼブラフィッシュの開発のさまざまな側面のライブイメージングのために適合させることができます。
Introduction
後部ボディ伸びが胚体軸の大部分を形成するように延びていることにより、胚発生に不可欠なプロセスです。これは、複数の細胞の挙動は、個々の組織のレベルでの形態形成を生成するために協調的に作用することにより、複雑な形態形成過程の一例です。これらの差動組織変形は、その後、構造全体のレベルで後部本体の伸長を生成するために一緒に働きます。これらのプロセスが制御され、現像時に調整されている方法を理解するために、我々は（分子、細胞、細胞集団と組織のレベルでIE）複数のスケールで、これらのプロセスに従うことができなければならず、全体の構造の形態形成に直接これを関連付けること。
その光学的透明性と小さなサイズは、最小侵襲性光イメージングのアプリケーションを可能にするようゼブラフィッシュの胚は、LIVによく適して近づいイメージング後部本体の伸長のために理想的です電子イメージング。 1これは、分子のレベル、2単セルで、3と間組織行動、4だけでなく、細胞集団全体の臓器のレベルで後部本体の開発に光を当てるしている最近の一連の刊行物によって証明されています。 5
このような共焦点、多光子顕微鏡法および選択的平面照明顕微鏡（SPIM）などの高度なイメージング技術は、光毒性および光退色の効果が低下した発生過程の長期イメージングを可能にしています。顕微鏡への転送時および取得時に正しい向きでサンプルを維持するために1）十分な支持の成長を可能にするために、サンプルの移動2）十分な自由：ライブのサンプルの実装のための堅牢な技術は、3つの目標を達成するために必要とされますその通常のdevelに影響を与えることなく、後部ボディ領域発、そして最後に3）多様なイメージング・セットアップにイメージングを可能にする実装方法の汎用性にある程度。
このプロトコルは、ゼブラフィッシュD.レリオの開発を撮像するための実装技術を紹介します。この技術は、細長く、正常に発育する後部ボディ領域を残して、ヘッドと卵黄嚢の領域をほぼ完全に、アガロース中に含まれるように胚をマウントすることを含みます。このように、それはまた、アガロース、標準の光画像化技術による画像化を可能にするように開発身体の他の領域の長期イメージングのための適切な方法です。代替の向きで胚をマウントすることも可能であるが、このプロトコルは、横方向の向きで胚の取り付けを示しています。さらに、直立反転および垂直光シート顕微鏡のセットアップのための方法を適応させる方法を紹介します。
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Protocol
1.溶液の調製とプルガラスニードル
- 20 mMトリスpHを8.8に4ミリグラム/ mLでトリカイン（3-アミノ安息香酸エチルエステルとも呼ばれる3-アミノ安息香酸エチル）の25倍ストック溶液を作成し、そのソリューションはpHである4 mLおよび店舗7.小分けに持ち込みます-20℃。
注：麻酔トリカイン、それによって筋肉のけいれんや運動6を遮断する神経電位依存性ナトリウムチャネルに優先的に作用します。 - E3胚培地中0.17ミリグラム/ mlの最終濃度でトリカインの作業溶液を作ります。 7
注：この溶液のpHが漂うとして即時作業溶液トリカインしてください。 - 電子レンジ内の溶液を加熱して50 mLチューブ中のE3胚培地中1.5％の最終濃度を低融点アガロースを溶解します。水浴またはベンチトップインキュベータのいずれかで45℃ - このソリューションは42に平衡化してみましょう。垂直のための大規模な料理を準備している場合光シートイメージング（ステップ4）、アガロースE3胚培地に1％の標準的な融解の追加の25mLのを作ります。
- OD 1.20ミリメートル、ID 0.69ミリメートル、長さ10mmの寸法のフィラメント毛細血管にホウケイ酸ガラスを使用してください。
- 毛細血管は、 機器および試薬の表に記載され加熱フィラメント針プラーの種類に引っ張られた場合は、次の設定を使用します。熱600は、鋭いピンセットで120、速度50、時間225、圧力500を引いて、ブレークちょうどそれが胚を配向し、過剰のアガロースを除去するためのクリーンでシャープな針を作成するために曲がるした時点過去の針。マイクロメスはまた、過剰なアガロースを除去するために使用することができます。
倒立または直立顕微鏡のための胚の2の埋め込み
- E3胚の培地中の適切な段階に胚を上げます。 7
- 両眼dissecの下に鋭いピンセットで必要な段階では、dechorionate胚ティン顕微鏡。
- トリカイン作業溶液中で少なくとも5分間dechorionated胚を培養します。
- 溶融アガロース溶液を45℃に冷却した後、E3媒体の最小の転送に50mlチューブに直接dechorionated胚を転送するために、ガラスパスツールピペットを使用します。
- 約1ミリリットルマウンティング培地と一緒に胚を取り出して、約追加します。 10ミリメートルのマイクロウェルと35ミリメートルのガラス底ペトリ皿の中央円に胚と一緒にメディアをマウントする100μlの。
- マウンティング媒体が設定されているように、（ 図1A）外側を向く尾を含むアガロースの円の端に胚を移動します。ゲルが完全に設定されるまで、所望の横方向の向きで胚を維持するために、キャピラリ針を使用してください。画像後部ボディの開発に、できるだけ横向きで胚を向けるように注意してください。したがって、慎重adjustmenによってこの位置に胚を維持キャピラリ針付きTS。
注：必要に応じて、複数の胚は、この時点で取り付け皿に添加することができます。このような場合は、最初の皿にアガロース低いが溶融転送し、アガロースドロップの中心に胚を追加します。その後、ガラスリングのエッジに胚を押し出すと、所望の位置に向けます。 6胚まで、アガロースが固化する前に、この方法を実装することができます。
後部の体の周りに余分なアガロースの3除去
注：このセクションでは、アガロースは、後部本体を囲む領域から除去されることにより、手順を説明します。後部本体の伸長の場合には、尾部が成長アウトできることを通常は保証することが重要です。胚が完全にアガロースによって含まれていた後、アガロースを除去することにより、胚は、頭部領域と卵黄嚢の約半分で囲まれたままです。
- アガロースドロップを設定したら、ペトリジをあふれさせますトリカイン作業溶液とのsh。
- 透過光ベースと解剖双眼顕微鏡下では、強いコントラストが操作して明確に見られるように、アガロースの削減を可能にするようにミラーの位置と入射光の角度を調整します。
- カットを実行するには1（ 図1）、ただ体節5（5 番目の位置に形成心臓領域に後方の位置から、卵黄に沿ってアガロース途中でカットするキャピラリ針またはマイクロメスを使用前方の体節）。
- 示すように形成心臓に隣接する最初のカット、およびガラスにアガロースを介して完全な道を開始します。
- 深いアガロース内の毛細管またはマイクロメスのままにし、 図1に示すように、胚を超える長いカットを作るために始めながら、ゆっくりと上下を見ました。胚や卵黄を穿刺することなく、可能な胚に近いカットします。
- 次に、カット2および3（ 図1を作ります注：ガラス円のエッジまでアガロースを切断（ 図1に示すように）完全なブロック（ステップ3.6）としてアガロースを除去するのに役立ちます。しかし、これは必須ではありません。
- カット1と3の交差点に出発し、ゆっくりと後部本体を囲むアガロースの二乗を除去するために、上向きに持ち上げながらカット2の終わりに向かってゆっくりと斜めカットを行います。
注：いくつかのケースでは、これは、1つのブロックに解放され、操作が一度に完了する。他では、それはディスロッジに胚周辺のアガロースをいくつかの試みがかかる場合があります。 - 鋭いピンセットで、外れBを削除胚培地からアガロースのロック。 、このプロセスを補助皿の側にアガロース片を移動し、アガロース片を持ち上げながら、支持体としてペトリ皿の壁を使用します。
図1：取付・セットアップのダイアグラム。 （A）図は、ペトリ皿の中心のガラスリング内に取り付けられた胚の位置を示しています。右側には、アガロースdottted赤線で示さ周囲を介して各連続したカットと胚のズームがあります。 （B）に取り付けられた胚は、両方反転して直立目的のためのアクセスのしやすさを表示する側面図に図解されています。 （C）胚は垂直光シートイメージングセットアップのために実装することができる方法を示す同様の2文字組。 CLくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらICK。
- 筋肉のけいれんが完全にその時点でブロックされていない場合は、4 mg / mlで、pHが7のストック溶液からトリカインの滴を追加します。
4.垂直ライトシート顕微鏡のための胚の取り付け
注：これはその上に概説した方法のバリエーションが垂直指向SPIMにより試料のイメージングのための複数の目標のアクセスを可能にしています。この変化の背後にある考え方は、2つの撮像目標の容易なアクセスを可能にするために、皿の底よりもわずかに高いサンプルを持ち上げることです。
- 5mmの高さに取り付け、コートE3培地中の1％アガロースでの100mmプラスチック製ペトリ皿をサンプリングし、設定することを可能にする前に。
- 皿の中央に1ミリリットルの低融点アガロースのドロップを置き、設定することができます。
- しかし項2のような低融点アガロース中に埋め込むの胚は、この時間は、50mlチューブから胚を除去しますソリューションのより小さな滴（0.5ミリリットル）でアガロースの皿の中央に1ミリリットル滴の上に、この小滴を配置します。
- 小滴の中心に胚を配置し、ゲルが設定されるまで、その正しい方向を維持するために、キャピラリ針を使用してください。
- トリカインワーキング溶液で皿をフラッディングし、セクション3のとしてではなく、1％標準アガロースのクッションを切断することなく、余分なアガロースを削除します。
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Representative Results
上記で概説したプロトコルは、長期的タイムラプスイメージングのためのゼブラフィッシュ胚の取り付けのための多目的な技術を詳しく説明しています。この例は、図2Aおよびアニメーション/ビデオ図1に示されています。胚は、mRNAがphotoconvertible蛍光タンパク質kikumeGRをコードすると1細胞期で注入しました。上記のように15体節段階でそれらをマウントし、10倍の対物レンズとの倒立型共焦点顕微鏡上で12時間、撮像されました。示すように、得られた共焦点スタックが最大限に表示されるように投影されました。この映画は、明らかに、後方本体が映画の存続期間全体にわたって自由に移動させ、通常の培養条件で自由に絨毛膜を開発することが許可されている胚に見られる形態の類似の変化を示していることを示しています。
さらなる例は、Fのigure 2bに示されていますそして、アニメーション/ビデオ図2。ここでは、胚は、ヒストン2B-mCherryをタンパク質をコードするmRNAの組み合わせで16細胞段階で注入した（つまり、核を標識する）およびEGFP：CAAXボックス（つまり膜をラベル;詳細は参考文献5を参照のこと）。 図1Bに図解しているよう彼らは、その後、水浸25Xを目的とした直立多光子顕微鏡で画像化しました。画像は、尾芽形成中に細胞の挙動を可視化するために10体節期から3時間に採取しました。細胞は、通常尾芽形態として活性な突起と方向の動きを生成することが分かります。
図 2：10 X の倍率 で後部ボディ伸びのタイムラプスイメージングの例 。 （A）連続するフレーム軸方向伸長のプロセスをカバーする代表的な映画の。胚は、画像の右側に後方と側面図に示されています。 （B）尾芽胚形成中に、個々の細胞の挙動を示す高倍率ムービーの連続するフレーム。胚は、右側に後方と側面図に示されています。点線は形成尾芽胚の概要を説明します。小さな色付きのラインは、個々のセルの動きに追従するために核のトラックを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アニメーション/ビデオ図 1：KikumeGR mRNAの後部ボディ伸びのタイムラプスムービーは、共焦点顕微鏡によってゼブラフィッシュ胚に注入しました。胚は、左とポスターを前方に示されています右にIOR。画像は、10倍の倍率で10分間隔で採取しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アニメーション/ビデオ図 2：二光子顕微鏡で画像化原子力-mCherryをおよび膜-GFP標識ゼブラフィッシュ胚の後部ボディ伸びのタイムラプスムービー。胚は、左に右後方に前方に示されています。画像は、25Xの倍率で2分間隔で採取しました。色付きのラインは、各追跡セルの最後の10時間ステップのための細胞のトラックを表示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この実装技術は、胚は、顕微鏡、複数の長さスケールで後部ボディ伸びを以下のことを目的としたオーバー長期的タイムラプスイメージング実験への転送中に静止保持することができます。それは両方の直立および反転の顕微鏡セットアップのイメージングを可能にし、提案が、これはさらに垂直に向けSPIMに適合させることができる方法のために作られているという点でまた、多目的です。
このプロトコルでの重要なステップは、この構造の正常な発達を可能にするために重要である後部本体を囲む過剰アガロースを慎重に除去することです。卵黄の上部の周囲アガロースを削除する場合は特に、胚にダメージを与えないで、ここで世話をすることが重要です。時にはこのプロセス中に型から胚を失うことが可能であるように、胚の周りからカットアガロースブロックを取り外す際に加えて、注意が必要です。これらの理由から、これは、低スループット法THAでありますtは対照的に、既に3Dプリントプラスチック金型を利用する方法を公開するために、同時に多くのゼブラフィッシュ胚の実装に適していません。 8,9しかしながら 、胚はこの実装方法により、非常に安定であり、したがって、はるかに容易に顕微鏡に搬送することができ、後部本体の伸長を通してそれらの3D姿勢を保持します。
もう一つの重要なステップは、任意の前後や背腹傾きを避け、胚の初期横向きの精度です。いずれかの傾斜は、さらなる分析のためのビューの最も便利な角度である後方本体延長の横方向のビジョンを排除します。前後傾斜は後部本体内の加算結果で育っ以下の時間分解能でzのため、時間の経過でより高いスタックの取得を意味します水平面、に関してダウンします。
この方法は、VEのですrsatileとするFucciライン5、10の使用だけでなく、マルチスカラー形態学的解析と細胞分裂速度の撮像を可能にしました。 5しかし、後部体軸の伸長時尾芽の劇的な全体的な変位を考慮すると、比較的低倍率の対物レンズは、 図2に示すようにプロセス全体をキャプチャするために使用することができます。取得の4時間（ ビデオ図1） -関心領域における高倍率の結果が3内の視野を残すためです。したがって、さらに尾芽のイメージングを改善するための一つの方法は、尾芽の全体の動きを追跡し、取得中に顕微鏡ステージのX、Y、Z位置を調整することができる自動化された追跡アルゴリズムを有することです。ここで説明した実装方法を持つすべての軸方向寸法に胚の増加した安定性を考えると、それが影響を受けやすいでなければなりませんこのようなアプローチ。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
