En allsidig monteringsmetode for Long Term Imaging av Sebrafisk Development

Abstract

Sebrafisk embryo tilbyr en ideell eksperimentelt system for å studere komplekse morfogenetiske prosesser på grunn av sin enkle tilgjengelighet og optiske åpenhet. Spesielt er bakre legeme forlengelse en viktig prosess i fosterutviklingen ved hvilken flere vev deformasjoner som virker sammen for å styre dannelsen av en stor del av kroppen akse. For å observere denne prosessen ved langvarig time-lapse avbildning er det nødvendig å anvende en monteringsteknikk som tillater tilstrekkelig støtte for å opprettholde prøvene i den riktige orientering under overføring til mikroskopet og anskaffelse. I tillegg må monteringen også tilveiebringe tilstrekkelig bevegelsesfrihet for den utvekst av det bakre kroppsregion uten å påvirke normal utvikling. Til slutt må det være en viss grad i allsidighet av monterings metode for å tillate avbildning på ulike bildeoppsett. Her presenterer vi en monterings teknikk for å avbilde utvikling av bakre kropps elongation i sebrafisk D. rerio. Denne teknikken innebærer montering embryoer slik at hode og plommesekk regionene er nesten utelukkende inngår i agarose, og samtidig la ut bakre kroppsregion å forlenge og utvikle seg normalt. Vi vil vise hvordan dette kan tilpasses for stående, invertert og vertikal lys-ark mikros set-ups. Mens denne protokollen fokuserer på montering embryoer for bildebehandling for bakre kroppen, kan det lett tilpasses for live avbildning av flere aspekter av sebrafisk utvikling.

Introduction

Bakre legeme forlengelse er en viktig prosess i fosterutviklingen ved hjelp av hvilken embryoet strekker seg for å danne en stor del av kroppen akse. Det er et eksempel på en kompleks morfogenetiske prosess ved hvilken flere celle oppførsel opptre coordinately for å generere morfogenese på nivået av den enkelte vev. Disse differensial vev deformasjoner da fungere sammen for å danne forlengelsen av det bakre legemet i hele strukturen nivå. For å forstå hvordan disse prosessene styres og koordineres under utvikling, må vi være i stand til å følge disse prosessene på flere skalaer (dvs. på nivå med molekyler, celler, cellepopulasjoner og vev) og relatere dette direkte til morphogenesis av hele strukturen .

Sebrafisk embryoer er ideelle for avbildning bakre kroppen forlengelse som deres optiske gjennomsiktighet og liten størrelse gjør det mulig for bruk av minimalt invasive lys bildebehandling tilnærminger godt egnet til live bildebehandling. ¹ Dette har blitt dokumentert av en rekke nye publikasjoner som har belyst bakre kroppen utvikling på nivå med molekyler, ² enkeltceller, ³ og inter-vev atferd, ⁴ samt på nivået av cellepopulasjon og hele organet. ⁵

Avanserte imaging teknikker som confocal, multi-foton mikroskopi og selektiv plan belysning mikroskopi (SPAM) er slik at den langsiktige avbildning av utviklingsprosesser med nedsatt effekt av lys giftighet og foto-bleking. Robuste teknikker for montering av levende prøver er nødvendig for å oppnå tre mål: 1) tilstrekkelig støtte for å opprettholde prøvene i den riktige orientering under overføring til mikroskopet og under innhenting, 2) tilstrekkelig bevegelsesfrihet av prøven for å tillate utvekst av bakre kroppsregion uten å påvirke sin normal utvikling, og til slutt 3) en viss grad i allsidighet av monterings metode for å tillate avbildning på ulike bildeoppsett.

Denne protokollen innfører en montering teknikk for å avbilde utvikling av sebrafisk D. rerio. Denne teknikken innebærer montering embryoer slik at hode og plommesekk regionene er nesten utelukkende inkludert i agarose, og samtidig la bakre kroppsregion å forlenge og utvikle seg normalt. Som sådan, er det også en egnet metode for langvarig avbildning av andre deler av det fremkallende legeme som agarose muliggjør avbildning ved hjelp av standard lys avbildningsteknikker. Denne protokollen demonstrerer montering av embryo i en lateral retning, men det er også mulig å montere embryoer i alterative orienteringer. Det vil videre vise hvordan å tilpasse metoden for stående, invertert og vertikale lys ark mikroskopi oppsett.

Protocol

1. Utarbeidelse av løsninger og trukket glass Needle

1. Foreta en 25x stamløsning av Tricaine (3-amino-benzosyre-etylester, også kalt etyl-3-aminobenzoat) ved 4 mg / ml i 20 mM Tris pH 8,8 og bringe denne oppløsningen er ved pH 7. Alikvoter av 4 ml og oppbevares ved -20 ° C.
   MERK: bedøvelse Tricaine virker fortrinnsvis på nevrale spenningsstyrte natriumkanaler og dermed blokkerer muskelrykninger og bevegelse ^6.
2. Foreta en arbeidsløsning av Tricaine ved en sluttkonsentrasjon på 0,17 mg / ml i E3 embryo medium. ⁷
   MERK: Gjør Tricaine arbeidsløsning extemporaneously som pH i denne løsningen driver.
3. Oppløs lavt smeltepunkt agarose til en sluttkonsentrasjon på 1,5% i E3 embryo medium i et 50 ml rør ved oppvarming av oppløsningen i en mikrobølgeovn. La denne løsningen likevekt til 42-45 ° C i enten et vannbad eller benk-top kuvøse. Hvis forbereder store retter for vertikallys-ark imaging (trinn 4), må ytterligere 25 ml av 1% standardsmeltende agarose i E3 embryo medium.
4. Bruk borsilikatglass med glødekapillærer med dimensjoner på 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, lengde 10 mm.
5. Hvis kapillærer er trukket av type oppvarming-filament nål avtrekker beskrevet i tabellform Utstyr og reagenser, bruke følgende innstillinger: Varme 600, Pull 120, Velocity 50, Tid 225, Trykk 500. Med et par skarpe tang, pause nålen like forbi det punkt hvor den bøyer seg for å skape en ren og skarp nål for orientering av embryoer og fjerning av overskudd av agarose. En mikro skalpell kan også brukes for å fjerne overskudd av agarose.

2. Inkludering av embryoer for invertert eller Upright Mikros

1. Hev embryoene opp til den aktuelle scenen i E3 embryo medium. ⁷
2. På den nødvendige scenen, dechorionate embryoer med et par skarpe tang under en kikkert dissecting mikroskop.
3. Inkuber dechorionated embryoer i minst 5 minutter i Tricaine arbeidsløsningen.
4. Når den smeltede agarose oppløsningen er avkjølt til 45 ° C ved å bruke et glass Pasteur pipette for å overføre dechorionated embryoet direkte inn i 50 ml rør med minimal overføring av E3 medium.
5. Fjern embryo sammen med ca 1 ml montering medium og tilsett ca. 100 ul av monteringsmedium sammen med embryoet til den sentrale sirkel av en 35 mm glass-bunn petriskål med en 10 mm mikrobrønn.
6. Når monteringsmedium er innstillingen, beveger embryoet til kanten av sirkelen av agarose med halen vendt utover (figur 1A). Bruk kapillær nålen for å opprettholde embryoet i den ønskede laterale retningen inntil gelen er fullstendig satt. Å bilde bakre kroppsutvikling, ta vare å orientere embryoet inn som side en orientering som mulig. Derfor opprett embryoet i denne stilling ved forsiktig adjustments med kapillær nål.
   MERK: Flere embryo kan legges til monteringsrett på dette punkt, om nødvendig. Hvis dette er tilfelle, overføre lav smelte agarose i formen først og legge embryoene til midten av agarose dråpe. Deretter skyver embryoene ut til kantene av glassring og orientere inn i den ønskede posisjon. Opptil seks embryoer kan monteres på denne måten før agarose blir stivnet.

3. fjerning av overflødig agarose Rundt Bakre Body

MERK: Denne delen beskriver framgangsmåten som agarose fjernes fra området rundt bakre kroppen. I tilfelle av bakre legeme forlengelse, er det viktig å sikre at halen kan vokse ut på vanlig måte. Ved fjerning av agarose etter embryo har blitt fullstendig tatt med av agarose, blir embryoet igjen omsluttet av hoderegionen og omtrent halvparten av plommesekken.

1. Når agarose fallet har satt, oversvømme petri dish med Tricaine arbeidsløsning.
2. Under en dissekere binokulært mikroskop med et utsendt lys base, justere speilet plassering og vinkel innfallende lys slik at sterk kontrast gjør det mulig for kuttene i agarose for å sees tydelig under hele operasjonen.
3. For å utføre kuttet 1 (figur 1), bruker kapillaren nål eller mikro-skalpell for å kutte agarose midtveis langs eggeplomme, fra en posisjon rett posterior til formings hjerte-feltet til posisjonen av somitt 5 (5 ^th anterior somitt).
4. Starter den første kutt i tilknytning til formings hjerte som vist, og hele veien gjennom agarose til glasset.
5. Hold kapillaren eller mikro skalpell dypt inne i agarose, og langsomt så opp og ned samtidig som begynner å gjøre et langt kutt over fosteret som er vist på Figur 1. Kuttet så nær til embryoet som mulig uten å punktere embryo eller eggeplomme.
6. Neste, gjøre kutt 2 og 3 (figur 1 MERK: Skjære agarose inntil kanten av glasset sirkel (som vist i figur 1) hjelpemidler for fjerning av agarose som en hel blokk (trinn 3.6). Dette er imidlertid ikke nødvendig.
7. Starter i skjæringspunktet mellom kutt 1 og 3, gjøre en langsom diagonal kutt mot slutten av kuttet to mens sakte løfte oppover for å løsne kvadratet av agarose rundt bakre kroppen.
   Merknader: I noen tilfeller vil dette bli utgitt i en blokk og at operasjonen er fullført på en gang. I andre kan det ta flere forsøk på å dis-lodge hele agarose som omgir fosteret.
8. Med et par skarpe tang, fjerne løsnet blåser av agarose fra embryoet medium. Til hjelp i denne prosessen beveger agarose stykkene på siden av fatet, og bruk veggen av petriskålen som støtte mens løfte ut agarose stykker.

Figur 1: Diagram av monteringssett-ups. (A) Diagrammet viser plasseringen av den monterte embryo i sentrum glassring av en petriskål. På høyre side er en zoom på embryoet med hver påfølgende kutt gjennom omkringliggende agarose vist med dottted røde linjer. (B) montert embryoer er vist skjematisk i sideriss som viser enkel tilgang til både inverterte og oppreist mål. (C) En lignende digram viser hvordan embryoer kan monteres for vertikal lys ark bildeoppsett. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.

9. Hvis muskelrykninger ikke er fullstendig blokkert på det punktet, legger dråper Tricaine fra stamløsning av 4 mg / ml, pH 7.

4. Montering av embryoer for Vertical Lys-ark Mikros

MERK: Dette er en variant av den metoden skissert ovenfor som gir tilgang for flere mål for avbildning av prøver av vertikalt orientert SPIM. Ideen bak denne varianten er å løfte prøven litt høyere enn bunnen av fatet, for å tillate enkel tilgang til to bilde mål.

1. Før prøve montasje, belegge en 100 mm petriskål av plast med 1% agarose i E3 medium til en høyde på 5 mm og tillater å stille inn.
2. Plassere en dråpe av 1 ml lavt smeltepunkt agarose til midten av skålen og tillater å stille inn.
3. Embed embryoene i lavt smeltepunkt agarose som i § 2. Men denne gangen, fjerne fosteret fra 50 ml tubeav agarose med en mindre dråpe løsning (0,5 ml) og plasser denne liten dråpe på toppen av en ml slippe i midten av fatet.
4. Bruk kapillær nålen for å plassere embryoet i sentrum av den lille dråpe og opprettholde sin korrekte orientering inntil gelen er angitt.
5. Svømme tallerken med Tricaine arbeidsløsning og fjerne overflødig agarose som i § 3, men uten å skjære gjennom pute av 1% standard agarose.

Representative Results

Protokollen er skissert ovenfor detaljer en allsidig teknikk for montering av sebrafisk embryoer for langsiktig tid lapse imaging. Et eksempel på dette er vist i figur 2A og i animerte / video Figur 1. Embryoer ble injisert i en celle scene med mRNA som koder for photoconvertible fluorescerende protein kikumeGR. Ved 15 somitt trinnet ble de montert som beskrevet ovenfor og avbildes i 12 timer på et invertert konfokalmikroskop med et 10X objektiv. De resulterende confocal stabler ble maksimalt anslått til å bli vist som vist. Denne filmen viser tydelig at den bakre kroppen får lov til å bevege seg fritt gjennom hele filmen, og viser tilsvarende endringer i morfologi som sett i embryoer som får lov til å utvikle seg fritt av deres chorion i normale kultur forhold.

Et ytterligere eksempel er vist i F igur 2Bog animert / video Figur 2. Her embryoer ble injisert i 16 cellen trinnet med en kombinasjon av mRNA som koder for histon-2B-mCherry protein (som etiketter kjerner) og EGFP: CAAX-boksen (som etiketter membraner, for detaljer se referanse ^5). De ble deretter fotografert på en oppreist multiphoton mikroskop med en nedsenking i vann 25X objektiv som på tegningen i figur 1B. Bilder ble tatt i 3 timer fra 10 somitt trinnet for å visualisere cellulære oppførsel under tailbud formasjonen. Celler kan ses å være generere aktive fremspring og retnings bevegelser som de tailbud former normalt.

Figur 2: Eksempler på Time-lapse Imaging av Bakre Body forlengelse ved 10 X forstørrelse. (A) etterfølgende rammerav en representativ film som dekker fremgangs aksiale forlengelse. Embryoer er vist i sideriss med posterior til høyre side av bildet. (B) sammenhengende rammene til en høyere forstørrelse film som viser enkelte celle atferd under tailbud formasjon. Embryoer er vist i sideriss med posterior til høyre. Stiplede linjer skissere forming tailbud. Små fargede linjene viser spor av atomkjerner til å følge enkelte celle bevegelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Animert / Video Figur 1: Time-lapse film fra Bakre Body Forlengelse av en KikumeGR mRNA Støpt Sebrafisk embryo ved konfokalmikroskopi. Embryo er vist med anterior til venstre og plakatior til høyre. Bilder ble tatt ved 10 min intervaller på 10X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Animert / Video Figur 2: Time-lapse film fra Bakre Body Forlengelse av en kjernefysisk-mCherry og Membran-GFP merkede Sebrafisk Embryo avbildes ved to-foton mikroskopi. Embryo er vist med anterior til høyre og bakre til venstre. Bilder ble tatt på 2 min intervaller på 25X forstørrelse. Fargede linjer viser spor av celler for de siste ti tids trinn for hvert spores celle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette montering teknikken gjør at embryoene som skal holdes i ro under overføring til mikroskopet og over langsiktige time-lapse bildebehandling eksperimenter som tar sikte på å følge bakre kroppen forlengelse ved flere lengdeskala. Videre er det anvendelig ved at den tillater for avbildning på begge opprettstående og omvendt mikros oppsett, og et forslag er gjort for hvordan dette kan videre tilpasses vertikalt orientert SPIM.

Et kritisk punkt i denne protokollen er forsiktig fjerning av overflødig agarose rundt bakre kroppen som er viktig for at den normale utviklingen av denne strukturen. Det er viktig å ta vare på her ikke å skade fosteret, spesielt ved fjerning av agarose rundt toppen av eggeplomme. I tillegg må det utvises forsiktighet ved fjerning snittet agarose blokk fra rundt embryoet, som noen ganger er det mulig å miste embryoet fra formen i løpet av denne prosessen. Av disse grunner, er dette en lav-throughput-metoden that er ikke egnet for montering av mange sebrafisk embryoer samtidig, i motsetning til allerede publiserte fremgangsmåter som benytter 3D trykt plastformer. ^{8, 9} er imidlertid embryoer er meget stabile ved denne monteringsmetode, og kan derfor transporteres til mikroskop mye enklere, og beholder sin 3D orientering i hele kroppen bakre forlengelse.

Et annet kritisk punkt er nøyaktigheten av den første sideveis orientering av embryoet, unngår enhver antero-posterior eller dorso-ventral tilt. Enten tilt vil være til hinder for sidesynet av bakre kroppen forlengelse, som er den mest praktiske synsvinkel for videre analyse. Den antero-posterior tilt vil i tillegg resultat i den bakre legeme vokser opp eller ned i forhold til horisontalplanet, noe som vil bety anskaffelse av høyere stabler i z og dermed tidsbortfaller med en lavere tidsoppløsning.

Denne metoden er versatile og har gjort det mulig for avbildning av celledelingsrate ved bruk av den Fucci linje ^{5, 10} så vel som multi-skalar morfometrisk analyse. ⁵ Imidlertid gitt dramatiske generelle forskyvningen av tailbud under forlengelse av de bakre kroppsaksen, bare forholdsvis lave forstørring kan benyttes for å fange opp hele prosessen, slik som vist i figur 2. Dette er fordi høyere forstørrelse resultat i regionen av interesse forlater synsfeltet innen 3-4 timer av oppkjøpet (Video figur 1). Derfor, er en måte å ytterligere forbedre avbildningen av tailbud å ha en automatisert sporingsalgoritme som kan spore den samlede bevegelse av tailbud og justere x, y, z-posisjon av objektbordet under overtakelsen. Med den økte stabiliteten av embryoet i alle aksiale dimensjoner med den monteringsmetode som er beskrevet her, bør det være mottagelig foren slik tilnærming.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo