Abstract
embryons de poisson zèbre offrent un système expérimental idéal pour étudier les processus morphogénétiques complexes en raison de leur facilité d'accès et de transparence optique. En particulier, l'allongement du corps postérieur est un processus essentiel dans le développement embryonnaire par lequel de multiples déformations des tissus agissent ensemble pour diriger la formation d'une grande partie de l'axe du corps. Afin d'observer ce processus en imagerie time-lapse à long terme, il est nécessaire d'utiliser une technique de montage qui permet un soutien suffisant pour maintenir les échantillons dans l'orientation correcte pendant le transfert au microscope et acquisition. En outre, le montage doit également assurer la liberté de mouvement suffisante pour l'excroissance de la région postérieure du corps sans affecter son développement normal. Enfin, il doit y avoir un certain degré de polyvalence de la méthode de montage pour permettre l'imagerie sur diverses imagerie set-ups. Ici, nous présentons une technique de montage pour l'imagerie du développement du corps postérieur elongation dans le zebrafish D. rerio. Cette technique implique des embryons de telle sorte que les régions tête et jaune sac sont presque entièrement inclus dans agarose de montage, tout en laissant la région postérieure du corps pour allonger et se développer normalement. Nous allons montrer comment cela peut être adapté à la verticale, inversé et vertical microscopie optique-feuille set-ups. Bien que ce protocole met l'accent sur les embryons pour l'imagerie du corps postérieur de montage, il pourrait facilement être adapté pour l'imagerie en direct de plusieurs aspects du développement du poisson zèbre.
Introduction
Postérieur corps d'allongement est un processus essentiel dans le développement embryonnaire de l'embryon qui se prolonge pour former une partie importante de l'axe du corps. Il est un exemple d'un processus complexe par lequel morphogénétique comportements cellulaires multiples agissent de façon coordonnée pour générer la morphogenèse au niveau des tissus individuels. Ces déformations du tissu différentiel agissent alors ensemble pour produire l'allongement du corps postérieur au niveau de l'ensemble de la structure. Pour comprendre comment ces processus sont contrôlés et coordonnés au cours du développement, nous devons être en mesure de suivre ces processus à des échelles multiples (ie au niveau des molécules, des cellules, des populations de cellules et de tissus) et de relier cela directement à la morphogenèse de l' ensemble de la structure .
embryons de poisson zèbre sont idéales pour le corps imagerie postérieure allongement de leur transparence optique et de petite taille permet à l'application de l'imagerie de la lumière mini-invasive des approches bien adaptées à live imagerie. 1 Ceci a été mis en évidence par une série de publications récentes qui ont mis en lumière le développement du corps postérieur au niveau des molécules, 2 cellules simples, 3 et inter-tissulaires comportements, 4 ainsi qu'au niveau de la population cellulaire et un organe entier. 5
Les techniques d'imagerie avancées telles que confocale, la microscopie multi-photonique et la microscopie d'éclairage plan sélectif (SPIM) permettent à l'imagerie à long terme des processus de développement avec une diminution de l'effet de la toxicité lumière et photo-blanchiment. techniques robustes pour le montage d'échantillons vivants sont nécessaires pour atteindre trois objectifs: 1) un soutien suffisant pour maintenir les échantillons dans l'orientation correcte pendant le transfert au microscope et lors de l'acquisition, 2) la liberté de mouvement suffisante de l'échantillon pour permettre l'excroissance de la région postérieure du corps sans affecter son devel normaleloppement, et enfin 3) un certain degré de polyvalence de la méthode de montage pour permettre l'imagerie sur diverses imagerie set-ups.
Ce protocole a introduit une technique de montage pour imager le développement du poisson zèbre D. rerio. Cette technique implique des embryons de montage de telle sorte que les régions de la tête et le sac vitellin sont presque entièrement inclus dans l'agarose, tout en laissant la région postérieure du corps pour allonger et se développer normalement. En tant que tel, il est également une méthode appropriée pour l'imagerie à long terme d'autres régions du corps en développement l'agarose permet l'imagerie par des techniques d'imagerie de lumière standard. Ce protocole démontre montage des embryons dans une orientation latérale, mais il est également possible de monter des embryons dans des orientations altératives. Il va encore montrer comment adapter la méthode pour vertical, inversé et verticales configurations de microscopie optique à feuille.
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Protocol
1. Préparation des solutions et Pulled Verre aiguille
- Faire une solution 25x stock de Tricaine (3-amino ester éthylique de l'acide benzoïque, également appelé le 3-aminobenzoate) à 4 mg / ml dans 20 mM Tris pH 8,8 et apporter cette solution est à pH 7. aliquote de 4 ml et conserver à -20 ° C.
NOTE: L'anesthésie Tricaine agit de préférence sur les canaux sodiques voltage-dépendants neuronaux bloquant ainsi des contractions musculaires et le mouvement 6. - Préparer une solution de travail de tricaïne à une concentration finale de 0,17 mg / ml dans du milieu d'embryon E3. 7
NOTE: Faire la Tricaine solution de travail extemporanée que le pH de cette solution dérive. - On dissout le bas point de fusion d'agarose à une concentration finale de 1,5% en E3 milieu d'embryons dans un tube de 50 ml en chauffant la solution dans un four micro-ondes. Laissez cette solution équilibrer à 42-45 ° C soit dans un bain d'eau ou de paillasse incubateur. Si la préparation de grands plats pour verticallumière feuille d'imagerie (étape 4), faire un 25 ml supplémentaires de 1% fusion norme agarose dans un milieu d'embryon E3.
- Utilisez verre borosilicate avec des capillaires à incandescence avec des dimensions de 1,20 mm OD, ID 0.69 mm, longueur 10 mm.
- Si capillaires sont tirés sur le type de chauffage à filament aiguille extracteur décrit dans le tableau des équipements et réactifs, utilisez les paramètres suivants: Chaleur 600, Pull 120, Velocity 50, Temps 225, pression 500. Avec une paire de pinces acérées, pause l'aiguille juste après le point où il fléchit pour créer une aiguille propre et nette pour orienter les embryons et enlever l'excès d'agarose. Un micro-scalpel peut également être utilisé pour éliminer l'excès d'agarose.
2. Incorporation des Embryons Inverted ou Microscopie Upright
- Soulever les embryons jusqu'au stade approprié dans le milieu de l'embryon E3. 7
- Au stade nécessaire, les embryons dechorionate avec une paire de pinces acérées sous une dissection binoculaireMicroscope tion.
- Incuber les embryons dechorionated pendant au moins 5 minutes dans la solution de travail Tricaine.
- Une fois la solution d'agarose fondu est refroidi à 45 ° C, en utilisant une pipette Pasteur en verre pour transférer l'embryon dechorionated directement dans le tube de 50 ml avec un transfert minimal de milieu E3.
- Retirer l'embryon avec environ 1 ml de milieu de montage et d'ajouter env. 100 ul de milieu de montage en même temps que l'embryon au cercle central d'une boîte de pétri de 35 mm à fond de verre de 10 mm avec un micropuits.
- Le moyen de montage se couche, l'embryon se déplacer vers le bord du cercle d'agarose avec la queue dirigée vers l' extérieur (figure 1A). Utiliser l'aiguille capillaire pour maintenir l'embryon dans l'orientation latérale souhaitée jusqu'à ce que le gel est complètement réglée. Pour l'image du développement du corps postérieur, prendre soin d'orienter l'embryon dans le plus latéral une orientation possible. Par conséquent, de maintenir l'embryon dans cette position par adjustmen soigneusesct l'aiguille capillaire.
NOTE: Les embryons multiples peuvent être ajoutés à la boîte de montage à ce point, si nécessaire. Si tel est le cas, transférer le faible point de fusion d'agarose dans le premier plat et ajouter les embryons au centre de la goutte d'agarose. Ensuite, appuyez sur les embryons vers les bords de l'anneau de verre et d'orienter dans la position souhaitée. Jusqu'à six embryons peuvent être montés de cette façon avant l'agarose se solidifie.
3. Retrait de l'excédent Agarose autour du corps Postérieur
NOTE: Cette section décrit la procédure par laquelle l'agarose est retiré de la région entourant le corps postérieur. Dans le cas d'allongement du corps postérieur, il est important de faire en sorte que la queue peut grossissement normalement. En enlevant l'agarose après que l'embryon a été complètement compris par l'agarose, l'embryon est laissée enfermée par la région de la tête et approximativement la moitié de la vésicule ombilicale.
- Une fois que la goutte d'agarose a fixé, inonder le petri dish avec la solution de travail Tricaine.
- Sous un microscope binoculaire de dissection avec une base de lumière transmise, régler la position du miroir et de l'angle de la lumière incidente de sorte que le fort contraste permet les coupes dans l'agarose à voir clairement à travers l'opération.
- Pour effectuer couper 1 (Figure 1), utiliser l'aiguille capillaire ou le micro-scalpel pour couper la mi-agarose le long du jaune, d'une position juste derrière le champ de coeur formant à la position du somite 5 (5 e somite antérieure).
- Commencez la coupe initiale adjacente au cœur formant comme indiqué, et la façon complète à travers l'agarose au verre.
- Gardez le capillaire ou micro-scalpel au plus profond de l'agarose, et lentement vu monter et descendre tout en commençant à faire une longue coupure sur l'embryon comme le montre la figure 1. Coupez aussi près de l'embryon que possible sans perforer l'embryon ou le jaune.
- Ensuite, faire des coupes 2 et 3 (figure 1 REMARQUE: Couper l'agarose jusqu'à ce que le bord du cercle de verre (comme représenté sur la figure 1) , les aides à éliminer l'agarose comme un bloc complet (étape 3.6). Cependant, ce ne sont pas nécessaires.
- À partir de l'intersection des coupes 1 et 3, faire une coupe en diagonale lente vers la fin de la coupe 2 tout en soulevant lentement vers le haut afin de déloger le carré d'agarose entourant le corps postérieur.
Remarques: Dans certains cas, ce sera publié dans un seul bloc et l'opération est terminée en une seule fois. Dans d'autres, il peut prendre plusieurs tentatives pour dé-lodge tous les agarose entourant l'embryon. - Avec une paire de pinces acérées, enlever le b délogémèches de l'agarose à partir du milieu de l'embryon. Pour faciliter ce processus, déplacer les pièces d'agarose sur le côté du plat et d'utiliser la paroi de la boîte de Pétri comme support tout en soulevant les morceaux d'agarose.
Figure 1: Diagrammes de montage Set-ups. (A) Le diagramme montre la position de l'embryon monté à l' intérieur de l'anneau de verre centre d'une boîte de Petri. Sur la droite est un zoom de l'embryon avec chaque coupe successive à travers l'entourant agarose représenté avec des lignes rouges dottted. (B) Les embryons montés sont schématisés en vue latérale affichant la facilité d'accès pour les deux objectifs inversés et verticaux. (C) Un digram similaire montrant comment les embryons peuvent être montés pour l' imagerie de nappe de lumière vertical set-ups. S'il vous plaît clbeurk ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Si des contractions musculaires ne sont pas complètement bloquée à ce moment, ajouter quelques gouttes de Tricaine de la solution mère de 4 mg / ml, pH 7.
4. Montage d'embryons pour Light-feuille Vertical Microscopie
NOTE: Ceci est une variante de la méthode décrite ci-dessus qui permet l'accès des objectifs multiples pour l'imagerie d'échantillons par SPIM verticalement orientée. L'idée derrière cette variation est de lever l'échantillon légèrement supérieur au fond du plat, pour permettre un accès facile des deux objectifs d'imagerie.
- Avant de goûter le montage, le manteau une boîte de Pétri en plastique de 100 mm avec 1% d'agarose en milieu E3 à une hauteur de 5 mm et permet de définir.
- Déposer une goutte de 1 ml bas point de fusion d'agarose au centre du plat et laisser reposer.
- Intégrer dans les embryons bas point de fusion d'agarose comme dans l'article 2. Cependant, cette fois, supprimer l'embryon du tube de 50 mld'agarose avec une baisse plus faible de solution (0,5 ml) et placer cette petite goutte sur le dessus du 1 ml déposer dans le centre du plat.
- Utiliser l'aiguille capillaire pour placer l'embryon dans le centre de la goutte et de maintenir son orientation correcte jusqu'à ce que le gel est réglée.
- Inonder le plat avec la solution de travail Tricaine et éliminer l'excès d'agarose comme dans la section 3, mais sans couper à travers le coussin de 1% d'agarose standard.
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Representative Results
Le protocole décrit ci-dessus détaille une technique versatile pour le montage des embryons de poisson zèbre pour l'imagerie laps de temps à long terme. Un exemple de ceci est représenté sur la figure 2A et d' animation / vidéo Figure 1. Les embryons ont été injectés au stade 1 cellule avec l'ARNm codant pour la protéine fluorescente photoconvertible kikumeGR. Au stade 15 somites, ils ont été montés comme décrit ci-dessus et imagée pendant 12 heures sur un microscope confocal inversé avec un objectif 10X. Les piles de confocale résultantes ont été au maximum devraient être affichés comme indiqué. Ce film montre clairement que le corps postérieur est autorisé à se déplacer librement pendant toute la durée du film et montre des changements similaires dans la morphologie comme on le voit dans les embryons qui sont autorisés à se développer librement de leur chorion dans des conditions normales de culture.
Un autre exemple est représenté sur la F igure 2Bet d' animation / vidéo Figure 2. Ici, les embryons ont été injectés au stade 16 cellules avec une combinaison des ARNm codant la protéine histone 2B-mCherry (que les étiquettes des noyaux) et eGFP: boîte de CAAX (que les étiquettes membranes; pour plus de détails , voir la référence 5). Ils ont ensuite été visualisés sur un microscope multiphoton verticale avec un objectif 25X à immersion dans l'eau tel que schématisé sur la figure 1B. Les images ont été prises pendant 3 heures à partir du stade 10 somites afin de visualiser les comportements cellulaires pendant la formation bourgeon caudal. Les cellules peuvent être vues à générer des saillies actives et des mouvements directionnels comme les formes de bourgeon caudal normalement.
Figure 2: Exemples d'imagerie time-lapse de Postérieur Allongement du corps à 10 X Grossissement. (A) des trames consécutivesd'un film représentatif couvrant le processus d'allongement axial. Les embryons sont représentés en vue latérale avec postérieur vers le côté droit de l'image. (B) trames consécutives d'un film plus fort grossissement montrant des comportements de cellules individuelles pendant la formation bourgeon caudal. Embryons sont présentés en vue latérale avec postérieure à droite. Les lignes pointillées décrivent la formation de bourgeon caudal. Les petites lignes colorées montrent les pistes de noyaux de suivre les mouvements de cellules individuelles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Animés / vidéo Figure 1: Time-lapse film de Postérieur Allongement corps d'un KikumeGR ARNm Injecté Embryo Zebrafish par microscopie confocale. Embryo est montré avec antérieure à gauche et une afficheIOR vers la droite. Les images ont été prises à des intervalles de 10 min à un grossissement de 10X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Animés / vidéo Figure 2: Time-lapse film de Postérieur Allongement du corps d'un Embryon nucléaire-mCherry et Membrane-GFP labelisée Zebrafish imagée par deux photons Microscopy. Embryon est représenté avec antérieure vers la droite et en arrière à gauche. Les images ont été prises à des intervalles de 2 min à 25X grossissement. Des lignes colorées affichent des pistes de cellules pour les derniers dix pas de temps pour chaque cellule suivi. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cette technique de montage permet embryons à conserver encore pendant le transfert au microscope et plus des expériences d'imagerie time-lapse à long terme visant à la suite postérieure allongement du corps à des échelles de longueur multiples. En outre, il est souple en ce qu'elle permet d'imagerie sur la microscopie en position verticale et inversée set-up, et une suggestion est faite pour savoir comment cela peut être adapté en outre pour SPIM orienté verticalement.
Une étape cruciale dans ce protocole est l'élimination minutieuse de l'excès d'agarose entourant le corps postérieur qui est important pour permettre le développement normal de cette structure. Il est important de prendre soin ici de ne pas endommager l'embryon, en particulier lors du retrait de l'agarose autour du sommet du jaune. En outre, il faut prendre soin lors du retrait du bloc d'agarose de coupe du monde de l'embryon, comme il est parfois possible de perdre l'embryon du moule pendant ce processus. Pour ces raisons, cette méthode est faible débit thaT ne convient pas pour le montage d'un grand nombre d'embryons de poisson zèbre en même temps, contrairement aux méthodes déjà publiées utilisant des moules 3D imprimé en matière plastique. 8, 9 Cependant, les embryons sont très stables par cette méthode de montage et peuvent donc être transportés au microscope beaucoup plus facile, et conservent leur orientation 3D tout au long de l' allongement du corps postérieur.
Une autre étape importante est la précision de l'orientation latérale initiale de l'embryon, en évitant toute antéropostérieure ou dorso-ventrale inclinaison. Soit l'inclinaison empêchera la vision latérale de l'extension postérieure du corps, qui est l'angle le plus commode de vue pour une analyse ultérieure. L'inclinaison antéro-postérieur sera en résultat de l'addition dans le corps postérieur de plus en plus vers le haut ou vers le bas par rapport au plan horizontal, ce qui se traduira par l'acquisition de piles plus élevées dans z et donc de temps devient caduque avec une résolution temporelle inférieure.
Cette méthode est versatile et a permis pour l' imagerie des taux de division cellulaire avec l'utilisation de la ligne Fucci 5, 10 ainsi que des analyses morphométriques multi-scalaire. 5 Toutefois, étant donné le déplacement global dramatique du bourgeon caudal au cours de l'allongement de l'axe du corps postérieur, les objectifs que relativement faible grossissement peut être utilisé pour capturer l'ensemble du processus tel que représenté sur la figure 2. En effet , les résultats de grossissement plus élevé dans la région d'intérêt en laissant le champ de vision dans les 3 - 4 h d'acquisition (vidéo Figure 1). Par conséquent, une façon d'améliorer encore l'imagerie du bourgeon caudal est d'avoir un algorithme de suivi automatisé qui permet de suivre le mouvement global du bourgeon caudal et ajuster les coordonnées x, y, z position de la platine du microscope au cours de l'acquisition. Compte tenu de la stabilité accrue de l'embryon dans toutes les dimensions axiales avec la méthode de montage décrit ici, il devrait se prêter àune telle approche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
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- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
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- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
