Abstract
الأجنة الزرد توفر نظام تجريبي مثالي لدراسة عمليات التخلق معقدة نظرا لسهولة الوصول من والشفافية البصرية. على وجه الخصوص، واستطالة مؤخرة الجسم هي عملية أساسية في التطور الجنيني الذي تشوهات الأنسجة متعددة تعمل معا لتوجيه تشكيل جزء كبير من محور الجسم. من أجل مراقبة هذه العملية على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الضروري الاستفادة من تقنية متزايدة على أن يسمح الدعم الكافي للحفاظ على عينات في الاتجاه الصحيح أثناء نقلها إلى المجهر والاستحواذ. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تصاعد أيضا توفير حرية كافية الحركة للنمو في المنطقة مؤخرة الجسم دون التأثير على تطورها الطبيعي. وأخيرا، يجب أن يكون هناك درجة معينة في براعة طريقة التركيب للسماح التصوير في التصوير المتنوعة مجموعة عمليات. هنا، نقدم تقنية متزايدة لتصوير تطوير الخلفي الجسم elongatioن في الزرد D. rerio. وتنطوي هذه التقنية المتزايدة الأجنة بحيث مناطق الرأس والكيس المحي مدرجة بالكامل تقريبا في الاغاروز، بينما تترك خارج المنطقة مؤخرة الجسم إلى استطال وتتطور بشكل طبيعي. سوف نظهر كيف يمكن تكييفها لتستقيم، مقلوب والرأسي للضوء ورقة المجهر مجموعة عمليات. في حين يركز هذا البروتوكول على تصاعد الأجنة للتصوير لمؤخرة الجسم، ويمكن بسهولة أن تتكيف لتصوير حي من جوانب متعددة للتنمية الزرد.
Introduction
الخلفي الجسم استطالة عملية أساسية في التطور الجنيني الذي الجنين يمتد لتشكيل جزء كبير من محور الجسم. إنه مثال لعملية التخلق المعقدة التي السلوكيات خلايا متعددة تعمل coordinately لتوليد التشكل على مستوى الأنسجة الفردية. هذه التشوهات الأنسجة التفاضلية ثم تعمل معا لتوليد استطالة من مؤخرة الجسم على مستوى الهيكل كله. ولكي نفهم كيف يتم التحكم في هذه العمليات وتنسيقها خلال التنمية، يجب أن تكون قادرة على متابعة هذه العمليات على مستويات متعددة (أي على مستوى الجزيئات والخلايا والسكان والأنسجة الخلية) وربط هذا مباشرة إلى التشكل من هيكل كامل .
الأجنة الزرد مثالية للتصوير الخلفي الجسم استطالة كما شفافيتها البصرية وحجم صغير يسمح لتطبيق التصوير ضوء مينيملي نهج مناسبة تماما لليفالبريد التصوير. (1) وقد تجلى ذلك من خلال سلسلة من المنشورات الحديثة التي تسلط الضوء على تطور الجسم الخلفية على مستوى الجزيئات، 2 الخلايا واحد و 3 و بين الأنسجة السلوكيات، 4 وكذلك على مستوى السكان الخلايا والجهاز كله. 5
تقنيات التصوير المتقدمة مثل متحد البؤر، المجهري متعددة الفوتون وطائرة انتقائية إضاءة المجهر (SPIM) وتمكن من التصوير على المدى الطويل من العمليات التنموية مع انخفاض تأثير سمية الخفيفة والصور وتبييض. مطلوبة تقنيات قوية لاقامة عينات حية لتحقيق ثلاثة أهداف: 1) الدعم الكافي للحفاظ على عينات في الاتجاه الصحيح أثناء نقلها إلى المجهر وخلال الاستحواذ، 2) حرية كافية للحركة من العينة للسماح ثمرة المنطقة مؤخرة الجسم دون التأثير على جمعة العادياإلمنائية، وأخيرا 3) درجة معينة في براعة طريقة التركيب للسماح التصوير في التصوير المتنوعة مجموعة عمليات.
هذا البروتوكول يدخل تقنية متزايدة لتصوير تطوير الزرد D. rerio. وتنطوي هذه التقنية المتزايدة الأجنة بحيث مناطق الرأس والكيس المحي مدرجة بالكامل تقريبا في الاغاروز، في حين ترك المنطقة مؤخرة الجسم إلى استطال وتتطور بشكل طبيعي. على هذا النحو، بل هو أيضا وسيلة مناسبة للتصوير على المدى الطويل من مناطق أخرى من الجسم النامية في الاغاروز يمكن التصوير من خلال تقنيات ضوء التصوير القياسية. هذا البروتوكول يوضح تصاعد الأجنة في اتجاه جانبي، على الرغم من أنه من الممكن أيضا إلى جبل الأجنة في توجهاتها بديل. وسوف تظهر كذلك كيف للتكيف مع أسلوب الاجهزة المجهر الخفيفة ورقة تستقيم، مقلوب والرأسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد حلول وسحبت زجاج إبرة
- جعل حل 25X الأسهم من تريكين (3-أمينو حمض البنزويك إيثيل استر، وتسمى أيضا إيثيل 3-أمينوبنزوات) في 4 ملغ / مل في 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.8 و تحقيق ذلك الحل هو في درجة الحموضة 7. قسامة من 4 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: تريكين مخدر يعمل بشكل تفضيلي على قنوات الصوديوم الجهد بوابات العصبية وبالتالي عرقلة ارتعاش العضلات وحركة 6. - جعل حل العاملة من تريكين بتركيز نهائي من 0.17 ملغ / مل في E3 الجنين المتوسطة. 7
ملاحظة: أجعل تريكين حل العمل بشكل إرتجالي مثل الرقم الهيدروجيني لهذا الحل الانجرافات. - حل نقطة انصهار منخفضة agarose إلى تركيز النهائي من 1.5٪ في E3 المتوسطة الجنين في أنبوب 50 مل عن طريق تسخين الحل في الميكروويف. السماح لهذا الحل تتوازن إلى 42-45 درجة مئوية في أي حمام مائي أو مقعد بين كبار الحاضنة. إذا إعداد أطباق كبيرة لالرأسيضوء ورقة التصوير (الخطوة 4)، وجعل على 25 مل إضافية من ذوبان قياسي 1٪ الاغاروز في E3 الجنين المتوسطة.
- استخدام الزجاج البورسليكات مع الشعيرات الدموية خيوط مع أبعاد OD 1.20 مم، الرقم 0.69 ملم، وطول 10 مم.
- إذا تم سحب الشعيرات الدموية على نوع من التدفئة خيوط إبرة مجتذب موضح في الجدول من المعدات والكواشف، واستخدام الإعدادات التالية: الحرارة 600، سحب 120، السرعة 50، الوقت 225، 500. الضغط مع زوج من الملقط حادة، وكسر الإبرة الماضي فقط النقطة التي تنثني لإنشاء إبرة نظيفة وحادة لويوجه الأجنة وإزالة الاغاروز الزائد. ويمكن أيضا مشرط الصغير أن تستخدم لإزالة الاغاروز الزائد.
2. تضمين الأجنة لمقلوب أو المجهر تستقيم
- رفع الأجنة تصل إلى مرحلة مناسبة في E3 الجنين المتوسطة. 7
- في المرحلة المطلوبة والأجنة dechorionate مع زوج من الملقط حادة تحتها dissec مجهرتينغ المجهر.
- احتضان الأجنة dechorionated لمدة 5 دقائق على الأقل في العمل الحل تريكين.
- بمجرد أن يبرد الحل الاغاروز ذاب إلى 45 درجة مئوية، واستخدام ماصة باستير الزجاج لنقل الأجنة dechorionated مباشرة في أنبوب 50 مل مع نقل الحد الأدنى من E3 المتوسطة.
- إزالة الجنين جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 1 مل من تصاعد المتوسطة وإضافة تقريبا. 100 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة جنبا إلى جنب مع الجنين إلى دائرة مركزية من القاع الزجاج طبق بتري 35 ملم مع microwell 10 ملم.
- كما هو وضع والمتوسطة المتزايدة، نقل الجنين إلى حافة دائرة الاغاروز مع الذيل تواجه الخارج (الشكل 1A). استخدام إبرة الشعرية للحفاظ على الجنين في الاتجاه الأفقي المطلوب حتى يتم تعيين هلام تماما. لصورة الجسم تنمية الخلفي، ورعاية لتوجيه الجنين في مثل الجانبي التوجه وقت ممكن. لذلك، والحفاظ على الجنين في هذا الموقف الذي adjustmen دقيقةنهاية الخبر مع الإبرة الشعرية.
ملاحظة: يمكن إضافة أجنة متعددة إلى طبق متزايدة في هذه النقطة، إذا لزم الأمر. إذا كان هذا هو الحال، ونقل المنخفضة للذوبان الاغاروز في طبق أولا وإضافة الأجنة إلى وسط انخفاض الاغاروز. ثم، ودفع الأجنة إلى حواف من الحلبة الزجاج وتوجيه في الموضع المطلوب. ما يصل الى ستة أجنة يمكن تركيبه على هذا النحو قبل الاغاروز يصبح طدت.
3. إزالة الزائدة الاغاروز في جميع أنحاء الجسم الخلفي
ملاحظة: يصف هذا القسم الإجراء الذي يتم إزالة الاغاروز من المنطقة المحيطة مؤخرة الجسم. في حالة استطالة مؤخرة الجسم، فمن المهم التأكد من أن الذيل يمكن أن تنمو التدريجي بشكل طبيعي. عن طريق إزالة الاغاروز بعد الجنين قد أدرج تماما من الاغاروز، وتركت المغلقة الجنين من منطقة الرأس وما يقرب من نصف الكيس المحي.
- مرة واحدة وضعت قطرة الاغاروز، إغراق بتري ديSH مع الحل العمل تريكين.
- تحت المجهر مجهر تشريح مع ينتقل الضوء قاعدة، وضبط الموقف مرآة وزاوية الضوء الساقط بحيث تباين قوي يسمح للتخفيضات في الاغاروز أن نرى بوضوح من خلال العملية.
- لأداء قطع 1 (الشكل 1)، استخدم إبرة الشعرية أو مشرط الصغيرة إلى قطع الأغاروس منتصف الطريق على طول صفار، من موقف الخلفي فقط إلى مجال القلب تشكيل لموقف الجسيدة 5 (الموافق 5 الجسيدة الأمامية).
- بدء خفض الأولي المجاور لقلب تشكيل كما هو مبين، والطريقة كاملة من خلال الاغاروز على الزجاج.
- حفاظ على شعري أو مشرط الدقيقة في أعماق الاغاروز، وببطء شهدت صعودا وهبوطا في حين بدأت اجراء خفض طويل على الجنين كما هو موضح الشكل 1. قطع أقرب إلى الجنين ممكن من دون ثقب الجنين أو صفار البيض.
- بعد ذلك، جعل التخفيضات 2 و 3 (الشكل 1 ملاحظة: قص الاغاروز حتى حافة الدائرة الزجاج (كما هو موضح في الشكل رقم 1) يساعد في إزالة الاغاروز ككتلة كاملة (الخطوة 3.6). ومع ذلك، هذا ليس ضروريا.
- بدءا من تقاطع تخفيضات 1 و 3، وجعل قطع قطري البطيء نحو نهاية قطع 2 في حين رفع ببطء صعودا من أجل إزاحة مربع من الاغاروز المحيطة مؤخرة الجسم.
ملاحظات: في بعض الحالات، سيصدر هذا في كتلة واحدة والانتهاء من عملية في آن واحد. وفي حالات أخرى، قد يستغرق عدة محاولات لتضليل تقديم كل الاغاروز التي تحيط بالجنين. - مع زوج من الملقط حادة، وإزالة ب فكهاخصلات الاغاروز من المتوسط الجنين. للمساعدة في هذه العملية، تحريك القطع الاغاروز إلى جانب الطبق واستخدام جدار طبق بتري عن الدعم في حين رفع من القطع الأغاروس.
الشكل 1: رسم تخطيطي لتركيب المنبثقة تعيين. (A) ويبين الرسم موقف الجنين شنت داخل الحلبة وسط الزجاج طبق بتري. على اليمين هو تقريب الجنين مع كل قطع على التوالي من خلال المحيطة يظهر الاغاروز مع خطوط حمراء dottted. وتخطيطي (ب) الأجنة التي شنت في النظر الجانبي عرض سهولة الوصول لكل الأهداف المقلوب وتستقيم. (ج) وحرفين متتاليين مماثلة تبين كيف يمكن تركيبه الأجنة لالرأسي ورقة الخفيفة التصوير مجموعة عمليات. يرجى CLإك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- إذا لا يتم حظر ارتعاش العضلات تماما في هذه النقطة، إضافة قطرات من تريكين من محلول المخزون من 4 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 7.
4. تصاعد الأجنة لعمودي ضوء ورقة المجهر
ملاحظة: هذا هو الاختلاف على طريقة المبينة أعلاه أن يسمح للوصول لأهداف متعددة للتصوير من العينات التي SPIM الموجه رأسيا. الفكرة من وراء هذا الاختلاف هو رفع عينة أعلى قليلا من أسفل الطبق، للسماح لسهولة الوصول هدفين التصوير.
- قبل أخذ عينات تصاعد، ومعطف 100 ملم البلاستيك طبق بتري مع 1٪ الاغاروز في E3 المتوسطة على ارتفاع 5 مم والسماح لتعيين.
- ضع قطرة من 1 مل-انصهار منخفضة نقطة الاغاروز إلى وسط الطبق والسماح لضبط.
- الأجنة تضمينها في ذوبان منخفضة نقطة الاغاروز كما في القسم 2. ومع ذلك، هذه المرة، وإزالة الجنين من الأنبوب 50 ملمن الاغاروز مع انخفاض أصغر من حل (0.5 مل)، ووضع هذه قطرة صغيرة على الجزء العلوي من 1 مل قطرة في وسط الطبق.
- استخدام إبرة الشعرية لوضع الجنين في وسط قطرة صغيرة والحفاظ على التوجه الصحيح حتى يتم تعيين هلام.
- الفيضانات الطبق مع الحل العمل تريكين وإزالة الاغاروز الزائدة كما هو الحال في القسم 3 ولكن من دون قطع طريق وسادة من الاغاروز معيار 1٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول المبينة أعلاه تفاصيل تقنية تنوعا لاقامة الأجنة الزرد على المدى الطويل التصوير الفاصل الزمني. ويرد مثال على ذلك في الشكل 2A وفي الرسوم المتحركة / فيديو الشكل 1. تم حقن الأجنة في مرحلة 1 خلية مع مرنا ترميز بروتين فلوري photoconvertible kikumeGR. في المرحلة 15 الجسيدة لنصرة أنها كما هو موضح أعلاه وتصوير لمدة 12 ساعة على مجهر مقلوب مبائر مع الهدف 10X. كان من المتوقع مداخن متحد البؤر الناتجة الحد الأقصى للظهور كما هو مبين. ويظهر هذا الفيلم بوضوح أن مؤخرة الجسم يسمح للتحرك بحرية طوال مدة الفيلم، ويظهر تغييرات مماثلة في التشكل كما رأينا في الأجنة التي يتم السماح لتطوير بحرية من المشيمه في ظروف ثقافة العادية.
ويظهر مثال إضافي في F igure 2Bوالرسوم المتحركة / فيديو الشكل 2. هنا، تم حقن الأجنة في مرحلة 16 خلية تحتوي على مزيج من من mRNAs ترميز هيستون بروتين 2B-mCherry (أي تسميات نوى) وEGFP: مربع CAAX (التي تصف الأغشية، لمزيد من التفاصيل انظر المرجع 5). ثم تم تصويرها أنها على مجهر multiphoton تستقيم مع الهدف 25X الغمر بالماء كما تخطيطي في الشكل 1B. واتخذت صورة لمدة 3 ساعة من المرحلة 10 الجسيدة من أجل رؤية السلوكيات الخلوية خلال تشكيل tailbud. يمكن أن ينظر إليه الخلايا لتوليد نتوءات النشطة والحركات الاتجاه كما الأشكال tailbud عادة.
الشكل 2: أمثلة من التصوير الوقت الفاصل بين الخلفي الجسم استطالة عند 10 X التكبير. (أ) إطارات متتاليةمن فيلم تمثيلي تغطي عملية استطالة المحورية. وتظهر الأجنة في ضوء الجانبي مع الخلفي إلى الجانب الأيمن من الصورة. (ب) إطارات متتالية من أعلى فيلم التكبير تظهر السلوكيات خلية فردية خلال تشكيل tailbud. وتظهر الأجنة في ضوء الجانبي مع الخلفي إلى اليمين. الخطوط المنقطة تلخص tailbud تشكيل. تظهر خطوط ملونة صغيرة مسارات نواة لمتابعة تحركات الخلية الفردية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرسوم المتحركة / فيديو الشكل 1: فيلم الوقت الفاصل بين الخلفي الجسم استطالة من KikumeGR مرنا المصبوبة الأجنة الزرد التي كتبها متحد البؤر المجهري. ويظهر الجنين مع الأمامي إلى اليسار والملصقمنطقة المحيط الهندي إلى اليمين. واتخذت صورة في 10 فترات دقيقة في 10X التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرسوم المتحركة / فيديو الشكل 2: فيلم الوقت الفاصل بين الخلفي الجسم استطالة من الأجنة النووية mCherry وغشاء GFP صفتها الزرد تصويرها بواسطة الميكروسكوب ثنائي الفوتون. يظهر الجنين مع الأمامي إلى اليمين والخلفي إلى اليسار. واتخذت صورة في فترات دقيقة 2 في 25X التكبير. الخطوط الملونة عرض مسارات الخلايا لعشر مرات الخطوات الأخيرة لكل خلية تتبع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتمكن هذه التقنية المتزايدة الأجنة أن تبقى تزال أثناء نقلها إلى المجهر وعلى المدى الطويل التجارب الوقت الفاصل بين التصوير تستهدف التالية الخلفية استطالة الجسم على مستويات طول متعددة. وعلاوة على ذلك، فمن تنوعا لأنه يتيح للتصوير على حد سواء وتستقيم المقلوب المجهر مجموعة عمليات، وقدم اقتراح لكيفية هذا يمكن زيادة تكييفها لSPIM الموجه عموديا.
خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو إزالة متأنية لالاغاروز الزائدة المحيطة مؤخرة الجسم الذي هو مهم للسماح التطور الطبيعي لهذا الهيكل. من المهم أن تعتني هنا في عدم الإضرار الجنين، وخاصة عند إزالة الاغاروز حول الجزء العلوي من صفار البيض. وبالإضافة إلى ذلك، يجب توخي الحذر عند إزالة كتلة قطع الاغاروز من حول الجنين، وأحيانا أنه من الممكن أن تفقد الجنين من العفن خلال هذه العملية. لهذه الأسباب، وهذا يبعد الإنتاجية المنخفضة طريقة ثار ليست مناسبة لاقامة العديد من الأجنة الزرد في وقت واحد، وعلى النقيض من سبق نشرها طرق الاستفادة 3D المطبوعة القوالب البلاستيكية. 8، 9 ومع ذلك، الأجنة مستقرة للغاية من قبل هذه طريقة التركيب، وبالتالي يمكن نقلها إلى المجهر أسهل بكثير، وتحتفظ التوجه 3D في جميع أنحاء استطالة مؤخرة الجسم.
خطوة حاسمة أخرى هي دقة التوجيه الجانبي الأولي للجنين، وتجنب أي انتيرو-الخلفي أو الميل ظهراني البطني. اما الميل يحول دون الرؤية الجانبية للتمديد مؤخرة الجسم، والتي هي الزاوية الأكثر ملاءمة نظر لمزيد من التحليل. فإن الميل انتيرو الخلفي في نتيجة إضافة في مؤخرة الجسم تنمو أعلى أو لأسفل بالنسبة للمستوى أفقي، الأمر الذي يعني الاستيلاء على أكوام أعلى في ض وبالتالي الوقت هفوات مع قرار وقت أقل.
هذا الأسلوب هو هاءوقد سمح rsatile وللتصوير معدلات انقسام الخلايا باستخدام خط Fucci 5، 10، فضلا عن تحليلات المورفومترية متعددة القياسي. 5 ولكن نظرا لنزوح شامل مثيرة للtailbud خلال استطالة محور مؤخرة الجسم، والأهداف التكبير فقط منخفضة نسبيا ويمكن استخدامها لالتقاط العملية برمتها من هذا القبيل كما هو مبين في الشكل 2. وذلك لأن ينتج عن ارتفاع تضخم في المنطقة من مصلحة ترك مجال الرؤية داخل 3-4 ساعة من الاستحواذ (فيديو الشكل 1). لذلك، طريقة واحدة لزيادة تحسين التصوير من tailbud هو أن يكون هناك خوارزمية تتبع الآلية التي يمكن أن تتبع الحركة العامة للtailbud وضبط س، ص، ض موقف للمرحلة المجهر خلال الاستحواذ. ونظرا لزيادة استقرار الجنين في جميع الأبعاد المحورية مع طريقة التركيب وصفها هنا، ينبغي أن يكون قابل للكاسلوب تعامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
