Et alsidigt Montering Metode til Long Term Imaging af zebrafisk Development

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Zebrafisk embryoner tilbyder en ideel eksperimentelle system til at studere komplekse morfogenetiske processer på grund af deres lette tilgængelighed og optisk gennemsigtighed. Især posterior krop forlængelse er en vigtig proces i fosterudviklingen, ved hvilken flere væv deformationer handle sammen for at styre dannelsen af ​​en stor del af kroppen akse. For at overholde denne proces ved langsigtede time-lapse billeddannelse er det nødvendigt at anvende et monterings teknik, der giver tilstrækkelig støtte til at opretholde prøver i den korrekte retning under overførsel til mikroskopet og erhvervelse. Desuden skal monteringen også tilvejebringe tilstrækkelig bevægelsesfrihed for udvæksten af ​​den bageste organ regionen uden at påvirke dens normale udvikling. Endelig skal der være en vis grad i alsidighed monteringsmetode for at tillade billeddannelse af forskellige billeddannende set-ups. Her præsenteres en monteringsteknik til afbildning af udviklingen af ​​posterior organ elongation i zebrafisk D. rerio. Denne teknik indebærer montering embryoner, således at hoved og blommesækken regioner er næsten udelukkende indgår i agarose, mens den bageste kroppen regionen til at forlænge og udvikle sig normalt. Vi vil vise, hvordan det kan tilpasses til opretstående, omvendt og vertikalt lys ark mikroskopi set-ups. Mens denne protokol fokuserer på montering embryoner til billeddannelse til den bageste organ, kunne det let tilpasses til direkte billedvisning af flere aspekter af zebrafisk udvikling.

Introduction

Posterior organ forlængelse er en vigtig proces af fosterudviklingen, hvorved embryo strækker sig til dannelse af en stor del af kroppen akse. Det er et eksempel på en kompleks morfogenetisk proces, hvor multiple celle adfærd handle koordineret for at generere morfogenese på niveau med individuelle væv. Disse differential væv deformationer derefter handle sammen for at generere forlængelsen af ​​den bageste legeme ved hele strukturen niveau. For at forstå, hvordan disse processer styres og koordineres under udvikling, skal vi være i stand til at følge disse processer på flere skalaer (dvs. på niveau med molekyler, celler, celle populationer og væv), og at relatere dette direkte til morfogenese af hele strukturen .

Zebrafisk embryoner er ideelle til billedbehandling posterior krop forlængelse som deres optisk transparens og lille størrelse giver mulighed for anvendelse af minimalt invasiv lys imaging tilgange velegnet til live billeddannelse. ¹ Dette er blevet dokumenteret ved en række nyere publikationer, der har kastet lys over posterior krop udvikling på niveau med molekyler, ² enkelte celler, ³ og inter-væv adfærd, ⁴ samt på niveau med cellepopulationen og hele orgel. ⁵

Avancerede billedteknik såsom konfokal, multi-foton mikroskopi og selektiv plan belysning mikroskopi (SPIM) aktiverer den langsigtede billeddannelse af udviklingsprocesser med nedsat virkning af lys toksicitet og foto-blegning. Solide teknikker til montering af levende prøver er nødvendige for at opnå tre mål: 1) tilstrækkelig støtte til at opretholde prøver i den korrekte retning under overførsel til mikroskopet og under erhvervelse, 2) tilstrækkelig bevægelsesfrihed af prøven for at tillade udvækst af den posteriore organ regionen uden at påvirke dens normale develling, og endelig 3) en vis grad i alsidighed monteringsmetode for at tillade billeddannelse af forskellige billeddannende set-ups.

Denne protokol indfører en monteringsteknik til afbildning af udviklingen af zebrafisk D. rerio. Denne teknik indebærer montering embryoer, således at hovedet og blommesæk regioner er næsten udelukkende inkluderet i agarose, mens den bageste kropsområde til at forlænges og udvikle sig normalt. Som sådan er det også en passende metode til den langsigtede billeddannelse af andre regioner i den krop som agarose muliggør imaging ved standard lys billeddannende teknikker. Denne protokol demonstrerer montering af embryoner i en lateral retning, selv om det også muligt at montere embryoner i alterative orienteringer. Det vil yderligere vise, hvordan man kan tilpasse metoden til opretstående, inverterede og vertikale lys ark mikroskopi opsætninger.

Protocol

1. Udarbejdelse af løsninger og Trukket Glass Needle Foretag en 25x stamopløsning af tricaine (3-amino benzoesyreethylester, også kaldet ethyl-3-aminobenzoat) ved 4 mg / ml i 20 mM Tris pH 8,8 og bringe denne løsning ved pH 7. alikvot af 4 ml og opbevares ved -20 ° C. BEMÆRK: bedøvelsesmiddel tricaine virker fortrinsvis på neurale spændingsstyrede natriumkanaler derved blokerer muskeltrækninger og bevægelse 6. Foretag en brugsopløsning af tricaine i en slut…

Representative Results

Protokollen ovenfor skitserede detaljer en alsidig teknik til montering af zebrafisk embryoner til langsigtet tid bortfalder billeddannelse. Et eksempel på dette er vist i figur 2A og i animeret / video figur 1. Embryoner blev injiceret ved 1 celle stadiet med mRNA der koder for det fluorescerende protein photoconvertible kikumeGR. Ved 15 somite stadium de blev monteret som beskrevet ovenfor og afbildet i 12 timer på et omvendt konfokalt mikroskop med …

Discussion

Denne montage teknik gør det muligt embryoner skal holdes stille under overførsel til mikroskopet og over langsigtede time-lapse imaging eksperimenter der sigter mod følgende bageste krop forlængelse på flere længdeskalaer. Desuden er det alsidigt, idet det giver mulighed for billedbehandling på begge opretstående og omvendt mikroskopi set-ups, og et forslag er lavet til, hvordan dette kan yderligere tilpasses vertikalt orienteret SPIM.

Et kritisk trin i denne protokol er den omhygge…

Materials

CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo