En allsidig monteringsmetode for Long Term Imaging av Sebrafisk Development

Summary

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Abstract

Sebrafisk embryo tilbyr en ideell eksperimentelt system for å studere komplekse morfogenetiske prosesser på grunn av sin enkle tilgjengelighet og optiske åpenhet. Spesielt er bakre legeme forlengelse en viktig prosess i fosterutviklingen ved hvilken flere vev deformasjoner som virker sammen for å styre dannelsen av en stor del av kroppen akse. For å observere denne prosessen ved langvarig time-lapse avbildning er det nødvendig å anvende en monteringsteknikk som tillater tilstrekkelig støtte for å opprettholde prøvene i den riktige orientering under overføring til mikroskopet og anskaffelse. I tillegg må monteringen også tilveiebringe tilstrekkelig bevegelsesfrihet for den utvekst av det bakre kroppsregion uten å påvirke normal utvikling. Til slutt må det være en viss grad i allsidighet av monterings metode for å tillate avbildning på ulike bildeoppsett. Her presenterer vi en monterings teknikk for å avbilde utvikling av bakre kropps elongation i sebrafisk D. rerio. Denne teknikken innebærer montering embryoer slik at hode og plommesekk regionene er nesten utelukkende inngår i agarose, og samtidig la ut bakre kroppsregion å forlenge og utvikle seg normalt. Vi vil vise hvordan dette kan tilpasses for stående, invertert og vertikal lys-ark mikros set-ups. Mens denne protokollen fokuserer på montering embryoer for bildebehandling for bakre kroppen, kan det lett tilpasses for live avbildning av flere aspekter av sebrafisk utvikling.

Introduction

Bakre legeme forlengelse er en viktig prosess i fosterutviklingen ved hjelp av hvilken embryoet strekker seg for å danne en stor del av kroppen akse. Det er et eksempel på en kompleks morfogenetiske prosess ved hvilken flere celle oppførsel opptre coordinately for å generere morfogenese på nivået av den enkelte vev. Disse differensial vev deformasjoner da fungere sammen for å danne forlengelsen av det bakre legemet i hele strukturen nivå. For å forstå hvordan disse prosessene styres og koordineres under utvikling, må vi være i stand til å følge disse prosessene på flere skalaer (dvs. på nivå med molekyler, celler, cellepopulasjoner og vev) og relatere dette direkte til morphogenesis av hele strukturen .

Sebrafisk embryoer er ideelle for avbildning bakre kroppen forlengelse som deres optiske gjennomsiktighet og liten størrelse gjør det mulig for bruk av minimalt invasive lys bildebehandling tilnærminger godt egnet til live bildebehandling. ¹ Dette har blitt dokumentert av en rekke nye publikasjoner som har belyst bakre kroppen utvikling på nivå med molekyler, ² enkeltceller, ³ og inter-vev atferd, ⁴ samt på nivået av cellepopulasjon og hele organet. ⁵

Avanserte imaging teknikker som confocal, multi-foton mikroskopi og selektiv plan belysning mikroskopi (SPAM) er slik at den langsiktige avbildning av utviklingsprosesser med nedsatt effekt av lys giftighet og foto-bleking. Robuste teknikker for montering av levende prøver er nødvendig for å oppnå tre mål: 1) tilstrekkelig støtte for å opprettholde prøvene i den riktige orientering under overføring til mikroskopet og under innhenting, 2) tilstrekkelig bevegelsesfrihet av prøven for å tillate utvekst av bakre kroppsregion uten å påvirke sin normal utvikling, og til slutt 3) en viss grad i allsidighet av monterings metode for å tillate avbildning på ulike bildeoppsett.

Denne protokollen innfører en montering teknikk for å avbilde utvikling av sebrafisk D. rerio. Denne teknikken innebærer montering embryoer slik at hode og plommesekk regionene er nesten utelukkende inkludert i agarose, og samtidig la bakre kroppsregion å forlenge og utvikle seg normalt. Som sådan, er det også en egnet metode for langvarig avbildning av andre deler av det fremkallende legeme som agarose muliggjør avbildning ved hjelp av standard lys avbildningsteknikker. Denne protokollen demonstrerer montering av embryo i en lateral retning, men det er også mulig å montere embryoer i alterative orienteringer. Det vil videre vise hvordan å tilpasse metoden for stående, invertert og vertikale lys ark mikroskopi oppsett.

Protocol

1. Utarbeidelse av løsninger og trukket glass Needle Foreta en 25x stamløsning av Tricaine (3-amino-benzosyre-etylester, også kalt etyl-3-aminobenzoat) ved 4 mg / ml i 20 mM Tris pH 8,8 og bringe denne oppløsningen er ved pH 7. Alikvoter av 4 ml og oppbevares ved -20 ° C. MERK: bedøvelse Tricaine virker fortrinnsvis på nevrale spenningsstyrte natriumkanaler og dermed blokkerer muskelrykninger og bevegelse 6. Foreta en arbeidsløsning av Tricaine ved en sluttkons…

Representative Results

Protokollen er skissert ovenfor detaljer en allsidig teknikk for montering av sebrafisk embryoer for langsiktig tid lapse imaging. Et eksempel på dette er vist i figur 2A og i animerte / video Figur 1. Embryoer ble injisert i en celle scene med mRNA som koder for photoconvertible fluorescerende protein kikumeGR. Ved 15 somitt trinnet ble de montert som beskrevet ovenfor og avbildes i 12 timer på et invertert konfokalmikroskop med et 10X objektiv. De re…

Discussion

Dette montering teknikken gjør at embryoene som skal holdes i ro under overføring til mikroskopet og over langsiktige time-lapse bildebehandling eksperimenter som tar sikte på å følge bakre kroppen forlengelse ved flere lengdeskala. Videre er det anvendelig ved at den tillater for avbildning på begge opprettstående og omvendt mikros oppsett, og et forslag er gjort for hvordan dette kan videre tilpasses vertikalt orientert SPIM.

Et kritisk punkt i denne protokollen er forsiktig fjernin…

Materials

CONSUMABLES
Glass-bottomed dishes	Mattek	P35-1.5-10-C	35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass
Capillaries for injection needles	Sutter	BF 120-94-10	We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.
Micro-scalpel	Feather	P-715	Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle
Pasteur Pipettes			230 mm long
REAGENTS
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Low-melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9414
EQUIPMENT
Fine forceps	FINE SCIENCE TOOLS GMBH	11252-30	Dumont #5
Needle puller	Sutter	P97	Heating-filament needle puller
Binocular dissecting microscope	Leica	S8 Apo