Abstract
Zebrafisk embryon erbjuder en idealisk experimentellt system för att studera komplexa morfogenetiska processer på grund av sin lättillgänglighet och optisk transparens. I synnerhet, är bakre kropp förlängning en viktig process i embryonal utveckling genom vilken flera vävnads deformationer agera tillsammans för att styra bildandet av en stor del av kroppen axeln. I syfte att observera denna process genom långsiktiga tidsförlopp avbildning är det nödvändigt att utnyttja en monteringsteknik som gör att tillräckligt stöd för att hålla prover i rätt orientering under överföring till mikroskopet och förvärvet. Dessutom måste monteringen också ge tillräcklig rörelsefrihet för utväxt av den bakre kroppsområdet utan att påverka dess normala utveckling. Slutligen måste det finnas en viss grad i mångsidigheten hos monteringsmetod för att möjliggöra avbildning på olika avbildnings uppställningar. Här presenterar vi en monteringsteknik för avbildning av utvecklingen av bakre kroppen elongation i zebrafisk D. rerio. Denna teknik innebär att montera embryon så att huvudet och gulesäcken regioner nästan helt ingår i agaros, medan ut den bakre kroppsområdet för att förlänga och utvecklas normalt. Vi kommer att visa hur detta kan anpassas för upprätt, inverterad och vertikala ljus ark mikroskopi uppställningar. Även om detta protokoll är inriktat på monterings embryon för bildframställning för den bakre kroppen, kan det enkelt anpassas för den levande avbildning av multipla aspekter av zebrafisk utveckling.
Introduction
Posterior kroppen töjning är en viktig process i embryonal utveckling, genom vilken embryot sträcker att bilda en stor del av kroppen axel. Det är ett exempel på en komplex morfogenetiska process genom vilken flera cell beteenden agera koordinerat att generera morfogenes på de enskilda vävnader. Dessa differential vävnad deformationer sedan agera tillsammans för att generera förlängningen av den bakre kroppen på hela strukturen nivå. För att förstå hur dessa processer styrs och samordnas under utveckling, måste vi kunna följa dessa processer på flera skalor (dvs. i nivå med molekyler, celler, populationer och vävnader cell) och relatera detta direkt till morfogenes av hela strukturen .
Zebrafisk embryon är idealiska för avbildning bakre kropp förlängning som deras optiska transparens och liten storlek gör det möjligt att tillämpa minimalinvasiv ljus avbildning väl lämpad för live avbildning. 1 Detta har bevisats genom en rad av de senaste publikationer som har belyst bakre kroppens utveckling i nivå med molekyler, 2 enskilda celler, 3 och intervävnads beteenden, 4 samt på graden av cellpopulationen och hela organ. 5
Avancerad avbildningstekniker såsom konfokal, multifoton mikroskopi och selektiv plan belysning mikroskopi (SPIM) aktiverar den långsiktiga avbildning av utvecklingsprocesser med minskad effekt av ljus toxicitet och fotoblekning. Robusta tekniker för montering av levande prover krävs för att uppnå tre mål: 1) tillräckligt stöd för att hålla prover i rätt orientering under överföring till mikroskopet och under förvärv, 2) tillräcklig rörelsefrihet av provet för att medge utväxt av den bakre kroppsområdet utan att påverka dess normala develling, och slutligen 3) en viss grad i mångsidigheten hos monteringsmetod för att möjliggöra avbildning på olika avbildnings uppställningar.
Detta protokoll introducerar en monteringsteknik för avbildning utveckling av zebrafisk D. rerio. Denna teknik innebär att montera embryon så att huvudet och gulesäcken regioner nästan helt i agaros, medan den bakre kroppsområdet för att förlänga och utvecklas normalt. Som sådan, är det också en lämplig metod för den långsiktiga avbildning av andra regioner i utvecklings kroppen som agarosen möjliggör avbildning av standardljusavbildningstekniker. Detta protokoll visar montering av embryon i en lateral riktning, även om det är också möjligt att montera embryon i alterative orienteringar. Det kommer vidare att visa hur man kan anpassa metoden för upprätt, inverterade och vertikala ljus ark mikroskopi inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av lösningar och dras glas Needle
- Gör en 25x förrådslösning av Tricaine (3-aminobensoesyra-etylester, även kallad etyl 3-aminobensoat) vid 4 mg / ml i 20 mM Tris pH 8,8 och föra denna lösning är vid pH 7. Alikvot av 4 ml och förvara vid -20 ° C.
OBS: bedövningsmedel Tricaine verkar företrädesvis på neurala spänningskänsliga natriumkanaler och därmed blockerar muskelryckningar och rörelse sex. - Gör ett arbetslösning av Tricaine vid en slutlig koncentration av 0,17 mg / ml i E3 embryo medium. 7
OBS: Gör Tricaine arbetslösning improviserat som pH för denna lösning drivor. - Lös den lågsmältande agaros till en slutlig koncentration av 1,5% i E3 embryo medium i ett 50 ml rör genom uppvärmning av lösningen i en mikrovågsugn. Låt denna lösning jämviktas till 42-45 ° C i antingen ett vattenbad eller bänk-top inkubator. Om att förbereda stora rätter för vertikalljus ark imaging (steg 4), gör ytterligare 25 ml av 1% standardsmält agaros i E3 embryo medium.
- Använd borsilikatglas med glödlampor kapillärer med måtten OD 1,20 mm, ID 0,69 mm, längd 10 mm.
- Om kapillärerna dras på vilken typ av uppvärmningsfilament nål avdragare beskrivs i tabellen av utrustning och reagenser, använd följande inställningar: Heat 600, Pull 120, Velocity 50, Time 225, Pressure 500. Med ett par vassa pincett, paus nålen precis förbi den punkt där den böjs för att skapa en ren och skarp nål för orientering embryon och avlägsna överskott agaros. En mikro-skalpell kan också användas för att avlägsna överskott av agaros.
2. inbäddning av embryon för Inverted eller Upright mikroskopi
- Höj embryon upp till lämpligt skede i E3 embryo medium. 7
- Vid önskad scen, dechorionate embryon med ett par vassa pincett under en kikare dissecting mikroskop.
- Inkubera dechorionated embryon under minst 5 min i Tricaine arbetslösning.
- När den smälta agaroslösningen har svalnat till 45 ° C, använd en glas pasteurpipett att överföra dechorionated embryot direkt i 50 ml rör med minimal överföring av E3 medium.
- Ta bort embryot tillsammans med cirka 1 ml monteringsmedium och tillsätt ca. 100 pl av monteringsmedium tillsammans med embryot till den centrala cirkeln av en 35 mm glasbottnad petriskål med en 10 mm mikrobrunn.
- Som monteringsmedium är inställningen, flytta embryot till kanten av cirkeln med agaros med svansen vänd utåt (Figur 1A). Använda kapillär nål för att bibehålla embryot i den önskade sidoorientering tills gelén är helt inställd. Till bilden bakre kroppens utveckling, vara noga med att orientera embryot i lateral en orientering som möjligt. Därför upprätthålla embryot i detta läge genom noggranna adjustments med kapillär nål.
OBS: Flera embryon kan läggas till monterings skålen vid denna punkt, om så krävs. Om detta är fallet, överför med låg smälta agarosen i skålen först och tillsätt embryona till centrum av agarosen droppe. Tryck sedan embryon ut till kanterna på glasringen och orientera till önskat läge. Upp till sex embryon kan monteras på detta sätt innan agarosen blir stelnat.
3. avlägsnande av överskott Agarose Runt Posterior Body
OBS: Detta avsnitt beskriver det förfarande genom vilket agaros avlägsnas från den region som omger den bakre kroppen. I fallet med bakre kroppen töjning, är det viktigt att säkerställa att svansen kan växa ut på normalt sätt. Genom att ta bort agarosen efter embryot har helt med av agaros, är embryot kvar omges av huvudet regionen och ungefär hälften av gulesäcken.
- När agarosen droppe har satt, översvämma petri dish med Tricaine arbetslösning.
- Enligt en dissekera binokulärt mikroskop med en genomlysnings bas, justera spegeln position och vinkel av infallande ljus så att den starka kontrasten möjliggör nedskärningarna i agarosen ses tydligt genom verksamheten.
- För att utföra skära en (figur 1), använda kapillär nål eller mikro skalpell för att skära agaros halvvägs längs äggulan, från en position strax posteriort formnings hjärta fältet till positionen för somit 5 (5: e anterior somit).
- Starta inledande skärningen i anslutning till formnings hjärtat såsom visas, och den fullständiga vägen genom agarosen till glaset.
- Håll kapillär eller mikro skalpell djupt inne i agaros, och långsamt såg upp och ner samtidigt börjar göra en lång snitt över embryot som visas i Figur 1. Skär så nära embryot som möjligt utan att punktera embryot eller äggula.
- Därefter göra nedskärningar 2 och 3 (Figur 1 OBS: Cutting agarosen tills kanten av glaset cirkel (såsom visas i figur 1) hjälpmedel vid avlägsnande av agarosen som en komplett blocket (steg 3,6). Emellertid är detta inte nödvändigt.
- Börjar vid korsningen av nedskärningar 1 och 3, gör en långsam diagonal snitt i slutet av snittet 2 medan långsamt lyfta uppåt för att lossa kvadraten på agaros som omger den bakre kroppen.
Anmärkningar: I vissa fall kommer detta att släppas i ett block och själva processen har avslutats på en gång. I andra fall kan det ta flera försök att dis-lodge alla agarosen omger embryot. - Med ett par vassa pincett, ta bort rubbas blås av agaros från embryot medium. För att underlätta denna process, flytta agarosen bitar vid sidan av skålen och använda väggen i petriskål som stöd medan lyfta ut agarosen bitar.
Figur 1: Diagram över Montering uppställningar. (A) Diagrammet visar läget för den monterade embryot i centrum glasring av en petriskål. Till höger är en zoom av embryot med varje efterföljande snitt genom den omgivande agaros visas med dottted röda linjer. (B) De monterade embryon schematiskt i sidovy visar lättillgänglighet för både inverterade och upprättstående mål. (C) En liknande digram som visar hur embryon kan monteras för ljus ark vertikal avbildning uppställningar. vänligen click här för att se en större version av denna siffra.
- Om muskelryckningar inte är fullständigt blockerat vid den punkten, tillsätt droppar Tricaine från förrådslösning av 4 mg / ml, pH 7.
4. Montering av embryon för vertikal Ljus ark Mikroskopi
OBS: Detta är en variant av den metod som beskrivs ovan som möjliggör åtkomst av flera mål för avbildning av prover av vertikalt orienterade SPIM. Tanken bakom denna variation är att lyfta provet något högre än skålens botten, för att möjliggöra enkel åtkomst av två avbildnings mål.
- Före provmontering, belägga en 100 mm plast petriskål med 1% agaros i E3 medium till en höjd av 5 mm och låt stelna.
- Placera en droppe av 1 ml med låg smältpunkt agaros till mitten av skålen och tillåta att ställa in.
- Bädda embryon i låg smältpunkt agaros som i avsnitt 2. Men den här gången, ta bort embryot från 50 ml rörav agaros med en mindre droppe av lösningen (0,5 ml) och placera denna liten droppe på toppen av en ml släppa i mitten av skålen.
- Använda kapillär nål för att placera embryot i centrum av den lilla droppen och bibehålla dess korrekta orientering tills gelén är inställd.
- Översvämning skålen med Tricaine arbetslösning och avlägsna överskottet av agaros som i avsnitt 3, men utan att skära genom kudde av 1% standard agaros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som beskrivs ovan anger en mångsidig teknik för montering av zebrafiskembryon för långvarig tidsförlopp avbildning. Ett exempel på detta visas i Figur 2A och i animerade / video Figur 1. Embryon injicerades vid en cellstadiet med mRNA som kodar för photoconvertible fluorescerande proteinet kikumeGR. Vid 15 somit stadiet var de monterade såsom beskrivits ovan och avbildas i 12 h på ett inverterat konfokalmikroskop med ett 10X objektiv. De resulterande konfokala stackar var maximalt beräknas visas som visas. Denna film visar tydligt att den bakre kroppen får röra sig fritt under hela filmen och visar liknande förändringar i morfologi som ses i embryon som får utvecklas fritt deras chorion under normala odlingsbetingelser.
Ett ytterligare exempel visas i F igure 2Boch animerade / video Figur 2. Här var embryon injiceras vid 16 cellstadiet med en kombination av mRNA som kodar för histon 2B-mCherry protein (som märker kärnorna) och EGFP: CAAX box (som märker membran, för mer information se referens 5). De sedan avbildas på en upprätt multifotonmikroskop med en nedsänkning i vatten 25X objektiv som i diagramform i figur 1B. Bilder togs för tre timmar från 10 somit scenen för att visualisera cellulära beteenden under tailbud bildning. Celler kan ses för att generera aktiva utsprång och riktnings rörelser som de tailbud former som normalt.
Figur 2: Exempel på Time-lapse avbildning av posterior Body töjning vid 10 gångers förstoring. (A) På varandra följande ramarav en representativ film täcker processen för axiell förlängning. Embryon visas i sidovy med posteriort till den högra sidan av bilden. (B) På varandra följande ramar i en högre förstoring film som visar enskilda cell beteenden under tailbud bildning. Embryon visas i sidovy med posterior till höger. Prickade linjer beskriva formnings tailbud. Små färgade linjerna visar spår av kärnor för att följa enskilda cellrörelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Animerad / Video Figur 1: Time-lapse film av posterior Body Förlängning av en KikumeGR mRNA Injicerade Zebrafish Embryo av konfokalmikroskopi. Embryo visas med främre till vänster och affischIOR till höger. Bilder togs vid 10 minuters intervall vid 10x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Animerad / Video Figur 2: Time-lapse film av posterior Body Förlängning av en kärn mCherry och Membrane-GFP märkt Zebrafish Embryo avbildas av två-foton mikroskopi. Embryo visas med anterior till höger och bakre till vänster. Bilder togs vid 2 minuters intervall vid 25X förstoring. Färgade linjer visar spår av celler under de senaste tio tidssteg för varje spårad cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna monteringsteknik gör det möjligt för embryon hållas stilla under överföring till mikroskop och över långa tidsförlopp imaging experiment som syftar till följande bakre kroppen töjning vid flera längdskalor. Dessutom är den mångsidig i att det möjliggör för avbildning på både upprätt och inverterad mikroskopi uppställningar, och ett förslag görs för hur detta kan ytterligare anpassas till vertikalt orienterad SPIM.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är noggrann avlägsnande av överskott agaros som omger den bakre kroppen som är viktig för att den normala utvecklingen av denna struktur. Det är viktigt att ta hand här i inte skada embryot, särskilt vid avlägsnande av agarosen runt toppen av äggulan. Dessutom måste man vara försiktig när du tar bort den skurna agarosen kvarter från runt embryot, som det ibland är möjligt att förlora embryot från formen under denna process. Av dessa skäl är detta en låg genomströmning metod that är inte lämplig för montering av många zebrafisk embryon samtidigt, i motsats till redan publicerade metoder som utnyttjar 3D tryckt plastformar. 8, 9 Men embryon är mycket stabila genom denna monteringsmetod och kan därför transporteras till mikroskopet mycket lättare, och behåller sin 3D orientering hela bakre kropp förlängning.
En annan avgörande steg är noggrannheten av den ursprungliga sidoorientering av embryot, undvika antero-posterior eller dorso-ventrala lutning. Antingen lutning utesluter sido syn på den bakre kroppen förlängning, som är den mest praktiska synvinkeln för vidare analys. Den antero-posterior lutning kommer i additionsresultatet i den bakre kroppen växer uppåt eller nedåt i förhållande till horisontalplanet, vilket kommer att innebära förvärv av högre staplar i z och därmed tidsbortfaller med en lägre tidsupplösning.
Denna metod är versatile och har gjort det möjligt för avbildning av celldelningshastigheter med användning av Fucci linjen 5, 10 samt fler skalär morfometriska analyser. 5 Med tanke på den dramatiska totala förskjutningen av tailbud under töjning av de bakre kroppsaxel, endast relativt låga mål förstoring kan användas för att fånga hela processen, såsom visas i figur 2. Detta beror på att högre förstoring resulterar i regionen av intresse som lämnar synfältet inom 3-4 h för förvärvet (Video Figur 1). Därför ett sätt att ytterligare förbättra avbildning av tailbud är att ha en automatiserad spårningsalgoritm som kan spåra den totala rörelsen av tailbud och justera x, y, z-positionen av mikroskop scenen under förvärvet. Med tanke på den ökade stabiliteten av embryot i alla axiella dimensioner med monteringsmetoden som beskrivs här, bör det vara mottaglig förett sådant tillvägagångssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene. Paperback (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, Chapter 19 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
