Mammalcelleindkapsling i alginatperler ved hjælp af et enkelt omrørt skib

Summary

Denne video og manuskript beskriver en emulsionsbaseret fremgangsmåde til indkapsling af pattedyrsceller i 0,5% til 10% alginatperler, der kan fremstilles i store batcher under anvendelse af en simpel omrørt beholder. De indkapslede celler kan dyrkes in vitro eller transplanteres til cellulære terapiapplikationer.

Abstract

Celleindkapsling i alginatperler er blevet anvendt til immobiliseret cellekultur in vitro såvel som til immunoisolering in vivo . Indkapsling af pancreasøerne er blevet undersøgt i vid udstrækning som et middel til at øge overlevelsen af ​​øerne i allogene eller xenogene transplantater. Alginatindkapsling opnås almindeligvis ved dyseekstrudering og ydre gelering. Ved anvendelse af denne metode falder celleholdige alginatdråber dannet ved spidsen af ​​dyser i en opløsning indeholdende divalente kationer, der forårsager ionotrop alginat gelering, da de diffunderer ind i dråberne. Kravet om dannelse af dråber ved dysespidsen begrænser den volumetriske gennemstrømning og alginatkoncentration, der kan opnås. Denne video beskriver en skalerbar emulgeringsfremgangsmåde til indkapsling af pattedyrceller i 0,5% til 10% alginat med 70% til 90% celleoverlevelse. Ved denne alternative fremgangsmåde emulgeres alginatdråber indeholdende celler og calciumcarbonat i mineralolie, folNedsat ved et fald i pH, hvilket fører til intern calciumfrigivelse og ionotrop alginat gelering. Den nuværende metode tillader fremstilling af alginatperler inden for 20 minutter emulgering. Det udstyr, der kræves til indkapslingstrinnet, består i enkle omrørte beholdere til rådighed for de fleste laboratorier.

Introduction

Mammalcelleindkapsling er bredt undersøgt som et middel til at beskytte transplanterede celler mod immunafstødning ¹ eller for at tilvejebringe en tredimensionel støtte til immobiliseret cellekultur ^{2 , 3 , 4} . Indkapsling af pancreasøer i alginatperler har været anvendt til at reversere diabetes i allogene ^{5 , 6} eller xenogene ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} gnavere. Prækliniske og kliniske forsøg med indkapslet pankreatisk øletransplantation til behandling af type 1 diabetes er løbende ^{13 , 14 , 15} . Til transplantationsapplikationer eller større skalE in vitro immobiliseret celleproduktion anvendes dysebaserede perlegeneratorer generelt. Typisk pumpes en blanding af alginat og celler gennem en dyse for at danne dråber, der falder ind i en omrørt opløsning indeholdende divalente kationer, hvilket resulterer i den ydre gelering af dråberne. Koaksial gasstrøm ^{16 , 17} , dysevibration ¹⁸ , elektrostatisk afstødning ¹⁹ eller roterende ledninger ²⁰ letter dråbeformation ved dysespidsen.

De væsentligste ulemper ved konventionelle perlegeneratorer er deres begrænsede gennemstrømning og det begrænsede interval af opløsningsviskositeter, som vil resultere i tilstrækkelig perledannelse ²¹ . Ved høje strømningshastigheder bryder væsken ud af dysen op i dråber, der er mindre end dysediameteren, hvilket reducerer størrelsesstyringen. Multi-dyse perle generatorer kan bruges til at øge gennemstrømningen, menDen ensartede fordeling af strømmen mellem dyserne og brugen af ​​opløsninger> 0,2 Pas er problematisk ²² . Endelig forventes alle dysebaserede anordninger at medføre nogen skade på øerne, da diameteren af ​​de anvendte dyser er mellem 100 μm og 500 μm, mens ~ 15% af menneskelige holme kan være større end 200 μm ²³ .

I denne video beskriver vi en alternativ metode til indkapsling af pattedyrceller ved at danne dråber i et enkelt emulgeringstrin i stedet for drop-by-drop. Da perleproduktionen udføres i en simpel omrørt beholder, er metoden egnet til små (~ 1 ml) til storskala (10 ³ L række) perleproduktion med lave udstyrsomkostninger ²⁴ . Denne metode tillader fremstilling af perler med høj sfæricitet ved anvendelse af en bred vifte af alginatviskositeter med korte ( f.eks. 20 min) perlegenereringstider. Denne metode blev oprindeligt udviklet af Poncelet et al. ^{25 , 26} og anvendes til at immobilisere DNA ²⁷ , proteiner ²⁸ inklusiv insulin ²⁹ og bakterier ³⁰ . Vi har for nylig tilpasset disse metoder til indkapslingen af ​​pattedyrsceller under anvendelse af pancreas-beta-cellelinier ^{31 , 32} og primært pankreasvæv ³² .

Princippet med metoden er at frembringe en vand-i-olie emulsion bestående af alginatdråber i mineralolie efterfulgt af intern gelering af alginatdråberne ( figur 1 ). Først dispergeres indkapslingsmiddelet ( f.eks. Celler) i en alginatopløsning indeholdende et fint korncalciumsalt med lav opløselighed ved den indledende proces pH. Alginatblandingen tilsættes derefter til en omrørt organisk fase for at danne en emulsion, sædvanligvis i nærværelse af aoverfladeaktivt middel. I tilfælde af pattedyrcelleindkapsling kan komponenter, der er til stede i serum, fungere som overfladeaktive midler. Dernæst reduceres pH for at solubilisere calciumsaltet ved tilsætning af en olieopløselig syre, som skiller sig ind i vandfasen. Eddikesyre, med en partikelkoefficient på mineralolie / vand <0,005 ³³ , skal foropløses i olie, tilsættes derefter til emulsionen, hvor den blandes i oliefasen og hurtigt skiller sig ind i vandfasen ³⁴ . Figur 2 illustrerer de kemiske reaktioner og diffusion, som finder sted under forsurende og indre geleringstrin. Endelig gendannes de indkapslede celler ved faseinversion, faseseparation accelereret ved centrifugering, gentagne vaskningstrin og filtrering. Disse trin kan derefter efterfølges af perle- og celleprøvetagning til kvalitetskontrolanalyser, in vitro cellekultur og / eller transplantation af de indkapslede celler.

Figur 1: Skematisk af emulgeringsbaseret proces til indkapsling af pattedyrsceller. Perler fremstilles først ved at emulgere en alginat-, celle- og CaCO3-blanding i mineralolie (trin 1 og 2 i skematisk), der udløser intern gelering ved tilsætning af eddikesyre (trin 3). De gelerede perler adskilles derefter fra olien ved tilsætning af en vandig buffer til udløsningsfaseinversion (trin 4) efterfulgt af centrifugering og oliesugning (trin 5) og derefter filtrering (trin 6). Endelig overføres perlerne opsamlet på filteret til cellekulturmedium til in vitro- kultur eller til transplantation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Reaktioner og diffusionstrin, der forekommer under intern gelering. (1) Eddikesyre tilsættes til den organiske fase og transporteres til alginatdråberne ved konvektion. (2) Eddikesyren fordeler sig i vandfasen. (3) I nærvær af vand dissocierer og diffuserer syren til opnåelse af CaCO3-kornene afbildet i mørkeblå. (4) H ⁺ -ionerne udveksles med Ca2 ⁺ -ionerne i CaC03, idet Ca2 ⁺ -ioner frigives. (5) Calciumionerne diffunderer, indtil de rammer uomsat alginat, hvilket fører til ionotrop krydsbinding af alginatkæderne. Klik her for at se en større version af denne figur.

I modsætning til konventionelle dysebaserede celleindkapslere er en bred perlestørrelsesfordeling eksponeretCted fra denne proces på grund af dråbeformationsmekanismen i omrørt emulgering. For en delmængde af applikationer kan denne perlestørrelsesfordeling være problematisk. For eksempel kan en større del af celler eksponeres ved perleoverfladen i mindre perler. Hvis næringsstofbegrænsninger ( f.eks. Ilt) er en bekymring, kan disse begrænsninger forværres i større perler. En fordel ved den omrørte emulgeringsfremgangsmåde er, at den gennemsnitlige vulststørrelse let kan justeres ved at ændre omrøringshastigheden under emulgeringstrinnet. Breddsstørrelsesfordelingen kan også udnyttes til at studere effekten af ​​perleformat på indkapslet celleydelse.

Mammalcelleindkapsling ved emulgering og intern gelering er et interessant alternativ til laboratorier, der ikke er udstyret med en vulstgenerator. Desuden giver denne metode brugerne mulighed for at reducere behandlingstiden eller generere perler ved meget lav eller meget høj alginatkoncentreringtioner.

Protokollen beskrevet nedenfor beskriver, hvordan man indkapsler celler i 10,5 ml 5% alginatopløsning fremstillet i 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) buffer. Alginatet består af en 50:50 blanding af transplantationskvalitet LVM (lavviskositetshøjt mannuronsyreindhold) og MVG (middelviskositetshøj guluronsyreindhold) alginat. Calciumcarbonat i en slutkoncentration på 24 mM anvendes som det fysiske tværbindingsmiddel. Let mineralolie udgør den organiske fase, medens eddikesyre anvendes til at syrne emulsionen og udløse intern gelering. Imidlertid afhænger alginat typen og sammensætningen såvel som den valgte procespuffer af den ønskede anvendelse ³² . En række alginattyper (se tabel over materialer) er blevet anvendt til fremstilling af perler med denne protokol.

Protocol

1. Forbered Alginatopløsningen, CaCO3-suspensionen og den syrnede olie

1. Forbered procesbufferen og mediumet.
   1. Forbered den typiske procesbuffer, der anvendes til at generere højkoncentrationsalginatperler ved anvendelse af 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Juster pH til 7,4.
   2. Forbered det typiske dyrkningsmedium under anvendelse af Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin.
2. Forbered alginatbestandsløsningen ved 1,17 gange den endelige ønskede koncentration i perlerne.
   1. Først vejes den passende mængde alginatpulver. For at opnå en slutkoncentration på 5% alginat med 50:50 LVM og MVG-alginat vejes for eksempel i alt 1,17 g natriumalginat ved at kombinere 0,583 g LVM-alginatpulver og 0,583 g MVG-alginatpulver.
   2. Anbring 20 ml procesbuffer i en autocLavbar glasburk på en magnetisk omrøringsplade og omrør ved 200 rpm. Tilsæt gradvis natriumalginatpulveret til opløsningen.
   3. Lad opløsningen omrøre natten over ved lav hastighed. Fastgør kolben om nødvendigt til omrøringspladen.
   4. Hvis opløsningen er ufuldstændig opløst, fastgør flasken på en roterende blander og fortsæt med at blande ved 37 ° C i yderligere 24 timer.
   5. Steriliser alginatopløsningen ved autoklavering af opløsningen i 30 minutter i et kar, der er mindre end halvt fyldt. Lad temperaturen falde til under 60 ° C, før opløsningen opløses.
   6. Fjern om nødvendigt partikler ved at filtrere alginatopløsningen kort efter autoklaveringen, inden den når stuetemperatur, mens viskositeten forbliver tilstrækkelig lav.
3. Forbered calciumcarbonatsuspensionen ved 21 gange den endelige ønskede koncentration til intern gelering.
   1. Afvej CaCO ₃ pulveret. For eksempel annonceD 1 g CaC03 til 20 ml procesbuffer til opnåelse af 24 mM CaC03 som den endelige geleringsmiddelkoncentration.
   2. Autoklaver CaCO3 suspensionen i 30 minutter.
      BEMÆRK: CaCO ₃ koncentrationen vil ændre sig over tid på grund af bicarbonat-CO ₂ -evægten. Undgå at bruge den samme bestand CaCO ₃ suspension i mere end 10 indkapslingsprocedurer.
4. Autoklaver det omrørte kar, der anvendes til emulgeringsprocessen. Før brug, fjern eventuelle spor af kondensvand tilbage i spinnerflasken.
5. Umiddelbart inden emulgeringsprocessen fremstilles den syrnede olie. Opløs 44 μL eddikesyre pr. 11 ml mineralolie anbragt i et 50 ml konisk rør.
   BEMÆRK: En almindelig fejl er ufuldstændig opløsning af eddikesyren. Undgå at pipettere små mængder eddikesyre og sørg for, at eddikesyren er fuldstændigt opløst i olie ved gentagen hvirvling.
   FORSIGTIG: eddikesyre er en giftig an D flygtig syre. Håndter dette reagens under en gashætte og hold eddikesyre / olieopløsningen i en lukket beholder indtil emulgeringstrinnet. Se MSDS-oplysningerne på dette reagens for yderligere information.
6. Lad alle opløsninger nå stuetemperatur, før de fortsætter til celleindkapsling.

2. Alginat perle Generation ved emulgering og intern gelering

1. Placer 10 ml let mineralolie i spinnerflasken og start omrøringen med lav rotationshastighed ( f.eks. 250 omdr./min. For spinnerflasken anvendt i denne video).
2. Hvis cellerne, der anvendes til processen, er fra vedhængende kulturer, skal trypsin suspendere cellerne. Afslut reaktionen ved at tilsætte FBS-indeholdende medium eller trypsininhibitor og indsamle en prøve til celleopregning.
   1. Bestem cellekoncentrationen og levedygtigheden efter trypanblåt farvning ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celle tæller som tidligere beskrevetAss = "xref"> 32.
3. Centrifuger cellerne i 7 minutter ved 300 xg og vask dem en gang i det ønskede medium til celle immobilisering. Sørg for, at dette medium indeholder emulgeringsmidler, såsom enten FBS eller bovint serumalbumin (BSA). Brug for eksempel DMEM indeholdende 10% FBS.
4. Re-suspender cellepellet i det samme medium for at opnå 10,5 gange den ønskede endelige koncentration i perlerne.
5. Tilsæt 1,1 ml af den 10,5 gange koncentrerede cellebestand til 9,9 ml af alginatopløsningen. Derefter tilsættes 550 μL CaCO ₃ suspension og blandes ved omrøring med en steril spatel for at sikre en jævn fordeling af CaCO ₃ .
6. Overfør straks 10,5 ml af alginat-, celle- og CaC03-blandingen i omrøringsolien under anvendelse af en sprøjte.
   BEMÆRK: For højt viskøse opløsninger, aspirere og udstød blandingen meget langsomt for at undgå luftbobler. I nogle tilfælde foretrækkes det at stoppe omrøringen, mens blandingen tilsættes til kolben for at undgåAlginat inddragelse på impellerakslen.
7. Umiddelbart efter tilsætning af alginat-, celle- og CaC03-blandingen til olien øges omrøringshastigheden.
   BEMÆRK: For den 5% LVM: MVG-alginat, der anvendes her, blev der anvendt en rotationshastighed på 1025 omdr./min for at frembringe perler med en diameter på ca. 900 μm, der er egnede til in vitro- kultur ³⁵ . Højere rotationshastigheder og lavere alginatkoncentrationer vil føre til lavere gennemsnitlige vulstdiametre, som beskrevet i tidligere publikationer ^{25 , 32} . Små ændringer i pumpehjul og fartøjsgeometri såvel som alginategenskaber kan i høj grad påvirke gennemsnitspirediameteren. For hver ændring i beholderkonfiguration eller alginatparti skal en standardkurve, der relaterer overfladearealmønsterets gennemsnitlige perle diameter til rotationshastigheden, genereres ³² .
8. Start timeren og emulger alginatet i 12 minutter.
9. Tilsæt 10 ml tHan olie- og eddikesyreopløsning for at syrne emulsionen, opløse CaCO3 og dermed fysisk tværbind alginatet til gelerede perler. Tillad 8 minutter for dette forsuringstrin.

3. Bead Recovery

1. Reducer omrøringshastigheden til 400 omdr./min. Tilsæt 40 ​​ml procesbuffer blandet med 10% medium for at øge pH og for at forårsage faseinversion.
2. Stop omrøringen 1 min senere og overfør blandingen til 50 ml centrifugerør. Skyl spinnerflasken med yderligere 20 ml medium og tilsæt det til røret. Aspirer så meget vandig fase som muligt fra spinnerflasken, før aspirering af oliefasen for at minimere perlekontakt med oliefasen.
   BEMÆRK: Brug en storboringspipette ( f.eks. 25 ml pipette) på dette trin og fra dette punkt for at undgå at beskadige perlerne. For mindre volumener kan perleophænget også manipuleres med skårne pipettespidser. For at få sådanne tips skal du klippe enden af ​​pipettespidsen med saks hvIle iført øjenbeskyttelse.
3. Centrifuger rørene i 3 minutter ved 630 xg for at accelerere beadafregning og faseseparation.
4. Fjern olie og overskydende vandig opløsning ved at aspirere med en Pasteur pipette.
5. Vask perlerne mindst en gang med medium. Filtrer perlesuspensionen på 40 μm nyloncellestrømningsmidler og aspirér overskydende væske forbundet med perlerne nedenunder silen. Overfør perlerne i et kendt volumen af ​​medium ved hjælp af en steril spatel.
   BEMÆRK: Mindre eller større porestørrelsesfiltre kan anvendes i dette trin afhængigt af målets minimumstempeldiameter. Imidlertid anbefales tyngdekraftsfiltrering snarere end trykdrevet filtrering gennem sub-mikron porestørrelsesfiltre for at undgå beskadigelse af perlerne.
6. Måle volumen volumen forskydning (volumen efter at have tilføjet perlerne, minus volumenet forud for tilsætning af perlerne) og læg op mediet for at opnå den ønskede perle: total volumenforhold, som typisk er 1: 5 eller 1 ml perler i4 ml medium. Fra dette punkt skal du altid bruge store borepipetter for at undgå at beskadige perlerne.
7. Overfør de indkapslede celler til T-kolber til in vitro- kultur eller transplantationsforsøg.

4. Kvalitetskontrol og applikationer

BEMÆRK: For at sikre indkapslet celle- og perlekvalitet bør perlestørrelsesfordelingen og celleoverlevelsen efter processen kvantificeres. Omvendt gelen for at genvinde cellerne inde fra perlerne til yderligere analyse udføres almindeligvis.

1. For at bedømme perlestørrelsesfordelingen, farvel perlerne med toluidinblåt-O.
   1. Anbring 0,5 ml perler i 4 ml procesbuffer indeholdende 10% komplet medium.
   2. Tilsæt 500 μl af en 1 g / l toluidinblåt opløsning fremstillet i procesbuffer.
   3. Inkubér i 60 minutter i et konisk rør på en roterende ryster ved 50 omdr./min.
   4. Tilsæt 5 ml procesbuffer indeholdende 10% komplet medium og immedOverfør perlerne og opløsningen i en petriskål og erhverver billeder på et lille forstørrelsesmikroskop eller ved hjælp af et håndholdt digitalkamera. Om nødvendigt skal du sætte Petri-skålen på en lysboks, inden du får billeder med et håndholdt kamera for at forbedre kontrasten og undgå skygger.
   5. Udfør billedanalyse for at kvantificere perlestørrelsesfordelingen som tidligere beskrevet ³² , for eksempel ved hjælp af billedanalyse freeware ³⁶ .
2. For at vurdere celleoverlevelse kvalitativt, pletter cellerne ved hjælp af ethidium homodimer for at identificere døde celler og calcein AM for at identificere levende celler.
   1. Tilsæt 1 volumen perler til 4 volumener procesbuffer indeholdende 10% komplet medium.
   2. Tilsæt passende mængde calcein AM og ethidium homodimer stamopløsninger for at opnå henholdsvis 4 μM og 2 μM koncentrationer. Generer single stain kontroller ved kun at tilføje et af reagenserne til nogle perle prøver.
   3. Inkuber perlerne på is i 20 minutter.
   4. Placer løsningen mellem et dias og dækslip ved hjælp af en afstandsstykker som en o-ring for at undgå komprimering af perlerne.
   5. Fortsæt til fluorescensmikroskopi. Brug single stain kontrollerne til at vurdere fluorescens blødning-gennem. Vælg passende fluorescensfiltre baseret på excitations / emissionsbølgelængderne associeret med calcein AM (494/517 nm) og ethidium homodimer bundet til DNA (528/617 nm).
3. For at genopbygge cellerne fra perlerne til yderligere analyse deklasserer alginatet med citrat eller en anden chelateringsopløsning.
   1. Forbered en nedbrydningsløsning indeholdende 55 mM citrat, 10 mM HEPES og 95 mM NaCl ved pH 7,4.
   2. Bland denne opløsning med 10% medium, og tilsæt derefter 1 ml alginatperler til 9 ml af blandingen.
   3. Degel perlerne på is med 75 omdr./min. Omrøring i 20 minutter.
      BEMÆRK: Cellerne kan nu bruges til analyse eller fjernelse fra den degelerede alginatopløsningenIon ved centrifugering. For eksempel kan celle-levedygtighed efter nedbrydning kvantificeres ved Trypan Blue-farvning. Alternativt kan cellerne centrifugeres og vaskes efterfulgt af mRNA, DNA og / eller proteinprøveudtagning og analyse.

Representative Results

Ved afslutningen af ​​emulgerings- og intern geleringsprocessen bør et vulstvolumen svarende til det oprindelige alginat og celleblandingsvolumen genvindes. Perlerne skal være meget sfæriske med få defekter ( figur 3 ). Perlerne skal være tilstrækkeligt stærke til at modstå pipettering gennem storboringspipetter. Ved høje alginatkoncentrationer kan indkapslede olie- eller luftdråber observeres i perlerne. Dette skyldes sandsynligvis på grund af indfangning af olie i alginatdråber under emulgeringstrinnet (olie / vand / olie-dobbeltemulsion). I disse hænder repræsenterede disse perler en lille fraktion (<5%) af vulstvolumenet, og de fleste af disse perler blev fjernet under aspirering af olien under perleåbindingstrinnet på grund af deres lavere densitet.

Fig. 3> Figur 3 : Repræsentative 5% alginatperler indeholdende indkapslede βTC3-celler opnået ved emulsificering og intern geleringsproces. Fase kontrastbillede af 5% alginatperler indeholdende 5 x ¹⁰⁶ 6C3 celler / ml perler. Klik her for at se en større Version af denne figur.

Størrelsen af ​​de opnåede perler vil ikke være ensartet - dette er et iboende træk ved omrørte emulsioner ( Figur 4A ). Under emulsificering i turbulent strømning virker trykfluktuationer for at forstyrre dråberne ^{37 , 38} , modvirke overfladespændingen og de viskøse kræfter i den dispergerede fase ³⁹ . Viskøse kræfter er ikke ubetydelige, hvis viskositeten af ​​den dispergerede fase er meget højere end den af ​​thE kontinuerlig fase. Under forudsætning af, at den maksimale lokale energidissipationshastighed er proportional med den gennemsnitlige energidissipationsrate i beholderen, kan den maksimale stabile dråbediameter d _max (hvis >> end Kolmogorov-skalaen) beregnes som følger ^{39 , 40 , 41 , 42}

Hvor ρ _c er densiteten af ​​den kontinuerlige fase, er e den gennemsnitlige energidissipationshastighed i karret, σ er grænsefladespændingen mellem de to fluider, μ _d er viskositeten af ​​den dispergerede fase, og C er en proportionalitetskonstant. Når overfladespændingskræfter dominerer over viskøse kræfter, forenkler højre side til C , mens hvis de viskøse kræfter dominerer, forenkles det til:

I omrørte beholdere er energitilførslen under turbulente strømningsskalaer proportional med effektindgangen pr. Enhedsvolumen, dvs. til N _i ³ D _i ² , hvor N _i er omrøringshastigheden og D _i er impellerdiameteren. Derfor, i kombination med ligning 1 og givet en konstant D _i , hvis overfladespændingskræfter dominerer, forventes d _max at være proportional med N _i ^-1,2 ( Figur 4B ), mens den er proportional med N _i ^-0,75, hvis viskøse kræfter i Perler overhovedet som den vigtigste retentive kraft. Figur 4B og 4C antyder, at grænseffekter bestemmer dRopletstørrelse for lave alginatkoncentrationer, mens viskøse kræfter bliver mere dominerende ved højere alginatkoncentration ( fx 5% for alginat nr. 3 beskrevet i materialetabellen). Da det kan være upraktisk at bestemme d _max eksperimentelt, er høje kvantile værdier ( fx 95 ^th kvantilet) af diameteren eller gennemsnitsintervallets middeldiameter ( d ₃₂ ) blevet anvendt i stedet, da de i almindelighed er proportional med d _max ⁴³ .

Før indkapsling af celler anbefales det at generere en kurve af d ₃₂ som en funktion af N _i ( Figur 4B ). Denne kurve hjælper med at vælge den passende N _{i for} at opnå en ønsket gennemsnitlig perle størrelse. En ny standardkurve vil sandsynligvis også være nødvendig for forskellige partier af olie eller alginat, eller hvis alginatkoncentrationenTration er modificeret. Afhængigt af beholdergeometrien og alginatkoncentrationerne bør der opnås en relativt bred vifte af gennemsnitlige perlediametre. For eksempel kan d32-værdier mellem 200 μm og> 1 mm opnås ved anvendelse af 2% ( figur 2C i Hoesli et al. ³² ) til 5% alginat ( figur 4 ) under anvendelse af den ovenfor beskrevne protokol.

Figur 4 : Perlestørrelsesfordeling. ( A ) Toluidin blå-O farvede 5% alginatperler. ( B ) _d32 som en funktion af omrøringshastigheden ( NI ) for 1,5% og 5% alginatperler under anvendelse af en 50:50 blanding af alginater nr. 1 og nr. 2 (se tabel over materialer). Et enkelt punkt vises for 5% algiNate perler. ( C ) _d32 som en funktion af N _i for 2% og 5% alginat nr. 3 (se tabel over materialer). Fejlstængerne repræsenterer standardafvigelsen for perleformater i en prøve (N> 150 perler). Klik her for at se en større version af denne figur.

Celleoverlevelsen fra emulgerings- og intern geleringsprocessen afhænger hovedsageligt af omfanget og varigheden af ​​pH-faldet, der opleves af cellerne. Ved anvendelse af processen beskrevet i denne video blev 76 ± 2% βTC3 celleoverlevelse målt ³¹ . Ved indkapsling af dispergerede celler ved 10 ⁵ celler / ml alginat til 10 ⁷ celler / ml alginat-sømningsdensiteter, bør alle perler indeholde celler. Når indkapsling af celleklynger, såsom pankreasceller, kan en delmængde af perler forventes at være empty. Figur 5 viser typiske levende celle- / dødecellefarvningsresultater opnået under anvendelse af denne proces. Højere celleoverlevelse kan opnås ved at øge procesbufferkapaciteten og ved at reducere varigheden af ​​forsuringstrinnet. For eksempel blev 90 ± 2% MIN6-celleoverlevelse opnået ved anvendelse af 60 mM MOPS (3- (N-morpholino) propansulfonsyre) som procesbufferen og ved at reducere den samlede procestid til 4 minutter ³² . Imidlertid blev de dannede perler signifikant stærkere med 10 mM HEPES-procesbufferen end med 60 mM MOPS-procesbufferen på grund af de forøgede mængder Ca ²⁺ frigivet ved lavere pH ³¹ . Både den korte MOPS-proces og den længere HEPES-proces bør generere perler, der er tilstrækkeligt stabile til> 2 uger in vitro- kultur eller transplantation. Perler kan dog svulme eller degel udelukkende i opløsninger med lavt calcium eller med høje chelatorkoncentrationer (for eksempel, Calciumfri phosphatpufret saltopløsning).

For indkapslede MIN6-celler dyrket in vitro dannes synlige celleaggregater efter ~ 5-7 dage in vitro immobiliseret celleudvidelse og ~ 150 μm diameter sfæroider kan høstes efter 2 uger. Væksthastigheden for alginat-immobiliserede celler forventes at være lavere end i ikke-immobiliserede kulturer, især for geler med højere alginatkoncentration eller højere guluronsyreindhold.

Figur 5 : Indkapslede celler umiddelbart efter processen. ( A ) Levende celle (grøn, calcein AM) og død celle (rød, ethidium homodimer) farvning af indkapslede celler. ( B ) Fase kontrastbillede af samme perle. MIN6-cellerne blev indkapslet i 2%Alginatperler ved anvendelse af 12 min emulgeringen, 8 min forsuring og en 10 mM HEPES buffer som beskrevet i denne protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Forskellige trin (afbildet i figur 2 ) under den interne geleringsreaktion kan begrænse den samlede kinetik. For kalciumcarbonatkorn større end ~ 2,5 μm har hastigheden af ​​carbonatopløsning vist sig at være hastighedsbegrænsende ^{26 , 44} . Syringstrinnet, der fører til intern calciumfrigivelse, har også vist sig at være den kritiske procesvariabel, der påvirker celleoverlevelse ³² . De betingelser, der fører til intern gelering er derfor afgørende både for perle kvalitet samt celle overlevelse. Afhængig af den endelige ansøgning for perlerne kan forskellige optimale procesbetingelser vælges. For eksempel kan et højere pH-fald ( f.eks. Ved anvendelse af 10 mM HEPES til buffering af alginatopløsningen) være ønskeligt til transplantationsapplikationer, hvor perlernes langsigtede stabilitet er afgørende. På den anden side er et lavere pH-fald ( f.eks. Ved anvendelse af 60 mM MOPS til buffeR alginatopløsningen) kan foretrækkes til in vitro applikationer.

Ud over at justere niveauet og varigheden af ​​forsuring kan andre procesændringer overvejes. For eksempel kan andre omrørte beholderkonfigurationer, alginatkoncentrationer, procesbuffere, organiske faser og forsurende midler anvendes. Som diskuteret tidligere kan den gennemsnitlige vulststørrelse let justeres ved at ændre omrøringshastigheden under emulgeringstrinnet. Desuden kan længere emulgeringstider føre til mindre perle størrelser, men kan forårsage nedsat celle levedygtighed. Publikationerne fra Poncelet et al. ^{25 , 26 , 45} og Hoesli et al. ^{31 , 32} har testet og diskuteret nogle af disse muligheder.

Små ændringer i protokollen beskrevet ovenfor kan have en dybtgående indvirkning påPerle generation, perle kvalitet og celle overlevelse. Tabel 1 indeholder en fejlfindingsvejledning for at forstå og løse problemer, der kan opstå.

Problem	Typisk årsag	Foreslåede løsninger
Hjulet holder op med at rotere under alginat- eller syreolietilskuddet	Magnetfeltet er utilstrækkeligt til passende blanding, eller pumpehjulets aksel er forskydet	Sørg for, at spinnerflasken er centreret på magnetpladen og tapet på pladen i en optimal position inden tilsætning af alginatblandingen. Test meget høje omrøringshastigheder og reduceres derefter til den ønskede omrøringshastighed forud for tilsætning af alginatblandingen.
		Sørg for, at pumpeakslen er godt justeret og stabil. Til BelLino spinner flasker, sørg for at pumpehjulet holdes fast på plads med bolte på begge sider af spinnerflaskedækslet. Sørg for, at pumpehjulets bevægelse er begrænset til den radiale retning (pumpehjulet skal ikke vride på akslen).
Ingen perler opnået	Alginatet blev ukorrekt emulgeret	Sørg for, at alginatmikrodråber er synlige under emulgeringen. Hvis ikke, skal du kontrollere, at oliefasetætheden og beholdergeometrien 23 svarer til dem, der er beskrevet i denne protokol. En tæt oliefase eller beholdergeometri, der ikke giver tilstrækkelig lokal energiudledning, muliggør ikke korrekt alginatemulgering.
Ingen perler opnået	Den interne gelering forekom ikke	En almindelig fejl er ufuldstændig opløsning af eddikesyren i oliefasen. Sørg for, at den sure olieblanding er vortexet tilstrækkeligt, og der ses ikke eddikesyre vedBunden af ​​røret.
		Hvis pumpehjulet ikke når olien, kan der tilsættes mere olie før tilsætning af alginatet. Imidlertid bør mængden af ​​eddikesyre justeres i overensstemmelse med følgende ligning: Hvor 1 er forholdet mellem olie og vandfase forud for modifikationer (fx 0,525 for 10,5 ml alginat i 10 ml olie + 10 ml sur olie) 2 er forholdet mellem olie og vandfase efter modifikationer af protokollen, og Dow er eddikesyrefordelingskoefficienten mellem de to faser. Denne fordelingskoefficient kan måles eksperimentelt eller tilnærmes af værdier taget fra litteraturen. For eksempel er fordelingskoefficienten for eddikesyre mellem heptan og vand 46 0,011.
Ingen perleS, eller perler er mekanisk ustabile	Alginatopløsningen med nulskær viskositet er under 0,004 Pa · s eller over 112 Pa · s	På grund af den variable batch-til-batch variabilitet af alginatpartier anbefales det at måle viskositeten af ​​forskellige koncentrationer af alginatopløsninger. Kombinationen af ​​en højviskositetsbatch med en lavviskositetsbatch kan kræves for at nå en målviskositet. For den her anvendte 5% LVM- og MVG-blanding var nulskæringsviskositeten 3,3 Pa · s. Det skal bemærkes, at alginater med for korte guluronsyrebloklængder eller korte samlede kædelængder muligvis ikke tillader geldannelse.
Perlerne er for store eller for små	Omrøringshastigheden under emulgeringen er for lav eller for høj til den anvendte alginatkoncentration eller viskositet	Øget turbulens ved at øge omrøringshastigheden eller tilføje baffler vil reducere perle størrelsen. Alginatkoncentrationen, tempEratur, fartøjets og impeller geometrien vil alle påvirke den opnåede perle størrelse.
Mange brudte perler overholdes	Hård perlehåndtering, beskadigelse under det indre geleringstrin eller utilstrækkelig perlstyrke.	Mekanisk beskadigelse af perlerne kan føre til perlebrud, når intern gelering er indledt. Reducer omrøringshastigheden umiddelbart før forsuringstrinnet og sørg for, at perlerne håndteres forsigtigt ved at bruge 25 ml pipetter eller 1000 μL pipetter med udskårne tips. Hvis der observeres beskadigede perler selv med omhyggelig håndtering og reduceret omrøring under forsuring, kan perlestyrken være utilstrækkelig. Dette kan skyldes utilstrækkelig guluronsyreindhold eller ufuldstændig gelering (fx utilstrækkelig forsuring).
Lavcelle levedygtighed	Indledende proces pH for høj eller endelig pH for lav	Overlevelse af mammalcelleprocesser kan øges ved at begrænse pH-faldet og forsuringstiden
Lavcelle levedygtighed i de mindre perler	Utilstrækkelig alginatopløsningsbufferingskapacitet	Et større pH-fald forventes i de mindre perler end i de større perler på grund af det større overflade / volumenforhold mellem disse perler. Eftersom den tilsatte eddikesyre til emulsionen er begrænset, forudses højere ättiksyrekoncentrationer i mindre perler for den samme CaCO3-koncentration. Forøgelse af alginatopløsningsbufferkapaciteten (fx ved anvendelse af 60 mM MOPS i stedet for 10 mM HEPES) kan øge celleoverlevelse i de mindre perler 32 . Små perler med højtcelletab kan fjernes selektivt ved filtrering eller sedimentering uden at pådrage store volumetriske tab.
jegEn fuldstændig CaCO3 opløsning	Utilstrækkelig forsuring eller forsuringstid. Bemærk, at dette problem måske ikke er problematisk, hvis perle stabilitet er tilstrækkelig.	Ufuldstændig CaCO3 opløsning er blevet observeret i de større perler efter denne protokol 32 . Omfanget af CaCO 3 opløsning kan variere afhængigt af CaCO 3 kornstørrelsen, pH-faldet under processen, varigheden af ​​pH-faldet samt den anvendte alginatkoncentration. Dette problem betragtes ikke som problematisk, så længe perlen mekanisk stabilitet er tilstrækkelig til den ønskede anvendelse. For at øge kuglens tværbinding skal du sørge for, at CaCO 3- kornet er tilstrækkeligt lille (~ 2,5 μm). Sonicating CaCO 3 suspensionen kan hjælpe med at forstyrre aggregerede korn 26 . Ved meget lave eller høje alginatkoncentrationer kan der kræves justeringer i CaCO3-koncentrationen. Endelig chelatorer eller løsninger med laveNiveauer af divalente ioner vil føre til det gradvise tab af Ca 2+ i gelen. Hvis der observeres gradvis tab af perle mekanisk stabilitet, skal du kontrollere, at perlopbevaring eller kulturbuffer indeholder> 2 mM Ca 2+ .

Tabel 1: Fejlfinding guide. Liste over problemer, sandsynlige årsager og potentielle løsninger.

Potentielle begrænsninger af emulgeringen og den interne geleringsproces til in vitro- kultur af pattedyrceller og transplantationsanvendelser indbefatter: (1) nødvendigheden af ​​forbigående udsættelse for lav pH, (2) behovet for at fjerne resterende olie, (3) polydisperse vulststørrelsen Fordeling, (4) den potentielle forskydningsspænding under dannelse af alginatdråber og (5) den højere porøsitet af internt gelerede perler sammenlignet med eksternt gelerede perler ⁴⁷ .

Højcelleoverlevelse og -funktion af MIN6 og pTC3 er blevet opnåetEfter procesoptimering ³² . Denne proces kan dog ikke være egnet til mere pH-følsomme celler. Den fuldstændige eliminering af olie fra perlerne kan også være udfordrende, og FDA-godkendte olietyper kræves til eventuelle kliniske anvendelser. Polydisperse perle størrelsesfordelingen kan også være noget problematisk for immunoisoleringsapplikationer, hvor fuldstændig celleindkapsling og langsigtet celleoverlevelse er ønskelige. Mens små perlestørrelser kan føre til cellefremspring ⁴⁸ , kan store perler hindre næringsdiffusion og / eller cellefunktion ^{35 , 49} . På den anden side giver emulgeringsprocessen en interessant mulighed for at undersøge effekten af ​​perlestørrelse på celleoverlevelse efter transplantation ved at generere både små og store perler i en enkelt proces. Den gennemsnitlige perle størrelse kan let justeres ved at modificere omrøringshastigheden durinG emulgeringstrinnet ( figur 4 ). Endelig kan den højere porøsitet af internt gelerede perler også være skadelig for immunoisolering, hvor molekyler såsom antistoffer og cytokiner bør udelukkes fra perlerne. Imidlertid tillader emulgeringsprocessen også beadgenerering fra meget koncentrerede alginatopløsninger, hvorved alginatperlens porestørrelse reduceres.

Emulgeringen og den interne geleringsproces er et interessant alternativ til dysebaserede indkapslere til laboratorier, der ønsker at opskalere celleindkapsling eller mangler adgang til en indkapslingsanordning. Denne proces er en robust og enkel metode til at immobilisere celler i alginatperler ved anvendelse af meget fortyndede eller meget koncentrerede alginatopløsninger. Nogle af de efterfølgende eksperimenter, der kan udføres med de immobiliserede celler, er at bestemme alginatmatrixens virkning på beslutninger om cellernes skæbne, eller for at bestemme i hvilket omfang perlerne tilvejebringer en barriere mellem transplantatD-celler og værtsimmunsystemet. Emulgeringen og den interne geleringsmetode tilvejebringer en ny fremgangsmåde til indkapsling af primære øer i store partier. Metoden tillader også celleindkapsling i stærkt koncentrerede alginatperler med nedsat porøsitet og dermed reduceret antistofadgang til de indkapslede celler. Emulgeringen og den interne geleringsfremgangsmåde tilvejebringer derfor et nyt middel til at frembringe klinisk relevante mængder af indkapslede terapeutiske celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).