Summary
Questo articolo descrive un test comportamentale che utilizza unità di accoppiamento maschio in Drosophila melanogaste R per studiare la motivazione. Utilizzando questo metodo, i ricercatori possono utilizzare mosca avanzate tecniche neurogenetiche per scoprire i meccanismi genetici, molecolari e cellulari che sono alla base questa motivazione.
Abstract
Nonostante decenni di ricerca, le basi neuronali e molecolari degli stati motivazionali rimangono misteriose. Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo, riduzionista, e il sistema scalabile per un'indagine approfondita della motivazione utilizzando l'unità di accoppiamento del maschio Drosophila melanogaster (Drosophila), i metodi per la quale abbiamo dettaglio qui. Il paradigma comportamentale centra sulla constatazione che l'unità di accoppiamento maschio diminuisce la fertilità a fianco nel corso di accoppiamenti ripetuti e recupera oltre ~ 3 d. In questo sistema, gli strumenti potenti neurogenetici disponibili nei fly convergono con l'accessibilità genetica e schema elettrico putativo disponibile per comportamento sessuale. Questa convergenza consente un rapido isolamento e l'interrogatorio di piccole popolazioni neuronali con specifiche funzioni motivazionali. Qui si dettaglio la progettazione e l'esecuzione del test sazietà che viene utilizzato per misurare e modificare la motivazione di corteggiamento nel moscerino maschio. l'utilizzo di questotest, abbiamo anche dimostrato che rasoterra accoppiamento maschio può essere superata attraverso la stimolazione dei neuroni dopaminergici. Il saggio sazietà è semplice, economico e robusto per le influenze di background genetico. Ci aspettiamo che il saggio di sazietà per generare molte nuove intuizioni nella neurobiologia degli stati motivazionali.
Introduction
Il lavoro in Drosophila ha fornito una visione profonda e pionieristico in molti fenomeni biologici, compresa la natura del gene 1, i principi dello sviluppo embrionale 2, ritmi circadiani 3, e lo sviluppo e il cablaggio del sistema nervoso 4, 5, 6. La motivazione resta molto meno ben compreso che questi fenomeni, forse a causa delle limitazioni sui sistemi che sono stati studiati finora. La motivazione e la mosca è studiato principalmente nel contesto della fame, che presenta molte sfide a causa della loro irrisorio assunzione di cibo per attacco di alimentazione e di esoscheletro che esclude i segni evidenti di deposizione di grasso. Di conseguenza, vi è la necessità di ampliare i sistemi utilizzati per studiare motivazione in volo.
Descriviamo un quadro comportamentale per lo studio di azionamento accoppiamento inDrosophila. Questo sistema sfrutta gli strumenti neurogenetic in volo e l'accessibilità 7, 8, 9, 10, 11, 12 e la connettoma putativo del suo circuito dimorfismo sessuale 8, 13. Inoltre, gran parte della innata 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e ho imparato 22, 23, 24 circuiti senso-motorio che controlla il corteggiamento è stato elaborato in dettaglio, offrendo una rara opportunitàper individuare il nodo circuitale esatta su cui incide motivazione. Abbiamo recentemente riportato che, nel volo, come negli esseri umani, i livelli di dopamina sono fondamentali per unità di accoppiamento 25, 26, 27. Abbiamo ottenuto l'accesso genetica al relativo dettagliata a livello di circuito molecular- e che producono la dopamina e la ricezione di neuroni al volo, facilitando l'analisi di questo fenomeno conservato utilizzando i saggi che descriviamo qui 25.
Aggiungiamo ai test comportamentali nei Zhang et al. 25 una nuova arena comportamentale piatta che permette di video di punteggio, che noi chiamiamo un test di sazietà a 2 dimensioni (2-D), un importante miglioramento rispetto ai metodi precedenti. Di conseguenza, il nuovo saggio è più scalabile e quantificabile e quindi più adatto per schermi genetiche di geni e neuroni coinvolti nella motivazione. Usiamo questo nuovo test, insieme a saggi di corteggiamento e neurogemanipolazioni tiche, per dimostrare come misurare e modificare unità di accoppiamento in volo.
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Protocol
NOTA: Questo protocollo descrive la preparazione (sezioni 1 - 3), esecuzione (sezione 4), e le analisi (sezione 4) di saggi sazietà 2-D. Quindi, utilizzando la stimolazione dopaminergica come esempio, la sezione 5 mostra come combinare la stimolazione thermogenetic con saggi sazietà 2-D per indurre ipersessualità. Sezione 6 descrive 3 modi per verificare i risultati dei dosaggi sazietà 2-D. Infine, la sezione 7 mostra come misurare il recupero delle unità di accoppiamento nei moscerini maschi.
1. Realizzazione 8- e 32-camera Arenas comportamentali
NOTA: Ogni ambito comportamentale costituita da più strati di fogli di plastica tagliati al laser tenuti insieme da viti esagonali e dadi ad alette a ciascuno dei quattro angoli (Figura 1A).
- Realizzare gli strati della scena. Realizzare ogni strato con un cutter laser per tagliare fogli di plastica acrilica alla forma appropriata (vedere Figura 1B, 1C per prodotti).
NOTA: Molte ricerche Institutions hanno taglio laser nelle loro officine meccaniche o spazi creatore. Se l'istituzione ha accesso ad un taglio laser, continuare con i seguenti passaggi. In caso contrario, seguire le istruzioni nella fase 1.2 invece.- Per ogni strato, aprire il modello di progettazione nel software del taglio laser.
NOTA: I disegni possono essere trovati nei file PDF in modo appropriato nome (ad esempio, 8-Camera Arena - Layer 2 - Doors.pdf) in materiale supplementare 1. Questo file contiene anche le annotazioni per il tipo di plastica da utilizzare (ad esempio, 1 / 8 pollici (vale a dire 3,175 millimetri) acrilico trasparente). L'esatto spessore di ciascuno strato non è critica. Il requisito principale è quello di permettere 0,12 pollici (3 mm) o più di spazio verticale libero nelle camere. - Regolare le impostazioni laser (potenza, fuoco, ecc) per il tipo e lo spessore di plastica da utilizzare. Plastica posto nel letto laser cutter ed eseguire il taglio laser.
NOTA: Queste impostazioni variano ampiamente basato sulla cutte laserr modello e la forza della sua laser. Trova impostazioni appropriate basate su esperienze passate o effettuando tagli di prova su plastica di scarto. Le incisioni esagonali profonde sono inclusi nel disegno di recesso le teste delle viti esagono. Questa funzione consente una sola mano serraggio dei dadi in e permette arene di riposare piatta sulla panca (senza sporgere testa delle viti). Tuttavia, rendendo incisioni profonde è spesso difficile da realizzare, e che richiede tempo, con un cutter laser. Questo passaggio è facoltativo e può essere saltato senza influenzare i risultati comportamentali. - Quando si taglia il telaio della porta (Layer 2, Figura 1A), utilizzare anche le impostazioni appropriate laser per incidere i numeri da camera incluse nel disegno (come in Figura 1B, 1C).
- Per ogni strato, aprire il modello di progettazione nel software del taglio laser.
- Un ordine con un costruttore taglio laser in linea. Caricare tutti i file di progetto in formato PDF per l'arena 8 e / o 32-camera e specificare il tipo di materiale (ad esempio, 1/8 di pollice (vale a dire 3,175 millimetri) CLEAR acrilico) sulla base delle annotazioni nei file. I risultati appariranno come nelle figure 1B (Arena 8-camera) e 1C (Arena 32-camera).
- Montare arene usando quattro viti a testa esagonale e quattro dadi in per allineare e tenere insieme gli strati di plastica (Figura 1A). Le arene appariranno come in figura 1D, 1E (8-camera) e la Figura 1F, 1G (32-camera).
NOTA: La parete cibo (Layer 4 in Figura 1A) è usata solo per dosaggi sazietà 2-D e viene omesso in arene 32 a camera, che vengono utilizzati in saggi corteggiamento.
2. Preparazione del cibo per 2-D sazietà Assay
NOTA: Perché un saggio sazietà 2-D estende 4,5 h, volare cibo viene utilizzato in campo per fornire nutrimento e acqua. Questo protocollo utilizza, ma non è limitato a, la farina di mais convenzionale-agar cibo volare.
- Parzialmente assemblare la sazietà Arena 2-D (8-camera) con i livelli 3-6(si veda la Figura 1A per le assegnazioni di livello) e serrare con i dadi ad alette e le viti esagonali.
- Mettete il cibo fresco volare in una bottiglia pulita, al microonde. Aggiungere acqua quanto basta per coprire la superficie inferiore della bottiglia (Figura 2A).
- cibo a microonde in alto per 30 - 45 s. Controllare il progresso e mescolare ogni 15 s fino al fuso (Figura 2B). ATTENZIONE! Vola alimentare bolle facilmente sopra.
- Utilizzare un smussato 1.000 microlitri pipetta punta (Figura 2C) per trasferire lentamente ~ 1 ml fuso cibo in ciascuna camera (Figura 2D).
- Lasciare cibo per resolidify a 4 ° C per ~ 10 minuti (Figura 2E) prima del montaggio completamente l'arena (Figura 2F).
- Utilizzare l'arena completata per esperimenti (vedi sezione 4) o conservare a 4 ° C.
- Conservare il cibo avanzato a 4 ° C e il riutilizzo.
3. Preparazione Virgin femmine per comportamentali Assays
NOTA: 2-D saggi di sazietà utilizzano un gran numero di mosche femmine vergini (~ 120 - 160 per un'arena comportamentale completo) che sono difficili da raccogliere utilizzando metodi standard. Questa sezione descrive un approccio alternativo utilizzando il transgene hs-HID sul cromosoma Y 28, che è stato usato con successo in saggi corteggiamento 25, 29. Il magazzino utilizzato per generare femmine vergini bianchi dagli occhi ha il genotipo w1118 (X) / HS-HID (Y); + / +; + / + (Bloomington magazzino Numero 24638).
- Flip vola in una nuova bottiglia, una volta 20 - 50% delle pupe hanno eclosed (vedi Figura 3A per esempio) e ci sono abbastanza maschi (5 - 10) per propagare il brodo.
- Heat Shock bottiglia originale in un bagno di acqua calda a 37 ° C per 1 h per attivare sufficientemente hs-HID uccidere maschi (Figura 3B). Dopo lo shock termico, solo femmine ECLOSE da queste bottiglie e così rimarrà vergine fino alsaggi.
NOTA: Assicurarsi che tutti i lati della bottiglia sono riscaldati in modo uniforme (vedi Figura 3A per linea di galleggiamento). Estendere questa volta per un massimo di 2 ore se 1 h non è sufficiente per tutti i maschi eutanasia. - Isolare le femmine raccolti per almeno 3 d prima di esperimenti per garantire che essi siano abbastanza vecchio per essere sessualmente recettiva 25, 29.
NOTA: i maschi del cromosoma Y-less di tanto in tanto nascono da questo stock. Questi maschi hanno gli occhi bianchi e non sono influenzati dal calore shock, perché non contengono il transgene hs-HID. Non possono produrre spermatozoi e pertanto non può diminuire ricettività nelle femmine 30, 31.
4. Esecuzione e segnando 2-D sazietà saggi
NOTA: È importante controllare l'età del maschio vola mentre al disco di accoppiamento con l'età. Questo protocollo utilizza i maschi che sono 3 - 4 d vecchio 25
- Impostare l'incubatore alla temperatura desiderata (ad esempio, 23 ° C per il campione, esperimenti RT) e umidità (> 30%). Per incubatrici senza controllo dell'umidità, lasciando una tazza di acqua in incubatrice è sufficiente.
- Inserire un 2-D assay sazietà scena in incubatrice per ~ 30 minuti per equilibrare la temperatura e per evitare la condensazione nelle camere durante il corso dell'esperimento. Le porte rotanti devono essere in posizione aperta.
- Utilizzare una mosca aspiratore 32 per aspirare 15 - 20 femmine vergini in ciascuna camera dell'arena (figura 4).
NOTA: È importante che le femmine e maschi non vengono anestetizzati lo stesso giorno come il test. Nella nostra esperienza, ciò potrebbe avere un impatto ricettività femminile e comportamento di accoppiamento maschio. - Aspirare 1 maschio in ciascuna camera.
- Posizionare l'arena caricato in incubatrice sotto una videocamera consumer standard (Figura 5) e il film per 4.5 h.
- Punteggio video notando quando ogni Male vola inizia e finisce ogni accoppiamento (cioè copulazione). Questo passaggio potrebbe richiedere molto tempo in un primo momento. Con la pratica, si possono segnare i video a velocità 5x o superiore.
NOTA: Dal momento che le mosche si accoppiano per ~ 20 min a ~ 23 ° C (durata inferiore a temperature più elevate) 29, si può sfogliare i primi 15 minuti di ogni accoppiamento. - Dopo l'accesso tutti i tempi di accoppiamento, sommare il numero di accoppiamenti per ogni volo (vedi risultati rappresentativi).
- Utilizzare il codice fornito per generare un etogramma. Vedere supplementare Materiale 2 per il codice, le istruzioni e dati di esempio.
- Usare CO 2 o la temperatura fredda per anestetizzare le mosche prima di rimuoverli.
5. Utilizzo di manipolazione thermogenetic per invertire sazietà in 2-D sazietà Assays
NOTA: Questo protocollo test se la stimolazione thermogenetic di una popolazione neuronale definito può superare sazietà. Il fli sperimentalees esprimere il canale cationico termosensibile TRPA1 in popolazioni di neuroni definiti (UAS-TRPA1). I passaggi riportati di seguito valgono per la stimolazione dei neuroni dopaminergici (TH-GAL4), che hanno dimostrato di promuovere unità di accoppiamento 25. Questi passaggi possono essere utilizzati in combinazione con altri piloti neuronali per scoprire altre popolazioni che promuovono unità di accoppiamento.
- Per indurre thermogenetically comportamenti di accoppiamento in linea sazi, aumentare la temperatura nell'incubatrice (ad esempio, da 23 ° C a 28,5 ° C) dopo aver completato un completo 4.5 h 2-D esperimento sazietà.
- Dopo l'incubatore raggiunge la temperatura desiderata, continuare la stimolazione di calore e segnare gli accoppiamenti (es. Copulazioni) dei maschi per 1 ora (vedi Rappresentante dei risultati).
NOTA: La temperatura e la durata della stimolazione può variare a seconda del genotipo per cui è necessario risolvere le condizioni ottimali che impediscono sovrastimolazione dei neuroni pur continuando a produrre un Robust fenotipo.
6. Utilizzando Corteggiamento e Locomotion per verificare sazietà
NOTA: Questa sezione descrive 3 metodi opzionali che possono essere utilizzati per verificare i risultati delle analisi sazietà 2-D. Essi non sono necessari per ogni test.
- Utilizzare saggi di corteggiamento per verificare la sazietà.
- Aspirare un maschio e una femmina vergine in ciascuna delle 32 camere in un'arena corteggiamento.
- Filmare le mosche per ~ 20 minuti utilizzando una videocamera consumer standard.
- Punteggio l'indice di corteggiamento (CI) per quantificare il corteggiamento 25; questa è la frazione di tempo impiegato corteggiamento (canto, in seguito, ecc.) e l'accoppiamento (cioè copulazione) su una finestra 5 min. Questa finestra inizia dalla prima istanza di corteggiamento. Se una mosca maschio non inizia il corteggiamento nei primi 15 minuti, la sua CI è 0. Naïve WT mosche dovrebbero mostrare un CI superiore a 0,9, mentre una mosca completamente sazi dovrebbe avere un CI below 0.2. Altre misure di corteggiamento possono essere considerati 23, 33.
- Segnando il corteggiamento in saggi sazietà 2-D
- Nota la quantità di tempo che una mosca maschio trascorre corteggiare, per un periodo di un saggio sazietà 2-D (per esempio, la prima h). Corteggiamento è definito come il maschio eseguendo qualsiasi fase del rituale (canto, in seguito, etc.). A differenza nella sezione 6.1.3, questo passaggio non include il tempo trascorre il maschio di accoppiamento.
- Dividere il tempo di corteggiamento sopra per il tempo totale il maschio non è stato corrispondente (cioè non copulare) nello stesso periodo di tempo. Ad esempio, se un maschio vola giudice 15 min e compagni per 20 min sul primo h, il rapporto è 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. Il rapporto viene visualizzato come "Frazione di nonmating tempo nel corteggiamento" di Rappresentante dei risultati.
- Utilizzando test di locomozione per valutare esaurimento
- Parzialmente assemblare il 32-Arena da camera con tutte le parti, ma il foglio di contrasto.
- Aspirare un moscerino maschio (mosche femmine) in ciascuna delle 32 camere in un'arena corteggiamento.
- Filmare le mosche per ~ 10 minuti utilizzando una videocamera consumer standard.
- Traccia le mosche con il plugin MTrack2 in ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).
7. Recupero accoppiamento rigido dopo 2-D sazietà Assay
- Eseguire un test sazietà 2-D, come descritto al punto 4, ma aspirare il maschio vola al termine del test.
- Isolare le mosche maschio a 23 ° C per il numero desiderato di giorni.
- Eseguire un test di sazietà 2-D con i maschi recuperati e segnare i loro accoppiamenti (cioè accoppiamenti) per appena 1 ora (vedi Rappresentante dei risultati).
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Representative Results
Per caratterizzare unità di accoppiamento Drosophila, 3 giorni di età, maschi WT Canton-S sono stati testati in un saggio sazietà 2-D. Nel corso del test (4.5 h), i maschi si accoppiano una media di 4,8 ± 0,3 (media ± errore standard della media, SEM) volte. Accoppiamenti iniziano soprattutto nei primi 2 h (78%) (Figura 6A, 6B) e diventano meno frequenti come il saggio progredisce (Figura 6A, 6B). Questa diminuzione non è dovuta alla mancanza di partner di accoppiamento (74% femmine rimangono disaccoppiati durante tutta la seduta) o affaticamento fisico (Figura 6F). Piuttosto, questo effetto è probabilmente spiega con una diminuzione del corteggiamento del maschio durante il test, da 42,6 ± 8,0% (media ± SEM) (1 st h) a 2,0 ± 0,7% (media ± SEM) (ultima ora) di tempo nonmating (Figura 6C). Questo declino nel corteggiamento è visto anche quando i maschi sono testati in saggi di corteggiamento con nuove femmine (Figura 6D, 6E) (figura 6G, 6H). Questi risultati mostrano che l'unità di accoppiamento mantenuto internamente mosche maschio può essere sazi in un saggio sazietà 2-D e può recuperare nel tempo.
Il saggio sazietà 2-D può essere facilmente combinato con Drosophila manipolazioni neurali. Abbiamo recentemente riportato che la stimolazione dei neuroni dopaminergici thermogenetic inverte unità di accoppiamento nel maschio sazi vola 25. Utilizzando saggi sazietà 2-D, troviamo che la stimolazione dopaminergica (TH> TRPA1, 28,5 ° C) alla fine del test sazietà aumentato sia corteggiamento (Figura 7A, 7C, rosso) e rottura (Figura 7A, 7B, rosso). Gli effetti di inversione non vengono osservati con genotipi parentali di controllo (Figura 7a - 7c, nero e grigio). Tutti questi risultati sono coerenti con la recente studio25 e suggeriscono che il test sazietà 2-D, insieme ai saggi ausiliari (corteggiamento e locomozione), può essere utilizzato per analizzare componenti molecolari e neuronali di unità di accoppiamento.
Figura 1. Progettazione e montaggio comportamentali Arenas. Un'arena 8-camera (utilizzato per le analisi sazietà 2-D) è composto da 6 strati tenuti insieme da dadi in e le viti esagonali (A). Un'arena 32-camera (utilizzata per i saggi di corteggiamento) è prodotto in modo simile, ma senza la parete cibo (strato 4). Le parti Arena sono tagliate con un cutter laser e gli strati sono numerati come (B) da 8 a camera e (C) per 32-camera. Le arene 8-camera assemblati sono mostrati in (D) (vista frontale) e (E) (vista laterale con strati numerati). I assemblati arene 32-camera assemblati in modo simile (F, G), ma Layer 4 (parete cibo) viene omesso (G) dal momento che nessun cibo mosca è in campo per le prove di corteggiamento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Preparazione 2-D sazietà Assays con il cibo. Cibo standard Drosophila è collocato in un vaso microonde con acqua (A). Il cibo viene cotto al microonde fino a fuso (B). Un puntale smussata (C, freccia) viene utilizzato per trasferire il cibo per le camere di un'arena comportamentale parzialmente assemblato (D). Il cibo è ri-solidificato a 4 ° C (E) prima dell'arena comportamentale è completamente assemblato (F).pg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Generazione Virgin femmine dalla w1118 (X) / HS-HID (Y) Stock. Fly bottiglie vanno calore scioccato quando il 50 - 80% delle pupe sono uneclosed come indicato dalla loro opacità (A). L'immagine inserto mostra campioni di uneclosed (in alto) e eclosed pupe (in basso) (A). Le bottiglie sono appesantiti e immersi in 37 ° C bagno di acqua calda per 1 h con livello dell'acqua appena sopra il fondo dei tappi per garantire un riscaldamento uniforme (B). Vedere la freccia nera in (A) per galleggiamento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caricamento vola in un comportamento Arena. Delicatamente aspirare e tenere 15 - 20 femmine nell'aspiratore (A). La punta della pipetta viene utilizzato per aprire la porta girevole (B), e le mosche delicatamente rilasciato nella camera (C). Utilizzare l'aspiratore per chiudere lo sportello rotante (D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: esecuzione e la registrazione di un 2-D sazietà Assay. (A) Una videocamera consumer standard (a) viene utilizzato per registrare il dosaggio in un incubatore alla temperatura desiderata. L'incubatore contiene una boccetta d'acqua (b) ed un rilevatore di umidità (c) assicurare illivello di umidità adeguato (> 30%). Il saggio sazietà 2-D preparata viene girato sotto la videocamera (B). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Satiation e ripristino di Fy accoppiamento Drive. In un saggio sazietà 2-D, mosche maschio accoppiano frequentemente durante le prime 2 ore di test (A, B), ma diminuiscono il loro corteggiamento (C) e accoppiamenti (B), il saggio progredisce. La progressiva diminuzione corteggiamento viene mantenuta quando i maschi sono trasferiti ad un saggio di corteggiamento con nuove femmine dopo aver completato un test di sazietà 2-D di 0 h, o 1 ora, o 4,5 h (D, E). Le frecce rosse indicano i maschi che presentano corteggiamento e di accoppiamento comportamenti, mentre arancione arrighe indicano non l'accoppiamento, le mosche non corteggiamento (A, D). Il calo comportamenti sessuali non è un risultato di esaurimento fisico, come i maschi mostrano livelli equivalenti di attività locomotoria prima e dopo il test sazietà 2-D (F). Maschi gradualmente recuperare la loro accoppiamento (G) e livelli di corteggiamento (H) oltre 3 d di isolamento dalle femmine. In questa figura, *** p <0,001, ** p <0.01, ns non significativo per t-test (C, F) e ANOVA con post-test di Tukey (E, G, H). N = 15 - 16 per ciascuna condizione per tutti gli esperimenti. barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: thermogenetic sazietà Inversione a Male vola. Come nel dosaggio sazietà standard di 2-D, maschi mostrano una diminuzione accoppiamenti nel corso dell'esperimento, ma la stimolazione thermogenetic dei neuroni dopaminergici (TH> TRPA1, rosso), ma non nel controllo parentale genotipi (nero e grigio), ripristina accoppiamento unità nei maschi sazi (a). Non accoppiamenti sono segnati quando l'asse X è rotto in (A). Questa inversione di unità di accoppiamento può essere quantificato utilizzando sia i numeri di accoppiamento (B) o di corteggiamento (C). Numeri dell'asse X in (B) e (C) si riferiscono in volta in (A). Colore di sfondo arancione indica la stimolazione thermogenetic (A - C). In questa figura, *** p <0,001, ns non significativo per interazioni tra genotipo e temperatura in ANOVA a due vie con Bonferroni post-test (B, C). N = 8 per ogni genotipo (B, C). Le barre di errore rappresentano SEM..jove.com / files / ftp_upload / 55291 / 55291fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Materiale supplementare 1. Clicca qui per scaricare il file.
Materiale supplementare 2. Clicca qui per scaricare il file.
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Discussion
Stati motivazionali possono essere saziati, mantenuti e recuperati 34. Vi presentiamo un test sazietà 2-D che misura in modo rapido e robusto tutti questi aspetti di accoppiamento auto in tempo reale. Questo test apre la possibilità di utilizzare mosca advanced manipolazioni genetiche per studiare le componenti molecolari e circuitali di un comportamento motivato.
Il test si basa sulla capacità di sazietà del maschio in tribunale con successo e copulare, e di interrompere copulazioni al momento opportuno. Anche se le mosche hyposexual corte inferiore, vola basso-corteggiamento non sono necessariamente hyposexual; essi possono, per esempio, hanno problemi a riconoscere o di verifica delle femmine 35. Per questo motivo, il saggio sazietà è più adatto per il test ipersessualità, un fenotipo che non può essere osservato in maniera affidabile in un saggio di corteggiamento standard in quanto ingenui wild-type maschi mostrano indici di corteggiamento si avvicina 1. Ipersessualità nel sh saggio sazietàould essere considerata relativa all'età del maschio-nella nostra esperienza, i maschi più anziani tendono ad accoppiarsi un po 'più frequentemente che i 3 giorni di età maschi utilizzati qui.
Abbiamo usato stimolazione thermogenetic dei neuroni dopaminergici di esemplificare le manipolazioni neurogenetici che possono essere utilizzati in questo sistema per esaminare i componenti sottostanti motivazione. Inoltre, i ricercatori possono anche utilizzare la stimolazione thermogenetic durante un test di sazietà 2-D e cercare per i maschi ipersessuali che sono più lenti per raggiungere la sazietà. Naturalmente, i saggi di sazietà può anche essere combinato con strumenti di silenziamento neuronali 36, 37, 38, optogenetics mutazioni genetiche 39, 40, 41, RNAi Knockdown 28, 42, 43, 44, ecc
Il saggio sazietà è conveniente e scalabile. Ogni scena può essere prodotto per un valore di materiali ~ 10 dollari statunitensi (più i costi di taglio laser, se presente) e occupa meno spazio di un libro tascabile. Segnando il video è anche un compito relativamente semplice. Un sperimentatore addestrato può segnare un video 4.5 h con 8 maschi vola in ~ 1,5 ore. Per ulteriori high-throughput screening, si può segnare solo l'ultimo 2 ore, quando le mosche normali mostrano livelli molto bassi di unità di accoppiamento. In alternativa, si possono individuare controllare i dosaggi ogni 30 minuti, in modo da catturare la maggior parte dei ~ 20 accoppiamenti min a lungo.
Ci auguriamo che questo sistema sarà ampiamente adattato e contribuirà alla nascita di Drosophila come un potente sistema per svelare i segreti della motivazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K12 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/8 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8589K42 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 3/16 inch clear acrylic | McMaster-Carr | 8560K219 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| 1/32 inch black delrin | McMaster-Carr | 8575K132 | Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs. |
| Hex screws, 1 inch long (50x) | McMaster-Carr | 92314A115 | Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas. |
| Thumb nuts (25x) | McMaster-Carr | 92741A100 | Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr). |
| Camcorder | Canon | Vixia HF R700 | Can be replaced by any consumer comcorder. |
References
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