Summary
우리는 생체 살아있는 생물 발광 및 근적외선 SJL / J 마우스에서 다발성 경화증에 대한 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 시신경염과 뇌염의 이미징 기술을 보여준다.
Abstract
SJL / J 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 재발 - 완화 성 다발성 경화증 (RRMS)의 모델이다. 운동 기능 적자를 설명하는 임상 EAE 점수는 척수의 면역 매개 염증의 기본 판독입니다. 그러나 점수와 체중은 뇌의 염증과 시신경염의 생체 내 평가를 허용하지 않습니다. 후자는 2/3 MS 환자에서 초기 자주 표현된다. 여기서는 생체 촬상 시스템을 이용하여 살아있는 쥐 생물 발광과 EAE는 시신경염을 유발 평가 근적외선 라이브 영상, 뇌 염증 및 혈액 - 뇌 장벽 (BBB) 중단하는 방법을 보여준다. 산화 효소에 의해 활성화 생물 발광 기판은 주로 시신경염 나타났다. 신호는 특정이었고, 임상 점수를 병렬 약물 효과 및 질병 시간 과정의 시각화를 허용했다. vasculatur 내에 남아 페 길화 된 형광 나노 입자장시간 E는 BBB의 무결성을 평가하기 위해 사용되었다. 근적외선 영상은 질병의 피크에서 BBB 누수를 한 것으로 밝혀졌습니다. 신호는 눈 주위 강했다. 매트릭스 메탈 용 근적외선 기판 EAE - 유발 된 염증을 평가하기 위해 사용되었다. 자동 형광 정량 unmixing 스펙트럼을 요구 신호 간섭. 전반적으로, 생물 발광 이미징 EAE 관련 시신경염 약물 효과를 평가하기위한 신뢰성있는 방법이고 신호 특이성 견고성 정량의 용이성 및 비용면에서 근적외선 기술보다 우수 하였다.
Protocol
SJL 1. EAE 유도 / J 마우스
- 마우스
- 11 주 된 여성 SJL / J 마우스를 사용하고이 약 7 일 동안 실험 방으로 길들 할 수 있습니다. 그룹 당 N = 10 마우스를 사용합니다.
- 약물 효과의 평가를 위해 연속적으로 식수 통하거나 3 오일 면역화 후 (N = 그룹당 10)을 출발 음식 펠릿 통해 대조군 약물 위약을 투여. 질병의 피크 동안 우유 또는 3 % 설탕 물에 젖은 콘플레이크와 약물 또는 위약을 관리 할 수 있습니다.
- 면역 물질
- 완전한 프로 인트 보조제 (CFA, 열 사망 결핵균 H37 Ra)가 2 병 (5 μg의 각)와 에멀젼에 EAE 유도 키트 항원으로 구성된 (테오 단백질의 펩티드, PLP139-151, 1 ㎎ / ㎖ 에멀젼)를 사용하여 동결 건조 백일해 독소 (PTX).
- 1X 인산염 완충 식염수에서 PTX (2 μg의 / ㎖) (PBS를 녹이고, 즉, </ EM>에서) 같은 피펫 팁과 제거, 잘 혼합하고, 50 mL의 튜브에 PBS 1 ㎖에 추가하는 각 PTX 튜브에 PBS 1.5 mL를 넣어; 잘 섞다.
- 면제
- 꼬리의 기부에,이 부분의 각 100 μL를 모두 PLP / CFA 피하 주입한다. 상단 뒤쪽이나 목의 피부에있는 면역 반응이 머리와 척수의 영상을 방해하기 때문에, 목에의 뒷면에 삽입하지 마십시오.
- 접종 후 2 시간 및 24 시간의 초 - 당 두번 마우스 복강 PTX (IP) 100 μL, 상기 제 1 주입한다.
- 제어 생쥐 들어 PLP없이 PLP없이 CFA (100 μL의 두 부분) 플러스 PTX 주입.
- 마우스 예방 접종 후 처리
- 쥐에게 하루 7 매일 최대의 무게를 측정 한 다음 매일을 무게.
주 : 마우스 1 잃게 - EAE 동안 체중을 2g. 감소는 EAE의 발병을 표시합니다. - 7 일 협정 매일 임상 증상을 평가운동 기능의 명백한 변화를 0.5 점수 : 표준 점수 시스템에 보내고 (즉, 0 점수 없습니다 꼬리의 말단 마비 1 점수 : 전체 꼬리 마비를 1.5 점수 : 하나 또는 두 뒷다리의 가벼운 마비 2 점수 : 뒷 다리의 심한 마비, 점수 2.5 : 하나의 뒷 다리의 완전 마비; 골 3 : 두 뒷다리의 완전한 마비, 3.5 점수 :. 뒷다리 하나 앞 다리의 마비의 완전 마비는 3.5 이상의 점수에 대한 함께 쥐를 안락사 > 12 시간.
- 쥐에게 하루 7 매일 최대의 무게를 측정 한 다음 매일을 무게.
- EAE 코스와 영상의 시간
- 접종 후 12 - 마우스는 10 일째 주위 발생 점수> 1에 도달하면,이 질병의 발병에 제 1 이미징을 수행한다.
- 삼일 - 초기 증상이 후 1 ~ 2 일에 도달되며, 1 동안 지속됩니다 피크에서 두 번째 영상을 수행합니다.
참고 : 그 후, 쥐가 완전히 7 ~ 10 일 이내에 복구합니다. 간격 동안의 이미지는 여전히 혈관 누수를 표시 할 수 있습니다하지만 염증 지표는 음수가 될 것이다.
2. 발광 생물과 시신경염 및 뇌 염증의 근적외선 영상
- 촬상 시스템의 설치
- 생물 발광 근적외선 신호의 분석을 가능하게하는 장치와 생체 내 영상에 수행한다.
- 모든 이미징 과정에서 2.5 %의 이소 플루 란 마취 - 2에서 쥐를 유지합니다.
- 위치 하나 중간에 가스 공급 장치를 사용하여 장치에서 서로 옆에 두 개의 마우스. 중앙의 상부 척추를 놓습니다.
- 약물 치료 효과의 평가가 쌍을 비교하기 위해, 동시에 두 개의 마우스, 그룹 당 하나를 사용하십시오. 이 생물 발광 이미징을위한 중요합니다.
- 검은 천으로 예방 접종의 사이트를 보호하고 마우스 / 마우스의 정확한 위치를 평가하기 위해 사진과베이스 라인 이미지를 촬영합니다. 모든 이미지를 카메라에 6.5 cm의 거리를두고 B-초점을 사용합니다.
- 주입 및 생물 발광 염증 프로브 이미징
- 생체 내 이미징 시스템 설정을 사용 : 8 비닝 에피 BLI는, 엠가 열려 필터링, 전 필터 블록, FSTOP 1, B = 6.5 cm, 광고 노출 (120)의 초점; 베이스 라인 이미지를 촬영.
- 즉시 사용 가능한 화학 발광 시약 (40 ㎎ / ㎖)의 100 μL의 IP를 주입한다. 주사기를 채우기 전에 잘 섞는다.
- 생물 발광 이미지를 5, 10, 및 주입 후 15 분 캡처. 생물 발광 피크의 시간 경과 동물간에 다르다.
주 : 최대 5 발생합니다 - 주입 후 10 분; 15 분에서 감소는 더 이상 이미지가 필요하지 않습니다 나타냅니다. 때문에 서로 다른 시간의 과정에 약간의 편견을 제거하기 위해 제어 및 치료 그룹의 마우스 쌍을 사용합니다. - 실험에 관련된 설명을 입력합니다. 자동 팝업 대화 상자를 관찰; 이 마우스 변형, 성별, 시점, 프로브 주입, 그룹 등의 시간 등의 정보를 포함한다. 파일 모두 O를 저장북동 폴더; 그들은 시간 태그와 모든 설명을해야합니다.
- BBB 무결성을위한 근적외선 형광 나노 입자의 주입 및 이미징
- B 조 초점 (6.5 cm 거리)에 근적외선 표면 형광 이미징을 사용합니다. 페 길화 된 형광 나노 입자의 여기 / 발광 최대 값은 690분의 675 나노 미터이다. Ex640 / Em700 및 Ex675 / Em720에서 서로 다른 파장, 두 개의 이미지를 캡처; 8 비닝 2의 노출을 사용하고 FSTOP 2.베이스 라인 이미지를 가져 가라.
- 꼬리 정맥을 통해 페 길화 된 형광 적외선 나노 입자의 70 μL 정맥 주사하고 쥐 3 시간과 위의 설정을 사용하여 주사 후 24 시간을 상상한다. 주사기를 채우기 전에 용액을 잘 섞는다.
- 신호의 특이성을 평가하기 위해 필요하다 대조군 마우스에 0.9 % 염화 나트륨 주입한다.
- 주입 및 MMP 활성을위한 근 적외 형광 프로브의 이미징
- 면도를하거나 머리를 털을 뽑다 및 유베이스 라인 이미지를 복용하기 전에 조심스럽게 일일 pper 척추 영역입니다. 피부가 손상되지 않아야합니다.
- B 조 초점 (6.5 cm 거리)에 근적외선 표면 형광 이미징을 사용합니다. MMP를 기동 프로브의 여기 / 발광 최대 값은 700분의 680 나노 미터이다. Ex640 / Em700 및 Ex675 / Em720에서 서로 다른 파장, 두 개의 이미지를 캡처; 8 비닝 1의 노출을 사용하고 FSTOP 2.베이스 라인 이미지를 가져 가라.
- 이 마우스 (10)에 충분하게되도록 즉시 사용 가능한 용액 (1X PBS 20을 nmol / 1.5 mL)을 1.5 ㎖의 튜브에 200 μL의 PBS 1X에 추가; 주사기를 채우기 전에 잘 섞는다.
참고 : 제공된 볼륨이 약간의 볼륨이 주사기 충전 및 주입시 손실을 고려하지 않습니다. - 촬상 전에 꼬리 정맥을 통해 24 시간 프로브 IV 150 μL를 주입한다. 신호의 특성을 평가하는 경우에만 대조군으로 PBS를 주입한다.
- 주사 후 24 시간에서, 적어도 2 개의 파장, Ex640 / Em700 및 예 675 / E에 에피 FL 이미지를 가지고m720은 설정 (8 및 FSTOP 2 비닝 1의 노출, 초점 B) 위 설명했다.
주의 : 2 개의 파장의 사용이 비특이적 신호를 감산하여 스펙트럼 unmixing 허용한다.
3. 이미지 분석
- 생물 발광 분석 (BLI)
- 를 열 수있는 소프트웨어를 두 번 클릭합니다.
- 상단 메뉴 바에서 실험의 폴더의 디렉토리로 이동을 선택, 파일 브라우저 아이콘을 클릭; 이 테이블에있는 폴더의 모든 파일을 엽니 다.
- 실험에 관련된 설명을 표시하는 열을 구성합니다.
- 품질 관리의 경우, EAE 신호의 특이성을 확인 EAE 및 / 또는 순진한 마우스의 증상없이 비 응답자 마우스의 파일을 더블 클릭합니다.
참고 : 순진 마우스와 비 응답자 마우스에서 최소한의 신호에는 신호가 없어야합니다.- 프로의 주입하기 전에 기본 이미지를 확인신호의 특이성을 추가 대조군으로서 각 마우스 일; 그것은 부정적인해야합니다.
- 이미지를 선택하려면 첫 번째 EAE 마우스의 첫 번째 파일을 더블 클릭하고 생물 발광 강도 (LUT 바 범위) 및 현지화를 확인합니다. 모든 이미지를 하나씩 확인합니다. 각 마우스의 낮은 강도로 파일을 닫습니다 (즉, 각 마우스 2 3 중 이미지를 유지).
- 이미지 조정 및 수출
- 정량화 할 수있는 첫 번째 파일을 두 번 클릭합니다. 새 창 팝 업을 준수하십시오. "옵션"(상위 메뉴)에서 각 이미지에 표시 할 라벨을 사용자 정의 할 수 있습니다.
- 오른쪽 도구 팔레트에서 이동 "이미지 조정." 기본적으로 최소 및 최대 강도는 "자동"으로 설정하고 무지개 사색에 표시됩니다. 필요한 경우 설정을 변경하려면 "사용 설명서"를 선택합니다.
참고 : 예를 들어, 모든 내 보낸 이미지가 동일한 LUT 바 (동일 최소값과 최대 값)을 할 수 있습니다 쉽게 비교할 수 있습니다.최소값과 최대 값의 조정은 양적 결과에 영향을주지 않습니다. - 이미지 내보내기를 선택 PNG, 디렉토리 및 이미지 이름을 클릭
- 관심 지역의 정량 (ROI)
- 도구 팔레트에서 "ROI"도구로 이동합니다. 투자 수익 (ROI) 방법 (원형, 사각형, 자동차, 또는 자유 손)와 로아의 수를 선택합니다. ROI를 창 이미지 창 팝업 관찰한다.
- 마우스를 사용하여, 크기와 위치를 조정한다. 자동 ROI 툴을 사용하는 경우 모든 이미지에 대해 동일한 투자 수익 (ROI) 임계 값을 사용합니다. ROI의 크기와 위치를 수동으로 (예를 들어, 원형의 ROI) 정의 된 경우 모든 이미지에 대해 동일한 영역을 사용합니다.
- RO.I. 새 창 팝업을 위로 관찰 측정 "을 클릭합니다. 열을 사용자 정의 (예를 들어, 파일 이름, 동물 번호, 그룹, 실험, 면적, 총 수, 평균 횟수, SD 수, 최소 및 최대 카운트, 면적, 시간 포인트, 프로브 주입 등)의 시간. 사용자 정의 된 설정을 저장합니다. 때 다시ADY 모든 (Ctrl + A)를 선택하고 복사하여 스프레드 시트에 표를 붙여 넣습니다.
- 장소에 ROI를 가진 PNG로 이미지를 내 보냅니다. 저장 한 이미지 파일을 닫습니다.
- 정량하는 데 필요한 모든 이미지 파일 -이 절차를 반복합니다 (3.1.7 3.1.6 단계). 스프레드 시트에 모든 ROI의 정량화를 복사합니다.
참고 : 여기에, 결과 등 그룹, 시점, 정렬 할 수 있습니다 통계적으로 분석 하였다. 통계 분석에 대한 ROI를에 생물 발광 신호의 총 수를 사용합니다.
- 형광 나노 입자의 근적외선 (NIR) 분석
- 소프트웨어의 컨트롤을 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다.
참고 :이 양적 결과에 영향을주지 않습니다. - 시각 신호의 특이성을 평가하기 위해 예 / 엠 720분의 675 및 예 / 엠 700분의 640에서 촬영 한 이미지를 비교.
- 정량 분석에 대한 예 / 엠 720분의 675에서 촬영 한 화상을 사용하여 (여기 최대 : 680 ㎚). 자동 ROI 도구가 이용 될 수있는 로아를 정의. 자동 ROI 임계 값을 조정하고 모든 이미지를 사용합니다. 로아의 전체 방사 효율을 정량화한다 (단계 3.1 참조).
- 소프트웨어의 컨트롤을 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다.
- 단백질 분해 효소에 민감한 프로브의 근적외선 (NIR) 분석
- 소프트웨어 제어를 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다.
참고 :이 양적 결과에 영향을주지 않습니다. 자동 형광 스펙트럼 unmixing을 수행합니다. unmixing 도구는 이미지 생활에서 구현됩니다. 자동 unmixing은 자동 형광 이미지로 특정하고 720분의 675로 예 / 엠 700분의 640을 사용합니다. - 혼합되지 않은 이미지를 선택하고 상술 한 바와 같이 ROI를 정의합니다. 정량 및 통계 분석에 대한 ROI를 총 방사 효율을 사용합니다.
- 소프트웨어 제어를 사용하여 이미지의 임계치를 조정한다.
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Representative Results
시신경염의 생물 발광의 시간 코스
염증 프로브의 생물 발광 신호는 눈 주위 강한이었고 시신경염와 EAE 마우스에서만 일어났다. 신호는 비 EAE 마우스 나 염증 프로브를 주입하지 생쥐도 발생 하였다. 쥐를 복구 할 때 신호가 사라졌다. 따라서, 신호 시신경염 특정하고, 상기 신호의 피크 임상 EAE 스코어의 피크 평행. 그림 1은 EAE 유도 후 10 일 및 14 군데 SJL / J 마우스의 두 가지 예를 보여줍니다. 생물 발광 신호는 10 일에 최고이고 마우스 복구 시작했을 때 사라졌다. 임상 점수의 시간 과정은 생물 발광 신호 (예를-1) 또는 점수의 선행 (예-2) 감소의 실종과 일치.
그림 1. 시신경염 및 EAS-SJL / J 마우스 임상 점수의 시간 코스. 시신경염의 생물 발광 이미지는 예방 접종 후 다른 시간 지점에서 두 SJL / J 마우스에서 질병의 1 차 플레어 동안 염증 프로브 (100 μL의 IP)의 주입 후 10 분을 붙 잡았다. 생물 발광 영상 (왼쪽 패널) 10 14 일 예방 접종 후 캡처 된 무지개 사색 사진 오버레이로 표시됩니다. LUT 바는 빨간색 (높은 생물 발광) 파란색 (저) 범위. 스케일 바 : 1cm. 오른쪽 패널은 로아의 개별 전체 생물 발광 카운트의 막대 그래프를 보여 임상 EAE 점수의 시간 교육 과정 (3 이미지 각각 ± 표준 편차 의미). 빨간색 화살표는 영상 일을 표시합니다. 더 큰이 적이 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 rsion.
치료 효능 평가
염증 프로브
약물 (R-5 플루 르 비프로 펜 밀리그램 / kg / d) (5)의 효과는도 2에 도시되어있다. 각 그룹의 생물 발광 이미지의 다섯 가지 예를 제시한다. 차량 및 치료 그룹의 점수는 이기종 있었지만, 모든 마우스에서, 시신경 염증을 나타내는 눈의 생물 발광 신호는 약물 치료 그룹 (그림 2A)에서 낮았다. 로아 총 발광 생물 카운트의 정량 상당한 치료 효과 확인 (총 발광 생물 카운트의 박스 플롯으로,도 2b를 짝 t 검정, P <0.05 2 꼬리). 촬상 결과는 치료 효과에 동의임상 점수와 척수에서 EAE의 조직 병리학 적 양상과 시신경 (5)의 측면에서 약물들.
그림 발광 생물 이미징을 사용 EAE-SJL / J 마우스에서 약물의 효능 2.. SJL / J 마우스는 예방 접종 후 5 일에서 차량이나 약물 (R-플루 르 비프로 펜 5 ㎎ / ㎏ / d)를 받았다. 이미지는 N = 10 그룹 당, 1 차 EAE 피크에서 염증 프로브 (100 μL의 IP)의 주입 후 촬영 하였다. EAE는 두 그룹 7/10에서 개발 및 EAE 비 대응 신호 않고 있었다. 무지개 사색 사진 오버레이로 표시되는 염증 프로브의 100 μL의 IP 주입 후 15 분 - A) 살아있는 생쥐의 생물 발광 영상 5를 붙 잡았다. LUT 바는 빨간색 (고강도) 파란색 (저) 범위. 스케일 바 : 1cm. 개별 피크로아 총 발광 생물 카운트의 정량에 사용되었다. 로아는 머리에 제한되었다. PLP를 주입 부위 검은 천으로 차폐되었다. B) 로아의 총 개수의 정량화를 나타내는 박스 플롯. 상자는 라인이 중간이고, 수염 최대 최소 쇼, 분위 범위를 나타낸다. 총 수는 약 수용 생쥐 시신경염 뇌염의 감소를 나타내는, 그룹간에 유의 (양면 짝 t 검정, P <0.05) 달랐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
페 길화 된 형광 나노 입자
근적외선 나노 입자의 표면 형광 이미지는 눈 주위 모두 처리 GROU에서 뇌 혈관 누수를 밝혀PS (그림 3A, 2 예). 입자는 염료 BBB 무결성의 평가를 허용 축적 염증 부위를 제외하고, 격자 공간으로 혈액에서 매우 느리게 분배. 누설 3 시간 및 나노 입자를 주입 한 후 24 시간 이내에서 분명 이었지만, 이후 시점 강했다. 하지 나노 입자 (오른쪽 패널) 주입 비 EAE 마우스 또는 마우스에서 특정 신호가 없었다. 따라서, 신호가 특정되었다. 로아에서 방사 효율 (그림 3B)의 정량 분석은 치료 그룹 (그룹 당 n = 3, 짝이 꼬리 t 검정, P <0.05) 사이에 유의 한 차이를 공개하지 않았다.
그림 3. 페 길화 형광 나노 입자와 혈액 뇌 장벽 혼란의 평가. SJL / J 쥐 차량 또는 약물 (R-flurbiprof을 받았습니다예방 접종 후 5 일에서 5 ㎎ / ㎏ / d)에 갖추고 있습니다. 이미지는 3 시간 근적외선 표지 된 나노 입자를 주입 한 후 24 시간 (70 μL IV) 1 EAE 피크 중, 그룹 당 n = 3을 포착 하였다. EAE 비 대응 신호 않고 있었다. 자동 ROI 도구는 방사 효율을 정량 하였다. ROI 영역은 머리에 제한되었다. PLP를 주입 개소 차폐 하였다. A) 살아있는 쥐의 대표적인 표면 형광 이미지는 3 시간 및 나노 입자를 주입 한 후 24 시간 이내 캡처. EAE없이 또는 나노 입자의 분사가없는 마우스의 사진 영상 대조군으로 사용 하였다. 스케일 바 : 1cm. LUT 바 다크 레드 (저) 노란색 (고강도)에 이르기까지 다양합니다. B) 로아의 방사 효율의 정량화를 (보여주는 바 차트) SD ± 의미한다. 치료 그룹은 크게 (양면 짝 t 검정) 차이가 없었다. V 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 서평.
매트릭스 메탈로 구분 프로브
자동 형광을 뺀 후, 단백질 분해 효소 활성 형 MMP 프로브의 이미지는 뇌와 EAE 쥐의 척수 (그림 4A, 그룹 당 4 쥐의 예)에서 염증을 밝혔다. 이 프로브를 주입하지 마우스에는 신호가 없었으며, 약한 신호는 임상 증상 (비 응답)없이 EAE 마우스에서 발생했습니다. 그림 4의 이미지는 예 / 엠 720분의 675의 이미지로 차감 전 / 엠 700분의 640의 신호를 표시합니다. 치료법의 차이 만 스펙트럼 unmixing 후 자동 로아의 방사 효율의 정량 분석 후 공개되었다 (그림 4B, 짝 t 테스트를 2 꼬리, n은 6, 4, P <0.05 =).
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근적외선 MMP-민감한 이미징 프로브와 메탈 활동의 그림 4. 평가. SJL / J 마우스는 예방 접종 후 5 일에서 차량이나 약물 (R-플루 르 비프로 펜 5 ㎎ / ㎏ / d)를 받았다. 이미지는 프로브의 주사 후 1 EAE의 피크 (150 μL IV)를 24 시간을 포착하여, N = 6 및 제 PLP 주입 개소 차폐 하였다. MMP 프로브 주사없이 EAE 비 반응자 및 마우스는 대조군으로 사용 하였다. 각이 이미지는 예 / 엠 700분의 640 나노 미터 (특정 신호) 및 720분의 675 nm의 (자동 형광)에서 촬영되었다. 스펙트럼 unmixing 도구를 사용하여 자동 형광을 감산하고, 그 후, 자동 ROI 툴은 특정 MMP 활성의 위치를 식별하는 데 사용 하였다. 전체 방사 효율을 정량 하였다. A) 살아있는 생쥐의 예시적인 표면 형광 이미지는 프로브 주입 후 24 시간을 붙 잡았다. 이미지는 분광 unmixing (UMX)의 결과이다. 스케일 바 : 1cm. LUT 바노란색 (고강도)에 어두운 빨간색 (저)에서의 범위. B) 로아 총 방사 효율의 정량화를 나타내는 박스 플롯. 상자는 라인이 중간이고, 수염 최대 최소 쇼, 분위 범위를 나타낸다. 별표는 그룹간에 유의 한 차이 (양면 짝 t 검정, P <0.05)를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 동영상은 SJL / J 마우스의 EAE의 생체 내 이미징의 생물 발광 및 근적외선 형광을위한 기술을 보여줍니다. 우리는 염증에 민감한 프로브를 사용하여 생물 발광 영상은 주로 시신경염를 표시하고 정량화가 EAE 심각도의 임상 평가 및 약물의 효과에 동의 것으로 나타났다. 신호가 척추에 의해 흡수되기 때문에, 생물 발광 촬상 방법 가능성 EAE 현시 (17)의 기본 위치 인 요추 척수 염증을 검출 할 수 없었다.
근적외선 영상은 더 민감하지만, 생물 발광이 발생하지 않는 자동 형광 높은 간섭의 비용. 빠르게 변화하는 신호 세기와 시계열 NIR 바람직한 방법을 만든다 - (5 분 2)에 비해 BLI - (2- S 1) NIR의 노광 시간은 매우 짧다.
와 중요한 단계프로토콜과 기술의 한계에
면역 위치의 신호는 EAE에서 척수 촬상을 방해하지만, 이는 권장되는 주사 부위 (목, 꼬리의 기부) 열등 아니었다 꼬리의베이스에 모두 주입 부위를 위치시킴으로써 회피 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 검은 천으로 주사 부위를 보호 할 필요가있다.
동역학 동물 사이에서 다르기 때문에 생물 발광 영상의 경우, 이미지의 시계열을 포착하는 것이 중요하다. 반응 속도에 의한 편향을 방지하기 위해 제어 (예를 들면, 자동차 또는 야생형)와 verum (예, 약물 또는 형질) 마우스의 쌍 촬상 유리하다. 제조사에 따라, 신호가 30 분 동안 안정해야한다. 10 분, 15 분에 상당한 감소 - 그러나, EAE, 우리는 5에서 발생하는 피크, 더 빠르고 과도 반응 속도를 관찰했다.
근적외선 촬상 들어 manufa의cturer 특정 프로브에 대한 예 / 엠 설정을 권장합니다. 그럼에도 불구하고, 초기 필터 시리즈를 실행할 유용 항상 밀접보고 예 / 엠 최대 일치 이상 비특이적 신호 스펙트럼 unmixing 위해 사용될 수있는 두 개의 여기 / 발광의 조합에 적어도 1 이미지를 캡처.
빛과 형광이 높은 검은 모피에 의해 흡수되어 있기 때문에, SJL / J처럼 흰색 마우스를 사용하는 것이 중요합니다. 블랙 마우스는 조심스럽게 머리에 면도 및 이미징 전에 다시 일일 될 필요가있다. 그들은 염증 관광 명소로 표시하고, 뇌 또는 척수의 영상을 방해하기 때문에 피부 병변은 피해야한다. NIR 영상의 경우, 제조자는 모든 쥐, 심지어 흰 생쥐의 탈모를 권장합니다. 심지어 면도 후에 검은 쥐의 머리 위로 결과 (도시 생략)을 백색 쥐보다 설득력 있었다. C57BL6 마우스의 기본 프로그레시브 EAE 모델 시판되고 흰색 C57BL6 마우스는,은 ALTER 수있다원주민. (- 1 0.5 최대 점수)이 마우스는 흰둥이 유전 적 배경이 안정적으로 EAE를 개발하지 않기 때문에 털, 면역 SKH1 마우스는, EAE 근적외선 영상 진단에 유용하지만,하지 않습니다. 이 쥐에서 염증 프로브를 사용하여 생물 발광 영상은 모낭이 손실 (도시하지 않음) 피부에 여러 가지 염증 관광 명소를 한 것으로 밝혀졌습니다.
단백질 분해 효소 활동의 NIR 영상은 뇌와 척수의 염증을 밝혀,하지만 신호는 정량 분석을하기 전에 스펙트럼 unmixing을 필요로 자동 형광에 의해 중첩되었다. 따라서, NIR 영상은 생물 발광 영상보다 강력한이고 더 비싼이었다. 그러나, 프로테아제 활성화 될 수있는 프로브의 사용은 특히 매트릭스 메탈을 대상으로 약물을 평가하는데 유용 할 수있다.
장점과 단점
서로 다른 영상 기술은 무료이며 구체적인 질문을 해결합니다. biolumin의 장점escent 영상은 경제성이다 (약 20 유로 / 마우스); 신호 방해 자동 생물 발광의 부족; 높은 특이성; 편리한 IP 주입 및 이미지 분석; 과 견고성과 신뢰성. 단점은 검은 모피와 뼈에 의해 노출 시간 및 신호 흡수 오래입니다.
NIR의 장점 NIR 표지 된 프로브 맞춤 NIR 라벨링 짧은 노출 시간, 그리고 고감도 용이성 넓은 가용성이다. (- 100 유로 / 마우스 50), 모피에 의해 흡수, 자동 형광 강한 간섭 및 분석을하기 전에 스펙트럼 unmixing 및 이미지 처리의 필요성 단점은 높은 비용입니다.
프로브 숫자들은 인해 면역 세포 침윤에 염증 (예를 들면, 퍼 옥시다아제 또는 메탈)의 위치에 상향 조절되는 염증성 효소에 의해 활성화되기 때문에 염증 부위를 검출이 가능하다. 이 프로브 중 일부는 cance을 감지합니다미세 종양 또는 종양 자체 효소의 방출 (예를 들면, MMP의)로 면역 세포 침윤을 보여주는 RS. 모세관 누출 조직에 축적 프로브는 BBB에서 중단을 감지 할뿐만 아니라, 염증과 암의 다른 사이트에 있습니다.
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
"영상 플러스 임상 상처"의 조합은 우수 하였다에 질병 상태의 평가 및 약물 효과의 검출을위한 "만 점수". 눈 주변의 생물 발광 신호는 시신경 5 수초의 파괴와 면역 세포의 침윤을 보여주는 이전의 조직 병리학 적 연구에 동의합니다. 약 MS 환자의 2/3은 시신경염의 에피소드를 개발할 수 있습니다. 지금까지 확산 자기 공명 영상 (MRI) 및 OP 제외한 마우스 거주 시신경염을 정량화하는 신뢰할만한, 비 침습적 방법은 없다광 케이블 (optical) 간섭 단층 촬영 기술적 (18)을 요구하고있다 OCT (),. 빛 간섭 단층 시신경 (19)의자가 면역 반응을 제안, EAE 동안 망막 변화와 위축을 나타내는 방법으로 EAE에 도입되었습니다.
이 깊은 마취를 필요로하기 때문에이 논문에 기재된 방법에 비해 간섭 단층 생쥐에 대한 높은 스트레스이다. 판독은 시신경 (19)의 직접적인 시각화 없습니다.
형광 나노 입자의 근적외선 영상은 EAE와 MS의 또 다른 특징 인 BBB의 붕괴를 시각화하는 데 유용했다. MRI (20), (21) 외에, BBB 무결성의 생체 모니터링에 대한 비 침습적 방법이 없습니다. 실험 약물과 피토 - 약물은 특히 장벽 (22)를 조여 역할을하기 때문에, 매우 유용 할 것이다 (24)에 과도한 림프구 모집을 방해 P> 23. BBB를 통해 백혈구 부착 또는 윤회를 방지하고 leakiness을 감소시키는 것은 MS 처리 (25), 및 나노 입자 영상에서 효과적인 전략 후보 약물의 효능을 평가하는 데 도움이 될 수있다. 지금까지, 입자는 고가이다. 생체 내에 현미경 BBB 무결성 (26)를 시각화하는 데 다른 기술이지만, 일반적 따라서 시간 경과 분석 방지 때문에 개두술의 (케타민 및 자일 라진으로 예) 오래 깊은 마취를 필요로하며, 다시 각성 생쥐를 허용하지. 그러나, 생체 내에 현미경 생체 이미징 달성 아닌 세포 내 수준으로 세포의 높은 해상도 이미지를 제공한다.
기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
요약하면, 촬상 TE본 동영상 도움말에서 제공 chniques 질병의 개별 교육 과정을 평가하고 혼자 임상 점수에 의해 공개하지 부분에 있던 약물의 효과를 모니터링 할 수 있습니다. 기술은 동물 실험의 대체, 감소와 정제의 3 "R"원칙에 동의하고 약물 연구 도구 추가 기능에 유용하다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 독일 연구 협회 (CRC1039 A3) 및 연구 자금 지원 프로그램 헤센, 중개 의학 및 약학 TMP 연구 센터의 주 "Landesoffensive 주르 ENTWICKLUNG wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz"(LOEWE)과 그렇지 크로네-는 Fresenius 재단 지원 (EKFS), 연구 교육 그룹 중개 연구 혁신 - 제약 (TRIP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AngioSpark-680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10149 | Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity |
| MMP-sense 680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10126 | Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation |
| XenoLight RediJect Inflammation Probe | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | 760535 | Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation |
| PLP139-151/CFA emulsion | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| Pertussis Toxin | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| IVIS Lumina Spectrum | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | Bioluminescence and Infrared Imaging System | |
| LivingImage 4.5 software | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | CLS136334 | IVIS analysis software |
| Isoflurane | Abbott Labs, Illinois, USA | 26675-46-7 | Anaesthetic |
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