Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Биолюминесценции и ближней инфракрасной области визуализации неврита зрительного нерва и мозга Воспаление в EAE модели рассеянного склероза у мышей

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

Мы покажем технику для живого биолюминесценции в естественных условиях и в ближней инфракрасной области визуализации неврит зрительного нерва и энцефалита в экспериментальном аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) модели рассеянного склероза у мышей SJL / J.

Abstract

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) в SJL / J мышей является моделью для ремиттирующего рассеянного склероза (РРС). Клинические EAE показатели, характеризующие дефицит моторной функции являются основными показания иммунной опосредованной воспаления спинного мозга. Тем не менее, оценки и веса тела не позволяют провести оценку в естественных условиях воспаления мозга и зрительного нерва. Последнее является ранним и частым проявлением в около 2/3 больных рассеянным склерозом. Здесь мы покажем методы биолюминесценции и ближней инфракрасной области живого изображения для оценки EAE вызванные неврит зрительного нерва, воспаление головного мозга и через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) нарушения в живых мышей с использованием естественных условиях системы формирования изображения в. Биолюминесцентного субстрат активируется оксидаз в первую очередь показал, неврит зрительного нерва. Сигнал был специфичным и позволил визуализировать эффекты лекарств и время курсов заболеванием, которое параллельно клинические результаты. Пегилированные флуоресцентные наночастицы, которые оставались в пределах vasculaturе в течение длительных периодов времени, были использованы для оценки целостности ВВВ. Ближней инфракрасной области обработки изображений выявил утечку ВВВ на пике заболевания. Сигнал был самым сильным вокруг глаз. Ближнего инфракрасного субстратом для матричных металлопротеиназ использовали для оценки EAE-вызванных воспалением. Автофлуоресценции вмешивались сигнала, требуя спектрального расслоении для количественной оценки. В целом, биолюминесценции изображений является надежным методом для оценки EAE-ассоциированной неврит зрительного нерва и эффекты лечения и был выше ближней инфракрасной техники с точки зрения сигнала специфичности, надежности, простоты количественной оценки и стоимости.

Protocol

1. EAE Индукция в SJL / J мышей

  1. мышей
    1. Используйте 11-недельных самок мышей SJL / J и позволяют им привыкают к экспериментальной комнате в течение 7 дней. С помощью N = 10 мышей на группу.
    2. Для оценки эффектов лекарств, введение лекарственного средства и плацебо в контрольной группе непрерывно с питьевой водой или с помощью пищевых гранул, начиная 3 или 5 дней после иммунизации (п = 10 в каждой группе). Во время пика заболевания, вводить лекарство или плацебо с молоком или 3% сахара водянистыми кукурузных хлопьев.
  2. материал Иммунизация
    1. С помощью индукционной набор EAE, состоящий из антигена (пептид из протеолипидного белка, PLP139-151, 1 мг / мл эмульсии) в виде эмульсии с полным адъювантом Фрейнда (CFA, убитых нагреванием микобактерий туберкулеза Н37 Ra) и 2-х ампул (5 мкг каждого) лиофилизированного токсина коклюша (PTX).
    2. Растворить PTX (2 мкг / мл) в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS, то есть </ EM> добавьте 1,5 мл PBS в каждую пробирку PTX, хорошо перемешать, снять с тем же самым концом пипетки, и добавляют к 1 мл PBS в пробирку объемом 50 мл); хорошо перемешать.
  3. иммунизация
    1. Вводят ПЛП / CFA подкожно в 2 порции, каждая по 100 мкл, как у основания хвоста. Не вводят в задней части шеи, потому что любые иммунные реакции в коже в верхней части спины и шеи будет мешать томографию головы и спинного мозга.
    2. Вводят 100 мкл PTX внутрибрюшинно (IP) два раза в мышь, первый 1 - 2 ч после иммунизации, а второй в 24 ч.
    3. Для получения контрольных мышей, вводят CFA без PLP (2 части по 100 мкл) плюс PTX без PLP.
  4. Мышь обработки после иммунизации
    1. Взвесьте мышей любой другой день до 7-го дня, а затем взвесить их ежедневно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши теряют около 1 - 2 г массы тела в течение EAE. Снижение отмечает начало EAE.
    2. Оценка клинических симптомов ежедневно с 7-й день согласияING к системам стандарт подсчета очков (то есть, не оценка 0: никаких очевидных изменений двигательных функций; оценка 0.5: дистальный паралич хвоста; счетом 1: полный хвост паралич; оценка 1.5: мягкий парез одной или обеих задних конечностей; счетом 2: тяжелая парез задних ног; оценка 2.5: полный паралич одной задней ноги; оценка 3: полный паралич обеих задних конечностей; оценка 3.5:. полный паралич задних ног и парез одной передней ноги Эвтаназии мышей с десятками 3.5 или выше для > 12 ч.
  5. EAE курс и время визуализации
    1. Выполнение первой формирующей изображение в начале болезни, когда мыши достигают баллы> 1, что будет происходить вокруг 10-й день - 12 после иммунизации.
    2. Выполнение второго изображений на пике, который будет достигнут 1 или 2 дня после того, как первоначальные симптомы развиваются и будут длиться в течение 1 - 3 дней.
      Примечание: В дальнейшем, мыши будут полностью восстановить в течение 7 до 10 дней. Визуализации в промежутках могут по-прежнему показывают утечку сосудов,но показатели воспаления должно быть отрицательным.

2. Биолюминесцентный и ближней инфракрасной области визуализации неврита зрительного нерва и воспаления мозга

  1. Настройка системы формирования изображения
    1. Выполните в естественных изображений с любым оборудованием , которое позволяет для анализа биолюминесценции и ближней ИК сигналов.
    2. Держите мышей под 2 - 2,5% изофлуран анестезии во время всех процедур визуализации.
    3. Позиция один или две мыши рядом друг с другом в аппарате с использованием источников среднего газа. Расположите верхнюю часть позвоночника в центре.
    4. Используйте две мыши одновременно, по одному в каждой группе, для оценки эффектов лекарств для сравнения пар. Это важно для биолюминесценции визуализации.
    5. Щит сайт иммунизации с черной тканью и сфотографировать и базовое изображение, чтобы оценить правильное позиционирование мыши / мышей. Используйте B-фокус с 6,5 см расстоянием до камеры для всех изображений.
  2. Инъекции и визуализация биолюминесценции воспаления зонда
    1. Используйте в естественных условиях настройки системы формирования изображения: эпи-BLI, Em фильтр открыть, Ex фильтровального блока, fstop 1, бинирование 8, фокус B = 6,5 см, объявление экспозиции 120 с; принять базовое изображение.
    2. Вводят 100 мкл IP готового к употреблению хемилюминесцентного реагента (40 мг / мл). Хорошо перемешать перед заполнением шприца.
    3. Захват изображений биолюминесценции 5, 10 и 15 мин после инъекции. Временной ход биолюминесцентного пика отличается от животных.
      Примечание: Пик будет происходить 5 - 10 мин после инъекции; снижение на 15 мин указывает на то, что никаких дополнительных изображений не требуется. С помощью пары мышиные контроля и лечения групп для устранения незначительных погрешностей из-за различных курсов времени.
    4. Заполните описаний, относящихся к эксперименту. Обратите внимание диалоговое окно выскочит автоматически; она включает в себя информацию, такую как штамм мыши, пол, момент времени, времени впрыска зонда, группы и др. Сохраните все файлы в опе папки; они будут иметь метки времени и все описания.
  3. Инъекции и визуализация ближней инфракрасной наночастиц флуоресцентными для целостности ВВВ
    1. Использование ближней инфракрасной области эпифлуоресцентной изображений в B-фокусе (расстояние: 6,5 см). Максимумы возбуждения / эмиссии илированных люминесцентных наночастиц 675/690 нм. Захват двух изображений на различных длинах волн, на Ex640 / Em700 и Ex675 / EM720; использовать 2-ю экспозицию, бинирование 8, и fstop 2. Возьмите базовое изображение.
    2. Вводят 70 мкл пегилированного люминесцентных наночастиц инфракрасных в.в. через хвостовую вену и представить мышей через 3 ч и 24 ч после инъекции с помощью описанных выше параметров. Смешайте скважину раствора перед заполнением шприца.
    3. Вводят 0,9% хлорида натрия в контрольных мышей, которые будут необходимы для оценки специфичности сигнала.
  4. Инъекции и визуализация ближней инфракрасной флуоресцентного зонда для активности ММР
    1. Бритье или депилировать голову и UPPER позвоночника область осторожно за один день до принятия базового изображения. Кожа не должна быть причинен вред.
    2. Использование ближней инфракрасной области эпифлуоресцентной изображений в B-фокусе (расстояние: 6,5 см). Максимумы возбуждения / эмиссии активируемый зонда ММР являются 680/700 нм. Захват двух изображений на различных длинах волн, на Ex640 / Em700 и Ex675 / EM720; использовать 1-s экспозиции, бинирование 8, и fstop 2. Возьмите базовое изображение.
    3. Добавить 200 мкл 1x PBS в 1,5-мл трубки раствора готового к использованию (20 нмоль / 1,5 мл в 1x PBS), таким образом, что она будет достаточно для 10 мышей; хорошо перемешать перед заполнением шприца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прилагаемый объем не принимает во внимание, что некоторый объем теряется при заполнении шприца и инъекции.
    4. Вводят 150 мкл зонда IV через хвостовую вену за 24 ч до обработки изображений. Вводят PBS только у контрольных животных с целью оценки специфичности сигнала.
    5. Через 24 часа после инъекции, возьмите эпи-FL изображения, по крайней мере на двух длинах волн, Ex640 / Em700 и Ex 675 / EM720, с настройками объяснено выше (1-s экспозиция, фокус B, бинирование 8 и fstop 2).
      Примечание: Использование двух длин волн позволяет спектрального несмешивания путем вычитания неспецифического сигнала.

3. Анализ изображений

  1. Анализ биолюминесценции (BLI)
    1. Дважды щелкните на программное обеспечение, чтобы открыть его.
    2. В верхней строке меню, нажмите на значок браузера файлов, перейдите в каталог папки эксперимента, и выберите его; это откроет все файлы в папке в таблице.
    3. Настроить столбцы, показывающие описания, относящиеся к эксперименту.
    4. Для контроля качества, дважды щелкните по файлу не-респондеров мыши без симптомов EAE и / или наивным мыши, чтобы проверить специфичность сигналов EAE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Там не должно быть никакого сигнала в наивных мышей и минимального сигнала в не иммунокомпетентных мышей.
      1. Проверка базового изображения перед инъекцией пробыть для каждой мыши в качестве дополнительного контроля специфичности сигнала; оно должно быть отрицательным.
    5. Для выбора изображения, дважды щелкните на первом файле первого EAE мыши и проверьте интенсивности биолюминесценции (LUT диапазон бар) и локализации. Проверьте все снимки один за другим. Закройте файл с самой низкой интенсивности для каждой мыши (то есть, держать 2 из 3 изображений для каждой мыши).
    6. Настройка изображения и экспорт
      1. Дважды щелкните первый файл, который будет количественно. Обратите внимание новое окно выскочит. В разделе "Варианты" (верхнее меню), настроить ярлыки для отображения в каждом изображении.
      2. В палитре правильный инструмент, перейдите в раздел "настройки изображения." По умолчанию, минимальные и максимальные значения интенсивности устанавливаются на "Авто" и отображается в радужной псевдоцвете. Выберите "Manual", чтобы изменить настройки, если это необходимо.
        Примечание: Например, все экспортируемые изображения могут иметь идентичные LUT полосы (идентичные минимумы и максимумы), чтобы быть легко сопоставимы.Регулирование минимумов и максимумов не оказывает никакого влияния на количественные результаты.
      3. Нажмите на экспорт изображения, выберите PNG, каталога, и имя изображения
    7. Количественное регионов интереса (ROI)
      1. Перейти к "ROI" инструмента в палитре инструментов. Выберите метод ROI (круг, прямоугольный, авто, или свободной руки) и количество трансформирования. Обратите внимание окно ROI всплывают в окне изображения.
      2. С помощью мыши, настроить размер и положение. Используйте одинаковые пороги ROI для всех изображений, если используется инструмент автоматического ROI. Используйте одинаковые области для всех изображений , если размеры и позиции ROI определяются вручную (например, циркулярные трансформирования).
      3. Нажмите на кнопку "измерения RO.I. Наблюдайте новое окно выскочит. Настройка столбцов (например, имя файла, номер животного, группа, эксперимент, площадь, всего на счету, средний подсчет, подсчет SD, минимальное и максимальное подсчитывает, площадь, время точка, время впрыска зонда и т.д.). Сохраните пользовательские настройки. При повторномАди, выбрать все (Ctrl + A), а затем скопировать и вставить таблицу в таблицу.
      4. Экспорт изображения в качестве PNG с трансформирования на месте. Сохраните и закройте файл изображения.
    8. Повторите процедуру (шаги 3.1.6 - 3.1.7) для всех файлов изображений, которые должны быть определены количественно. Скопируйте все ROI количественными в электронную таблицу.
      Примечание: Здесь, результаты могут быть отсортированы по группам, момент времени и т.д. , и статистический анализ. Используйте общие подсчеты биолюминесценции сигналов в трансформирования для статистического анализа.
  2. Ближней ИК -области спектра (NIR) анализ флуоресцентных наночастиц
    1. С помощью элементов управления в программном обеспечении, отрегулируйте порог изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это не оказывает никакого влияния на количественный результат.
    2. Визуально сравнить изображения, снятые при Ex / Em 675/720 и Ex / Em 640/700 для оценки специфичности сигнала.
    3. Используйте изображения, снятые при Ex / Em 675/720 для количественного анализа (максимум возбуждения: 680 нм), Определение трансформирования, для которых может быть использован инструмент автоматического ROI. Отрегулируйте порог автоматического ROI и использовать его для всех изображений. Количественно общий лучистую эффективность в трансформирования (см шаг 3.1).
  3. Ближней ИК -области спектра (NIR) анализ протеазы-чувствительного зонда
    1. С помощью программного управления, регулировки порога изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это не оказывает никакого влияния на количественный результат. Выполните спектральный расслоении в автофлуоресценции. Инструмент несмешивание реализуется в живой образ. Авто-несмешивание использует Ex / EM 640/700 как специфический и 675/720 в качестве авто-флуоресцентное изображение.
    2. Выберите замешанный изображение и определить трансформирования, как описано выше. Используйте полную лучистую эффективность трансформирования для количественного и статистического анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Время Курс биолюминесценции неврита зрительного нерва

Биолюминесценции сигнал воспаления зонда был самым сильным вокруг глаз и происходило исключительно у мышей с EAE неврита зрительного нерва. Сигнал произошло ни в одном из мышей не-EAE, ни мышей, которым не вводили воспаления зонда. Сигнал исчез, когда мышей выздоровели. Следовательно, сигнал специфичен для неврита зрительного нерва, а пик сигнала параллелен пик клинических показателей ЭАЭ. На рисунке 1 показаны два примера SJL / J мышей изображаемых на 10 -й день и 14 после индукции ЕАЕ. Биолюминесцентного сигнала был самым высоким на 10-й день и исчез, когда мыши начали восстанавливаться. Временные курсы клинических показателей соответствует исчезновение биолюминесценции сигнала (например, 1) или предшествовал (пример-2) снижением баллов.


Рисунок 1. Время Курс неврит зрительного нерва и клинические показатели в EAS-SJL / J мышей. Биолюминесцентный образы неврит зрительного нерва были захвачены 10 мин после инъекции воспаление зонда (100 мкл IP) во время 1 - й вспышки заболевания в двух SJL / J мышей в различные моменты времени после иммунизации. Биолюминесцентного изображения (левая панель) были захвачены 10 и 14 дней после иммунизации и представлены в виде радуги псевдоцвете фотоснимка накладками. Lut бары в диапазоне от синего (низкого) до красного (с высокой биолюминесценции). Шкала бар: 1 см. Правая панель показывает гистограммы индивидуальных общего счета биолюминесценции в трансформирования (среднее ± стандартное отклонение 3 изображений каждого) и время курсов клинических показателей ЭАЭ. Красные стрелки отмечают дни визуализации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную веrsion этой фигуры.

Оценка эффективности лечения

Воспаление зонд

Эффекты препарата (Р-флурбипрофен 5 мг / кг / сут) 5 показаны на рисунке 2. Пять примеров биолюминесцентного изображений в каждой группе представлены. Счет в транспортном средстве и лечения группы были неоднородными, но и во всех мышей биолюминесцентного сигнала в глаза , показывая воспаление зрительного нерва была ниже в группе лекарственных средств (рис 2А). Количественное определение общего счета биолюминесценции в трансформирования подтвердили значимую эффективность лечения (рис 2B, с коробкой участков полных графов биолюминесценции, непарный 2-хвостами Стьюдента, р <0,05). Результаты обработки изображений согласились с лечебным эффектомх лекарства в терминах клинических показателей и гистологических проявлений аллергического энцефаломиелита в спинном мозге и зрительного нерва 5.

фигура 2
Рисунок 2. Эффективность препарата у мышей EAE-SJL / J Использование БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ Imaging. SJL / J мышей получали средства или лекарства (R-флурбипрофен 5 мг / кг / сут) от 5-й день после иммунизации. Изображения были получены после инъекции воспаления зонда (100 мкл внутрибрюшинно) на 1 - й EAE пика, N = 10 в каждой группе. ЭАЭ разработан в 7/10 в обеих группах, и EAE не реагирующими были без сигнала. A) биолюминесценции изображения в живых мышей захватили 5 - 15 мин после внутрибрюшинной инъекции 100 мкл воспаления зонда представлены в виде радуги псевдоцвете фотоснимка накладками. LUT бары в диапазоне от синего (низкого) до красного (высокой интенсивности). Шкала бар: 1 см. Индивидуальный пикот общего количества отсчетов биолюминесценции в трансформирования использовали для количественной оценки. Трансформирования были ограничены к голове. Места инъекций ПФУ были экранированы с черной тканью. B) Box участки , показывающие количественную оценку общего счета в трансформирования. Коробка представляет собой межквартильный диапазон, линия является медианой, и нитевидные показывают минимума до максимума. Общая сумма на счету существенно отличались между группами (2-х сторонняя непарный т-тест, р <0,05), что свидетельствует о снижении неврит зрительного нерва и энцефалита у мышей, получавших лекарство. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Пегилированные флуоресцентные наночастицы

Эпифлуоресцентной изображения ближней инфракрасной наночастиц выявили утечку сосудов вокруг глаз и в головном мозге в обоих лечения Гроупс (рис 3А, 2 примера). Частицы распределяют очень медленно из крови в интерстициальное пространство, для участков воспаления, где краситель накапливается, что позволяет провести оценку целостности ГЭБ, за исключением. Утечка была очевидна на 3 ч и 24 ч после инъекции наночастиц, но он был сильнее в более поздний момент времени. Там не было никакого конкретного сигнала в не ЕАЕ мышей или мышей, которым не вводили наночастицы (правая панель). Следовательно, сигнал был специфичным. Количественный анализ лучистой эффективности трансформирования (рис 3B) не выявили существенных различий между группами лечения (n = 3 в каждой группе, непарный 2-Стьюдента-тест, р <0,05).

Рисунок 3
Рисунок 3. Оценка крови мозга , разрушающий барьер с пегилированного Флуоресцентные наночастицами. SJL / J мышей получали транспортного средства или лекарства (R-flurbiprofан 5 мг / кг / сут) от 5-й день после иммунизации. Изображения были захвачены в плен 3 ч и 24 ч после инъекции ближней инфракрасной-меченых наночастиц (70 мкл IV) во время пика 1-й EAE, N = 3 на группу. EAE не реагирующими были без сигнала. Инструмент автоматического ROI был использован для количественной оценки лучистого эффективности. В трансформирования были ограничены к голове. Места инъекций ПФУ были экранированы. A) Примерные эпифлуоресцентной образы живых мышей, захватили 3 ч и через 24 ч после введения наночастиц. Изображения мышей без EAE или без введения наночастиц использовались в качестве контрольных изображений. Шкала бар: 1 см. LUT бары варьируются от темно-красного (низкого) до желтого (высокой интенсивности). B) Гистограммы , показывающие количественное определение лучистого эффективности трансформирования (среднее ± стандартное отклонение). Группы лечения достоверно не отличалось (2-сторонний непарный т-тест). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы V IEW большую версию этой фигуры.

Матрица металлопротеиназы-чувствительный зонд

После вычитания автофлуоресценции, изображения протеазы-активируемый ММР зонда выявили воспаление в головном мозге и спинном мозге у мышей EAE (рис 4A, примеры 4 мышей на группу). Там не было никакого сигнала у мышей не вводили зондом, и слабый сигнал произошел в мыши EAE без клинических симптомов (не иммунокомпетентные). Изображения на рисунке 4 показывают сигнал на Ex / Em 640/700 вычитают изображением на Ex / Em 675/720. Различия между лечения были выявлены только после количественного анализа лучистой эффективности в авто-трансформирования после спектрального расслоении (рис 4В, непарный 2-Стьюдента-тест, п = 6 и 4, P <0,05).

Iles / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Оценка металлопротеиназы активности с ближней инфракрасной области спектра ММР-чувствительных изображений зонда. SJL / J мышей получали средства или лекарства (R-флурбипрофен 5 мг / кг / сут) от 5-й день после иммунизации. Изображения были получены через 24 ч после введения зонда (150 мкл, IV) на 1-й пик EAE, п = 6 и 4. Места инъекций ПФУ были экранированы. EAE не реагирующими и мышей без инъекций зонда ММР были использованы в качестве контрольных. Каждые 2 изображения были захвачены в Ex / Em 640/700 нм (специфический сигнал) и 675/720 нм (авто-флуоресценция). Используя спектральную инструмент несмешивание, авто-флуоресценции вычитали и в дальнейшем, средство автоматического ROI был использован для идентификации участков специфической активности ММР. Общий коэффициент полезного действия лучистой использовался для количественной оценки. А) Примерные эпифлуоресцентной изображения в живых мышей захватили 24 ч после введения зонда. Изображения являются результатом спектрального несмешивания (UMX). Шкала бар: 1 см. LUT-барs варьируются от темно-красного (низкого) до желтого (высокой интенсивности). B) Box участки , показывающие количественную оценку общего лучистой эффективности трансформирования. Коробка представляет собой межквартильный диапазон, линия является медианой, и нитевидные показывают минимума до максимума. Звездочка указывает на существенную разницу между группами (2-сторонний непарный т-тест, p <0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Настоящее видео показывает методы для биолюминесценции и ближней инфракрасной флуоресценции в естественных условиях визуализации EAE у мышей SJL / J. Мы покажем, что биолюминесценции визуализации с использованием воспаление чувствительного зонда в основном показывает, неврит зрительного нерва, а также количественное определение согласуется с клинической оценкой тяжести ЕАЕ и побочные эффекты препаратов. Тем не менее, метод биолюминесценции визуализации не смог обнаружить воспаление поясничного отдела спинного мозга, которая является первичным местом EAE проявления 17, скорее всего , потому что сигнал поглощается позвоночника.

Ближней инфракрасной области изображения является более чувствительным, но за счет высокой интерференции с автофлуоресценции, которая не встречается с биолюминесценции. Время экспозиции НДК намного короче (1 - 2 лет) по сравнению с BLI (2 - 5 мин), что делает NIR предпочтительным методом для временных рядов с быстро меняющейся интенсивности сигналов.

Критические шаги св Протоколе и ограничения методики

Сигналы сайта иммунизации мешают визуализации спинного мозга в EAE, но это может быть обойдена путем размещения обоих узлов впрыска у основания хвоста, который был не хуже рекомендованных местах инъекций (шеи и основания хвоста). Тем не менее, необходимо, чтобы оградить участков инъекции черной тканью.

Для визуализации биолюминесценции, крайне важно, чтобы захватить временной ряд изображений, так как кинетика различаются между животными. Для того, чтобы избежать систематической ошибки , вызванные кинетики, изображения пар контроля (например, транспортного средства или дикого типа) и Verum (например, наркотиков или трансгенного) мышей является предпочтительным. По словам производителя, сигнал должен быть стабильным в течение 30 мин. Тем не менее, в EAE, мы наблюдали более быстрые и более преходящие кинетики, с пиками, происходящих на 5 - 10 мин и существенное снижение на 15 мин.

Для ближней инфракрасной области визуализации, то производcturer рекомендует установку Ex / Em для конкретного зонда. Тем не менее, было бы полезно, чтобы запустить серию фильтров первоначально и всегда получать изображения, по меньшей мере в двух комбинациях возбуждения / выбросов, которые точно соответствуют сообщенного Ex / Em максимумы и в дальнейшем могут быть использованы для спектрального несмешивания неспецифических сигналов.

Важно использовать белых мышей, как SJL / J, так как свет и флуоресценцию высоко поглощаться черным мехом. Черные мышей должны быть осторожно побрился на голову и обратно за один день до обработки изображений. Повреждения кожи следует избегать, так как они будут выглядеть как воспалительные пятна и мешают визуализации головного или спинного мозга. Для визуализации NIR, производитель рекомендует депиляцию всех мышей, даже белых мышей. Даже после бритья, голове и спине результаты в черных мышей были менее убедительны, чем с белых мышей (не показано). Для получения первичной прогрессивной модели EAE у мышей C57BL6, белых мышей C57BL6, которые являются коммерчески доступными, могут быть Alterродной. Голые, иммунокомпетентных мышей SKH1 полезны для ближней инфракрасной области обработки изображений, но не EAE, потому что эти мыши имеют альбиноса генетический фон и не надежно развивать EAE (максимальный балл: 0,5 - 1). Биолюминесцентный изображений с использованием Воспаление зонда у этих мышей было выявлено несколько воспалительных пятен на коже (не показан), где волосяные фолликулы теряются.

NIR визуализация активности протеазы показал головного и спинного мозга воспаление, но сигналы были наложены автофлуоресценции, требующих спектрального расслоении перед количественным анализом. Следовательно, БИК визуализация была менее надежна, чем визуализации биолюминесценции и был более дорогим. Тем не менее, использование протеазы активируемых зондов могут быть полезны для оценки лекарственных средств, которые специфически нацелены на металлопротеиназы матрикса.

Преимущества и недостатки

Различные методы визуализации дополняют друг друга и решать конкретные вопросы. Преимущества bioluminescent изображения являются доступность (около 20 евро / мышь); отсутствие автоматического биолюминесценции, которая будет мешать сигналу; высокая специфичность; удобно инъекцией и анализа изображений; и надежность и надежность. К недостаткам можно отнести долгое время экспозиции и поглощения сигнала с помощью черного меха и кости.

Преимущества NIR являются более широкая доступность БИК-меченых зондов, простота пользовательского NIR маркировки, короткое время экспозиции, и высокой чувствительностью. К недостаткам можно отнести высокие затраты (50 - 100 евро / мышь), поглощение меха, сильные помехи с автофлуоресценции, а также необходимость для спектрального расслоении и обработки изображений перед анализом.

Ряд зондов доступны , которые обнаруживают участки воспаления , потому что они активируются провоспалительных ферментов, которые активируются на участках воспаления (например, пероксидазы или металлопротеиназ) за счет инфильтрации иммунных клеток. Некоторые из этих зондов также обнаруживает CanceР.С. , демонстрирующих иммунных клеток инфильтрации в микроокружение опухоли или высвобождения ферментов самой опухоли (например, ММР). Зонды, которые накапливаются в тканях из-за утечки капиллярного обнаружит нарушения в ГЭБ, но и на других участках воспаления и рака.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов

Сочетание "визуализации плюс клинических болячек" превосходит "только оценки" для оценки состояния заболевания и выявления эффектов лекарств. Биолюминесценция сигнал вокруг глаз также согласуется с предыдущими гистологических исследований , показывающих разрушения миелина и инфильтратов иммунных клеток в зрительном нерве 5. Около 2/3 больных РС развиваются эпизоды неврита зрительного нерва. До сих пор нет надежных, неинвазивных методов количественного неврит зрительного нерва в живых мышей, кроме диффузии магнитно-резонансной томографии (МРТ) и орTical когерентной томографии (ОКТ), которые технически требуют 18. ОКТ был введен в EAE как метод , показывающий изменения в сетчатке и атрофии в течение EAE, предполагая , аутоиммунные реакции в зрительном нерве 19.

По сравнению со способом, описанным в этой рукописи ОКТ является более стрессора для мышей, так как она требует глубокой анестезии. Отсчет не является прямой визуализации зрительного нерва 19.

Ближней инфракрасной области визуализации флуоресцентных наночастиц было полезно визуализировать нарушения ГЭБ, что является еще одним признаком EAE и MS. Кроме того , МРТ 20, 21, не существует неинвазивный метод в естественных условиях мониторинга целостности ГЭБ. Это было бы весьма полезно, так как экспериментальные препараты и фито-препараты , в частности , действуют путем ужесточения барьера 22, 23, который обычно препятствует чрезмерному набору лимфоцитов в ЦНС 24. Предотвращение прикрепление лейкоцитов или трансмиграции через ГЭБ и снижая его негерметичности является эффективной стратегией в лечении MS 25 и визуализации наночастиц может помочь оценить эффективность кандидата препаратов. До сих пор, частицы являются дорогостоящими. Прижизненные микроскопия является другой метод , используемый для визуализации целостности ВВВ 26, но это обычно требует длительный, глубокий наркоз (например, с помощью кетамина и ксилазина) из-за трепанации и запрещает повторно пробуждения мышей, таким образом предотвращая время хода анализа. Тем не менее, прижизненной микроскопии позволяет получить изображение с высоким разрешением на клеточном на субклеточном уровнях, которые не достижимо с изображениями в естественных условиях.

Будущие приложения или направления после овладения техникой

Таким образом, те изображенияchniques, представленные в настоящем видео помогают оценить индивидуальные курсы заболевания и контролировать эффекты лекарств, которые были частично не был выявлен в одних только клинических показателей. Методы согласуются с "R" 3 принципов замены, сокращения и уточнения в экспериментах на животных и являются полезными дополнительными инструментами в области исследований лекарственных средств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) и программа исследования финансирования "Landesoffensive цур Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) штата Hessen, научно-исследовательского центра трансляционной медицины и фармакологии TMP и Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), подготовки научных кадров Группа трансляционные исследования Инновации - Pharma (TRIP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
  3. Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
  4. Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
  5. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
  6. Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
  7. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  8. Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
  9. Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
  10. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  11. Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
  12. Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
  13. Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
  14. Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
  15. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
  16. Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
  17. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  18. Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
  19. Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
  20. Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
  21. Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
  22. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
  23. Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
  24. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  25. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
  26. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS One. 7 (12), e50915 (2012).
  27. Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).

Tags

Медицина выпуск 121 аутоиммунный энцефаломиелит рассеянный склероз неврит зрительного нерва оптический живой обработки изображений биолюминесценции инфракрасное воспаление
Биолюминесценции и ближней инфракрасной области визуализации неврита зрительного нерва и мозга Воспаление в EAE модели рассеянного склероза у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, K., Tegeder, I.… More

Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter