Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Bioluminescens og Nær-infrarød Imaging af optisk neuritis og hjernebetændelse i EAE model af multipel sklerose i mus

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

Vi viser en teknik til in vivo levende bioluminescens og nær-infrarød billeddannelse af optisk neuritis og encephalitis i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) model for dissemineret sklerose i SJL / J-mus.

Abstract

Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) i SJL / J-mus er en model for recidiverende-remitterende multipel sklerose (RRMS). Kliniske EAE-scorer beskriver motoriske underskud er grundlæggende udlæsninger af den immunmedieret inflammation i rygmarven. Men scores og kropsvægt ikke mulighed for en in vivo vurdering af hjernebetændelse og optisk neuritis. Sidstnævnte er en tidlig og hyppig manifestation i omkring 2/3 af MS-patienter. Her viser vi fremgangsmåder til bioluminescens og nær-infrarød billeddannelse til at vurdere EAE fremkaldt optisk neuritis, hjernebetændelse, og blod-hjerne-barrieren (BBB) forstyrrelser i levende mus ved anvendelse af en in vivo imaging system. En bioluminescerende substrat aktiveres af oxidaser viste primært optisk neuritis. Signalet var specifik og tillod visualisering af medicin effekter og sygdom tidsforløb, som parallel de kliniske scoringer. Pegylerede fluorescerende nanopartikler, der forblev i vasculature i længere tid blev anvendt til at vurdere BBB integritet. Nær-infrarød billeddannelse afslørede en BBB lækage på toppen af ​​sygdommen. Signalet var den stærkeste omkring øjnene. En nærinfrarøde substrat for matrixmetalloproteinaser blev anvendt til at vurdere EAE-fremkaldte inflammation. Autofluorescens forstyrrede signal, som kræver spektral unmixing til kvantificering. Samlet set bioluminescens billeddannelse var en pålidelig metode til at vurdere EAE-associeret optisk neuritis og medicin effekter og var overlegen i forhold til de nær-infrarøde teknikker i form af signal specificitet, robusthed, nem kvantificering, og omkostninger.

Protocol

1. EAE induktion i SJL / J-mus

  1. Mus
    1. Brug 11 uger gamle hun SJL / J-mus og tillade dem at vænne til den eksperimentelle plads til omkring 7 dage. Brug n = 10 mus per gruppe.
    2. Til vurdering af medicin effekter, administrere lægemidlet og placebo for kontrolgruppen kontinuerligt via drikkevandet eller via foderpiller starter 3 eller 5 dage efter immunisering (n = 10 pr gruppe). Under toppen af ​​sygdommen, administrere medicin eller placebo med mælk eller 3% sukker vand-gennemblødt cornflakes.
  2. vaccination materiale
    1. Brug en EAE induktion kit bestående af antigen (peptid af proteolipidprotein, PLP139-151, 1 mg / ml emulsion) i en emulsion med komplet Freunds adjuvans (CFA, varmedræbt Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) og 2 hætteglas (5 ug hver) af lyofiliseret pertussistoksin (PTX).
    2. Opløs PTX (2 ug / ml) i 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS; dvs. </ Em> læg 1,5 ml PBS i hvert PTX rør, bland godt, fjernes med det samme pipettespidsen, og tilføje til 1 ml PBS i et 50 ml rør); bland godt.
  3. vaccination
    1. Injicer PLP / CFA subkutant i 2 portioner, hver 100 pi, både ved basen af ​​halen. Injicer ikke ind i bagsiden af ​​halsen, fordi eventuelle immunreaktioner i huden i den øvre ryggen eller nakken vil forstyrre billeddannelse af hovedet og rygmarven.
    2. Injicer 100 pi PTX intraperitonealt (ip) to gange om mus, den første 1 - 2 ud timer efter immunisering, og den anden ved 24 timer.
    3. For kontrolmusene, injicere CFA uden PLP (2 portioner 100 pi) plus PTX uden PLP.
  4. Mus håndtering efter immunisering
    1. Afvejes musene hver anden dag op til dag 7, og derefter vejes dagligt.
      BEMÆRK: Mus mister ca 1 - 2 ud g legemsvægt under EAE. Faldet markerer starten af ​​EAE.
    2. Vurdere kliniske symptomer dagligt fra dag 7 overenskomsting til standard pointsystemer (dvs. Score 0: ingen tydelige ændringer i motoriske funktioner score 0,5: distal lammelse af halen, score 1: komplet hale paralyse; score 1.5: mild parese af en eller begge bagben, score 2: alvorlig lammelse af bagbenene, score 2.5: fuldstændig lammelse af den ene bagben, score 3: komplet lammelse af begge bagben, score 3.5:. komplet lammelse af bagbenene og lammelse af en forben Afliv mus med snesevis af 3,5 eller højere for > 12 timer.
  5. EAE kursus og tidspunkt for billedbehandling
    1. Udføre den første billeddannelse ved sygdommens opståen, når musene nå scorer> 1, som vil opstå omkring dag 10 - 12, efter immunisering.
    2. Udfør den anden billedbehandling på toppen, som vil blive nået 1 eller 2 dage efter de første symptomer udvikler og vil vare i 1 - 3 dage.
      BEMÆRK: Efterfølgende vil musene fuldstændig genoprettet inden for 7 til 10 dage. Imaging i pauserne kan stadig vise vaskulære lækager,men betændelse indikatorer skal være negativ.

2. Bioluminescent og Nær-infrarød Imaging af optisk neuritis og hjernebetændelse

  1. Opsætning af billeddannende system
    1. Udføre in vivo-afbildning med et udstyr, der tillader analyse af bioluminescens og nær-infrarøde signaler.
    2. Hold mus under 2-2,5% isofluran anæstesi under alle billeddiagnostiske procedurer.
    3. Position en eller to mus ved siden af ​​hinanden i apparater, der anvender de midterste gasforsyninger. Placer øvre ryg i midten.
    4. Brug to mus samtidigt, én pr gruppe, til vurdering af medicin effekter at sammenligne par. Dette er vigtigt for bioluminescerende billeddannelse.
    5. Shield stedet for immunisering med sort klæde og tage et fotografi og baseline billede for at vurdere den korrekte placering af de mus / mus. Brug B-fokus med en 6,5-cm afstand til kameraet for alle billeder.
  2. Injektion og billeddannelse af bioluminescerende inflammation probe
    1. Brug in vivo imaging systemindstillinger: Epi-BLI, Em filtrere åben, Ex filter blok, fStop 1, udsmidningen 8, fokus B = 6,5 cm, ad eksponering 120 s; tage en baseline billede.
    2. Injicer 100 pi ip af klar-til-brug kemiluminescerende reagens (40 mg / ml). Bland godt før sprøjten fyldes.
    3. Capture bioluminescens billeder 5, 10 og 15 minutter efter injektion. Tidsforløbet for den bioluminescerende top varierer mellem dyr.
      BEMÆRK: Toppen vil forekomme 5 - 10 minutter efter injektion; et fald på 15 min indikerer, at ingen yderligere billeder er påkrævet. Brug musen par af kontrol- og behandlingsgrupperne at eliminere mindre bias på grund af forskellige tidsforløb.
    4. Udfyld beskrivelser er relevante for eksperimentet. Overhold en dialogboks poppe op automatisk; det indeholder information, såsom mus stamme, køn, tid, tidspunkt for probe injektion, gruppe, osv. Gem filerne alt i one mappe; de vil have tid tags og alle beskrivelser.
  3. Injektion og billeddannelse af nær-infrarød fluorescerende nanopartikler til BBB integritet
    1. Brug nær-infrarødt epifluorescens billedbehandling i B-fokus (afstand: 6,5 cm). Excitation / emission maxima af de pegylerede fluorescerende nanopartikler er 675/690 nm. Capture to billeder ved forskellige bølgelængder, ved Ex640 / Em700 og Ex675 / Em720; bruge en 2-eksponering, udsmidningen 8, og fStop 2. Tag en baseline billede.
    2. Injicer 70 pi pegylerede fluorescerende infrarøde nanopartikler iv gennem halevenen og forestille musene 3 timer og 24 timer efter injektion under anvendelse af ovennævnte indstillinger. Blande opløsningen grundigt før sprøjten fyldes.
    3. Injicer 0,9% natriumchlorid i kontrol mus, som vil være nødvendige for at vurdere specificiteten af ​​signalet.
  4. Injektion og billeddannelse af nær-infrarødt fluorescerende probe for MMP-aktivitet
    1. Barber eller fjerne hår på hovedet og upper rygsøjlen region forsigtigt en dag før tager baseline billedet. Huden må ikke komme til skade.
    2. Brug nær-infrarødt epifluorescens billedbehandling i B-fokus (afstand: 6,5 cm). Excitation / emission maxima af MMP aktiverbare probe er 680/700 nm. Capture to billeder ved forskellige bølgelængder, ved Ex640 / Em700 og Ex675 / Em720; bruge en 1-eksponering, udsmidningen 8, og fStop 2. Tag en baseline billede.
    3. Tilsæt 200 pi 1x PBS til 1,5-ml rør i klar-til-brug-opløsning (20 nmol / 1,5 ml i 1 x PBS), så det vil være tilstrækkeligt til 10 mus; bland godt før sprøjten fyldes.
      BEMÆRK: Den angivne mængde tager ikke højde for, at nogle volumen går tabt under sprøjte fyldning og injektion.
    4. Injicer 150 pi af sonden iv gennem halevenen 24 timer før billeddannelse. Injicer PBS kun i kontroldyr at vurdere specificiteten af ​​signalet.
    5. 24 timer efter injektionen, skal Epi-FL billeder ved mindst to bølgelængder, Ex640 / Em700 og Ex 675 / EM720, med indstillingerne forklaret ovenfor (1-s eksponering, fokus B, udsmidningen 8, og fStop 2).
      BEMÆRK: Brugen af ​​to bølgelængder muliggør spektral unmixing ved at subtrahere uspecifik signal.

3. billede Analyser

  1. Bioluminescens analyse (BLI)
    1. Dobbeltklik på software til at åbne den.
    2. I den øverste menu bar, skal du klikke på ikonet fil browser, gå til den mappe i mappen af eksperimentet, og vælg det, dette vil åbne alle filer i mappen i en tabel.
    3. Konfigurer kolonnerne viser beskrivelserne er relevante for eksperimentet.
    4. For kvalitetskontrol, dobbeltklikke på en fil af en ikke-responder mus uden symptomer på EAE og / eller en naiv mus til at kontrollere specificiteten af ​​EAE signaler.
      BEMÆRK: Der skal være noget signal i naive mus og minimal signal i ikke-responder mus.
      1. Kontroller baseline billedet før injektionen af ​​provære for hver mus som yderligere kontrol af specificitet af signalet; det bør være negativ.
    5. For at vælge et billede, skal du dobbeltklikke på den første fil i den første EAE musen og tjek bioluminescerende intensitet (LUT bar interval) og lokalisering. Tjek alle billeder et efter et. Luk filen med den laveste intensitet for hver mus (dvs. holde 2 ud af 3 billeder for hver mus).
    6. Billede justering og eksport
      1. Dobbeltklik på den første fil, der skal kvantificeres. Overhold et nyt vindue pop up. Under "indstillinger" (øverst i menuen), tilpasse etiketterne skal vises i hvert billede.
      2. I det rigtige værktøj palet, gå til "justering image." Som standard er minimum og maksimale sat til "auto" og vises i regnbue pseudofarve. Vælg "manual" for at ændre indstillingerne, hvis det er nødvendigt.
        BEMÆRK: For eksempel kan alle eksporterede billeder har identisk LUT barer (identisk minima og maxima) til at være let sammenlignelige.Justeringen af ​​minima og maksima har ingen indflydelse på de kvantitative resultater.
      3. Klik på billedet eksport, vælg png, biblioteket, og et billede navn
    7. Kvantificering af Regioner Interessante (ROI)
      1. Gå til "ROI" værktøj i værktøjskassen. Vælg den metode ROI (cirkel, rektangulær, auto, eller i fri hånd) og antallet af ROIs. Overhold vinduet ROI poppe op i vinduet billedet.
      2. Ved hjælp af musen, justere størrelse og placering. Brug tærskler identiske ROI for alle billeder, hvis der anvendes værktøj auto-ROI. Brug identiske områder for alle billeder, hvis ROI størrelser og positioner er defineret manuelt (f.eks cirkulære ROIs).
      3. Klik på "måle RO.I. Overhold et nyt vindue pop up. Tilpas kolonnerne (f.eks filnavn, dyr nummer, gruppe, forsøg, område, alt tæller, gennemsnitlige tællinger, SD tæller, min og max tæller, område, tid , tidspunkt for sonde indsprøjtning, etc.). Gem tilpassede indstillinger. Når reAdy Vælg alle (Ctrl + A), og kopiere og indsætte tabellen i et regneark.
      4. Eksporter billedet som en png med ROI'er på plads. Gem og luk billedfilen.
    8. Gentag proceduren (trin 3.1.6 - 3.1.7) for alle billedfiler, der skal kvantificeres. Kopier alle ROI kvantificeringer i regnearket.
      BEMÆRK: Her kan resultaterne sorteres efter gruppe, tidspunkt, etc. og statistisk analyseret. Brug de totale tællinger af bioluminescens signaler i ROI'er for statistiske analyser.
  2. Nær-infrarød (NIR) analyse af fluorescerende nanopartikler
    1. Brug kontrollerne i softwaren, justere tærsklen af ​​billedet.
      BEMÆRK: Dette har ingen indvirkning på det kvantitative resultat.
    2. sammenligne Visuelt de billeder taget på Ex / Em 675/720 og Ex / Em 640/700 for at vurdere specificiteten af ​​signalet.
    3. Brug billeder taget på Ex / Em 675/720 til kvantitativ analyse (excitation maksimum: 680 nm). Definer ROI'er, hvor der kan anvendes værktøj auto-ROI. Justér tærsklen auto-ROI og bruge det til alle billeder. Tal på de samlede strålende effektivitet i ROI (se trin 3.1).
  3. Nær-infrarød (NIR) analyse af protease-sensitive probe
    1. Ved hjælp af software kontrol, justere tærsklen af ​​billedet.
      BEMÆRK: Dette har ingen indvirkning på det kvantitative resultat. Udfør spektral unmixing af auto-fluorescens. Den unmixing Værktøjet er implementeret i Living Image. Auto-unmixing bruger Ex / Em 640/700 som den specifikke og 675/720 som auto-fluorescerende billede.
    2. Vælg den ublandede billede og definere ROI'er, som beskrevet ovenfor. Brug den samlede strålende effektivitet i ROI'er for kvantitative og statistiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidsforløb for Bioluminescens af optisk neuritis

Den bioluminescens signal af inflammation proben var den stærkeste omkring øjnene og forekom udelukkende i EAE-mus med optisk neuritis. Et signal forekom i hverken de ikke-EAE-mus eller mus ikke injiceret med betændelse proben. Signalet forsvandt, da musene inddrevet. Derfor er signalet er specifikt for optisk neuritis, og toppen af ​​signalet parallel toppen af ​​de kliniske EAE-scorer. Figur 1 viser to eksempler på SJL / J-mus afbildes på dag 10 og 14 efter EAE-induktion. Den bioluminescerende signal var det højeste på dag 10 og forsvandt når musene begyndte at komme sig. De tidsforløb for de kliniske scoringer matchede forsvinden bioluminescerende signal (eksempel-1) eller forud (eksempel-2) faldet af scoringer.


Figur 1. Tidsforløb for optisk neuritis og Kliniske Scores i EAS-SJL / J mus. Bioluminiscerende billeder af optisk neuritis blev fanget 10 min efter injektionen af inflammation sonde (100 pi ip) den under 1. opblussen af sygdommen i to SJL / J-mus på forskellige tidspunkter efter immunisering. De bioluminiscerende billeder (venstre panel) blev taget til fange 10 og 14 dage efter immunisering og præsenteres som regnbue pseudo fotografi overlejringer. LUT barer spænder fra blå (lav) til rød (høj-bioluminescens). Målestok: 1 cm. Højre panel viser søjlediagrammer af de enkelte samlede bioluminescens tæller i ROI (gennemsnit ± SD af 3 billeder hver) og tidsforløb for de kliniske EAE scoringer. De røde pile markerer de billeddannende dage. Klik her for at se et større version af dette tal.

Vurdering af behandlingseffekt

Inflammation sonde

Virkningerne af medicinen (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) 5 er vist i figur 2. Fem eksempler på bioluminescerende billeder i hver gruppe er præsenteret. Scorerne i køretøjet og behandlingsgruppen var heterogen, men i alle mus, bioluminescerende signal i øjet der viser inflammation i synsnerven var lavere i medicin gruppe (figur 2A). Den kvantificering af de totale selvlysende tæller i ROI'er bekræftede signifikant behandlingseffekt (figur 2B, med box plots af de samlede selvlysende tæller, uparret to-halet t-test, p <0,05). De billeddiagnostiske resultater aftalt med den terapeutiske effekts af medikamentet i form af de kliniske scorer og histopatologiske manifestationer af EAE i rygmarven og synsnerven 5.

Figur 2
Figur 2. Effekt af medicin i EAE-SJL / J mus Brug selvlysende Imaging. SJL / J-mus fik vehikel eller medicin (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) fra dag 5 efter immunisering. Billeder blev fanget efter injektionen af inflammation sonde (100 pi ip) ved 1 st EAE peak, n = 10 pr gruppe. EAE udviklet i 7/10 i begge grupper, og EAE ikke-respondere var uden signal. A) bioluminescens billeder i levende mus Captured 5 - 15 min efter ip injektion af 100 pi af inflammation proben præsenteres som regnbue pseudo fotografi overlays. LUT barer spænder fra blå (lav) til rød (høj intensitet). Målestok: 1 cm. Den enkelte topaf de samlede bioluminiscerende tællinger i ROI'er blev anvendt til kvantificering. ROIs var begrænset til hovedet. De PLP injektionssteder var afskærmet med et sort klæde. B) Box plots viser kvantificering af de totale tællinger i ROI'er. Boksen repræsenterer interkvartile interval, linjen er medianen, og knurhår viser minimum til maksimum. De samlede tællinger afveg signifikant mellem grupperne (2-sidet uparret t-test, P <0,05), der viser en reduktion af optisk neuritis og encephalitis i mus, der modtog medicin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Pegylerede fluorescerende nanopartikler

Epifluorescens billeder af nær-infrarøde nanopartikler afslørede vaskulære lækager omkring øjnene og i hjernen i både behandling Groups (Figur 3A, 2 eksempler). Partiklerne distribuere meget langsomt fra blodet til det interstitielle rum, med undtagelse af steder med inflammation, hvor farvestoffet akkumuleres, der giver mulighed for en vurdering af BBB integritet. Lækagen var tydelig ved 3 h og 24 h efter injektionen af ​​nanopartiklerne, men det var stærkere på det senere tidspunkt. Der var ingen specifik signal i ikke-EAE-mus eller mus ikke injiceret med nanopartikler (højre panel). Derfor signalet var specifik. Den kvantitative analyse af strålende effektivitet i ROI (figur 3B) afslørede ikke signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper (n = 3 pr gruppe, uparret to-halet t-test, p <0,05).

Figur 3
Figur 3. Vurdering af blodhjernebarrieren Forstyrrelse med Pegyleret Fluorescent Nanopartikler. SJL / J mus fik køretøj eller medicin (R-flurbiprofda 5 mg / kg / d) fra dag 5 efter immunisering. Billeder blev fanget 3 timer og 24 timer efter injektionen af ​​nær-infrarød-mærkede nanopartikler (70 pi iv) under 1. EAE peak, n = 3 per gruppe. EAE non-respondere var uden signal. værktøj Auto-ROI blev anvendt til kvantificering af den strålende effektivitet. De ROI'er var begrænset til hovedet. De PLP injektionssteder var afskærmet. A) Eksempler epifluorescens billeder af levende mus, fanget 3 timer og 24 timer efter injektionen af nanopartikler. Billeder af mus uden EAE eller uden injektionen af ​​nanopartikler blev anvendt som billeddannende kontroller. Målestok: 1 cm. LUT barer spænder fra mørkerød (lav) til gul (høj intensitet). B) Søjlediagrammer viser kvantificering af den strålende effektivitet i ROI'er (gennemsnit ± SD). Behandlingsgrupper afveg ikke signifikant (2-sidet uparret t-test). Klik her for at v iew en større version af dette tal.

Matrixmetalloproteinase-sensitive probe

Efter subtraktion af autofluorescens, billeder af protease-aktiverbare MMP probe viste inflammation i hjernen og rygmarven i EAE-mus (figur 4A, eksempler på 4 mus pr gruppe). Der var ikke noget signal i mus ikke injiceret med proben, og et svagt signal forekom i en EAE mus uden kliniske symptomer (ikke-responder). Billeder i figur 4 viser signalet på Ex / Em 640/700 trækkes af billedet ved Ex / Em 675/720. Forskelle mellem behandlinger blev kun afsløret efter kvantitativ analyse af den strålende effektivitet i auto-ROI'er efter spektral unmixing (figur 4B, uparret 2-halet t-test, n = 6 og 4, P <0,05).

Iles / ftp_upload / 55321 / 55321fig4.jpg "/>
Figur 4. Vurdering af metalloproteinaseaktivitet med Near-infrarød MMP-følsomme Imaging Probe. SJL / J-mus fik vehikel eller medicin (R-flurbiprofen 5 mg / kg / d) fra dag 5 efter immunisering. Billeder blev fanget 24 timer efter injektionen af ​​proben (150 pi iv) I 1. EAE peak, n = 6 og 4. PLP injektionssteder blev afskærmet. EAE ikke-responderende og mus uden MMP probe injektioner blev anvendt som kontroller. Hver 2 billeder blev taget til fange ved Ex / Em 640/700 nm (specifikt signal) og 675/720 nm (auto-fluorescens). Brug af den spektrale unmixing værktøjet blev autofluorescens subtraheret og efterfølgende blev værktøj auto-ROI anvendes til at identificere de steder af specifik MMP-aktivitet. Den samlede strålende effektivitet blev anvendt til kvantificering. A) Eksempler epifluorescens billeder i levende mus fanget 24 timer efter probe injektion. Billederne er resultatet af spektrale unmixing (UMX). Målestok: 1 cm. LUT bars spænder fra mørkerød (lav) til gul (høj intensitet). B) Box plots viser kvantificering af den samlede strålende effektivitet i ROI'er. Boksen repræsenterer interkvartile interval, linjen er medianen, og knurhår viser minimum til maksimum. Stjernen angiver en signifikant forskel mellem grupperne (2-sidet uparret t-test, P <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den foreliggende video viser teknikker til bioluminescens og nær-infrarød fluorescens in vivo-billeddannelse af EAE i SJL / J-mus. Vi viser, at bioluminescens billeddannelse ved hjælp af en betændelse-følsom sonde viser hovedsageligt optisk neuritis, og kvantificeringen enig med den kliniske vurdering af EAE sværhedsgrad og effekten af ​​medicinen. Imidlertid bioluminescens imaging metode var ikke i stand til at detektere betændelse i lumbale rygmarv, hvilket er et primært sted for EAE manifestation 17, sandsynligvis fordi signalet absorberes af rygsøjlen.

Nær-infrarød billeddannelse er mere følsom, men på bekostning af høje interferens med auto-fluorescens, som ikke forekommer med bioluminescens. Eksponeringstid på NIR er meget kortere (1 - 2 s) sammenlignet med BLI (2 - 5 min), hvilket gør NIR den foretrukne metode til tidsserier med hurtigt skiftende signalintensiteter.

Kritiske trin medi protokollen og begrænsninger Teknik

Signalerne fra immunisering webstedet forstyrre rygmarv billeddannelse i EAE, men dette kan omgås ved at placere begge injektionssteder ved haleroden, hvilket ikke var ringere end de anbefalede injektionssteder (hals- og haleroden). Ikke desto mindre er det nødvendigt at beskytte injektionsstedet med sort klæde.

For bioluminescens billeddannelse, er det afgørende at fange en tidsserie af billeder, fordi kinetikken varierer mellem dyr. For at undgå bias forårsaget af kinetik, billeddannelse af par af kontrol (f.eks, vehikel eller vildtype) og verum (fx lægemiddel eller transgene) mus er fordelagtig. Ifølge producenten, bør signalet være stabil i 30 min. Men i EAE, vi observerede hurtigere og mere forbigående kinetik, med toppe, der forekommer ved 5 - 10 min og en væsentlig nedgang på 15 min.

For nær-infrarød billeddannelse, den manufacturer anbefaler indstillingen Ex / Em for en specifik probe. Ikke desto mindre var det nyttigt at køre et filter serie i første omgang og altid tage billeder i det mindste på to excitation / emission kombinationer, som nøje svarer til den rapporterede Ex / Em maxima og kan senere anvendes til spektral unmixing af uspecifikke signaler.

Det er vigtigt at bruge hvide mus, som SJL / J, fordi lys og fluorescens er stærkt absorberet af sort pels. Sorte mus skal forsigtigt barberet på hovedet og tilbage en dag før billeddannelse. Hudlæsioner skal undgås, fordi de ses som inflammatoriske pletter og forstyrre billeddannelse af hjernen eller rygmarven. For NIR imaging, producenten anbefaler hårfjerning af alle mus, selv hvide mus. Selv efter barbering, hoved og ryg resultater i sorte mus var mindre overbevisende end med hvid mus (ikke vist). For det primære progressiv EAE model i C57BL6 mus, kan hvide C57BL6 mus, som er kommercielt tilgængelige, være et alterhjemmehørende. Hårløse, immunkompetente SKH1 mus er nyttige for nær-infrarød billeddannelse, men ikke EAE, fordi disse mus har en albino genetiske baggrund og ikke pålideligt udvikle EAE (maksimal score: 0.5 - 1). Bioluminescerende billeddannelse ved hjælp af inflammation sonde i disse mus afslørede adskillige inflammatoriske pletter i huden (ikke vist), hvor hårsækkene er gået tabt.

NIR billeddannelse af proteaseaktivitet afslørede hjerne og rygmarv inflammation, men signaler blev overlejret ved auto-fluorescens, der kræver spektral unmixing før kvantitativ analyse. Derfor NIR imaging var mindre robuste end bioluminescens billeddannelse og var dyrere. anvendelsen af ​​protease-aktiverbare prober kan imidlertid være nyttige for vurderingen af ​​lægemidler, der specifikt retter matrixmetalloproteinaser.

Fordele og ulemper

De forskellige billeddiagnostiske teknikker er gratis og løse specifikke spørgsmål. Fordelene ved Bioluminescent imaging er overkommelig (ca. 20 Euro / mus); en mangel på auto-bioluminescens, hvilket ville forstyrre signalet; høj specificitet; bekvem ip injektion og billedanalyse; og robusthed og pålidelighed. Ulemper er lange eksponeringstider og signal absorption af sort pels og knogler.

Fordele ved NIR er den bredere tilgængelighed af NIR-mærkede prober, let custom NIR mærkning, korte eksponeringstid, og høj følsomhed. Ulemperne er høje omkostninger (50-100 Euro / mus), absorption af pels, kraftig interferens med auto-fluorescens, og nødvendigheden af ​​spektrale unmixing og billedbehandling før analyse.

En række prober er tilgængelige som påviser inflammationssteder fordi de aktiveres af proinflammatoriske enzymer, der opreguleres på steder med inflammation (fx, peroxidaser eller metalloproteinaser) på grund af infiltrering af immunceller. Nogle af disse prober vil også detektere tydningrs demonstrerer immuncelle infiltration i tumormikromiljøet eller frigivelse af enzymer af selve tumoren (f.eks MMP'er). Prober, der ophobes i væv som følge af kapillær lækage vil detektere forstyrrelser i BBB, men også på andre steder for inflammation og cancer.

Betydningen af ​​Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder

Kombinationen af ​​"imaging plus kliniske sår" var overlegen i forhold til "scores kun" til vurdering af status sygdom og påvisning af medicin effekter. Den bioluminescens signal omkring øjnene er også enig med tidligere histopatologiske undersøgelser, der viser myelin ødelæggelse og immune celle infiltrater i synsnerven fem. Omkring 2/3 af MS-patienter udvikler episoder af optisk neuritis. Indtil videre er der ingen pålidelige, ikke-invasive metoder til at kvantificere optisk neuritis i levende mus undtagen diffusion magnetisk resonans imaging (MRI) og optisk kohærenstomografi (OLT), som er teknisk krævende 18. Oktober er blevet indført i EAE som metode viser retinale ændringer og atrofi i løbet EAE, hvilket antyder en autoimmun reaktion i synsnerven 19.

Sammenlignet med den i dette manuskript metode, OCT er en højere stressor for musene, fordi det kræver dyb anæstesi. Udlæsningen er ikke en direkte visualisering af synsnerven 19.

Nær-infrarød billeddannelse af fluorescerende nanopartikler var nyttigt til at visualisere forstyrrelse af BBB, som er en anden kendetegnende for EAE og MS. Udover MRI 20, 21, er der ingen ikke-invasiv metode til in vivo monitorering af BBB integritet. Dette ville være ganske nyttigt, fordi eksperimentelle lægemidler og phyto-medicin specifikt handle ved at stramme barrieren 22, 23, som normalt hindrer overdreven lymfocyt rekruttering ind i CNS 24. Forebyggelse leukocyt vedhæftet fil eller transmigration gennem BBB og reducere dens utætheder er en effektiv strategi i MS behandling 25, og nanopartikel billedbehandling kan bidrage til at vurdere effekten af lægemiddelkandidater. Hidtil partiklerne er dyre. Intravital mikroskopi er en anden teknik, der anvendes til at visualisere BBB integritet 26, men det kræver normalt langvarig, dyb anæstesi (fx med ketamin og xylazin) på grund af kraniotomi og forbyder genopvågnen musene, dermed forhindre tidsforløbet af analyser. Men intravital mikroskopi giver, billeder i høj opløsning på cellulært til subcellulære niveauer, hvilket ikke kan opnås med in vivo-billeddannelse.

Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Teknik

Sammenfattende imaging techniques præsenteres i nærværende video hjælp til at vurdere de enkelte kurser af sygdommen og til at overvåge virkningerne af medicin, som var delvist ikke afsløret af kliniske scoringer alene. Teknikkerne er enig med de 3 "R" principper om erstatning, begrænsning og forfining i dyreforsøg og er nyttige add-on værktøjer i lægemiddelforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) og finansieringen forskningsprogrammet "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) i staten Hessen, Forskningscenter for Translationel Medicin og Farmakologi TMP og Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), Forskeruddannelse Group Translational Research Innovation - Pharma (TRIP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Dunn, J. Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).
  3. Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).
  4. Sawcer, S., et al. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).
  5. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).
  6. Balls, M. The origins and early days of the Three Rs concept. Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).
  7. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  8. Leahy, A. A., et al. Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities. Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).
  9. Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. Rheumatology (Oxford). 55 (3), 564-572 (2016).
  10. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  11. Eaton, V. L., et al. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. J Neuroinflammation. 10, (2013).
  12. Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).
  13. Wang, C., et al. In situ fluorescence imaging of myelination. J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).
  14. Wang, C., et al. Longitudinal near-infrared imaging of myelination. J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).
  15. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).
  16. Badawi, A. H., et al. Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor. Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).
  17. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
  18. Lin, T. H., et al. Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis. Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).
  19. Knier, B., et al. Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).
  20. Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).
  21. Mori, Y., et al. Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model. Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).
  22. Bittner, S., et al. Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS. Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).
  23. Theien, B. E., et al. Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE. Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).
  24. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  25. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).
  26. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS One. 7 (12), e50915 (2012).
  27. Bukilica, M., et al. Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat. Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).

Tags

Medicin autoimmun encephalomyelitis multipel sclerose optisk neuritis optisk levende billedbehandling bioluminescens infrarød betændelse
Bioluminescens og Nær-infrarød Imaging af optisk neuritis og hjernebetændelse i EAE model af multipel sklerose i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, K., Tegeder, I.… More

Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter