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Medicine

Bioluminescence et proche infrarouge Imaging de névrite optique et inflammation du cerveau dans le modèle EAE de la sclérose en plaques chez des souris

Published: March 1, 2017 doi: 10.3791/55321
Automatic Translation
1, 1
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

Summary

Nous montrons une technique de bioluminescence direct in vivo et l' imagerie dans l'infrarouge proche de la névrite optique et l' encéphalite dans le modèle expérimental d' encéphalomyélite auto - immune (EAE) pour la sclérose en plaques chez les souris SJL / J.

Abstract

Experimental encéphalomyélite auto-immune (EAE) dans SJL / J souris est un modèle pour la sclérose en plaques récurrente-rémittente (RRMS). scores EAE cliniques décrivant moteur déficits de fonction sont des lectures de base de l'inflammation de la médiation immunitaire de la moelle épinière. Toutefois, les scores et le poids corporel ne permettent pas une évaluation in vivo de l' inflammation du cerveau et de la névrite optique. Ce dernier est une manifestation précoce et fréquente dans environ 2/3 des patients atteints de sclérose en plaques. Ici, nous montrons des méthodes de bioluminescence et de l' imagerie en direct proche infrarouge pour évaluer EAE a évoqué la névrite optique, une inflammation du cerveau, et barrière hémato-encéphalique (BHE) perturbation chez les souris vivant en utilisant un système d'imagerie in vivo dans. Un substrat de bioluminescence activée par des oxydases a montré principalement la névrite optique. Le signal était spécifique et a permis la visualisation des effets des médicaments et des cours de temps de la maladie, qui en parallèle les scores cliniques. nanoparticules fluorescentes pégylés qui sont restés dans le vasculature pendant de longues périodes de temps ont été utilisés pour évaluer l'intégrité du Bureau. Proche infrarouge imagerie a révélé une fuite BBB au sommet de la maladie. Le signal est le plus fort autour des yeux. Un substrat proche de l'infrarouge pour métalloprotéinases de matrice a été utilisé pour évaluer l'inflammation de l'EAE évoquée. Auto-fluorescence interféré avec le signal, ce qui nécessite déconvolution spectrale pour la quantification. Dans l'ensemble, l'imagerie par bioluminescence est une méthode fiable pour évaluer la névrite optique et de médicaments effets EAE-associé et était supérieur aux techniques du proche infrarouge en termes de spécificité du signal, la robustesse, la facilité de quantification, et le coût.

Protocol

1. EAE Induction dans SJL / J Souris

  1. Souris
    1. Utilisez 11 semaines d'âge SJL femelle / souris J et leur permettre de se habituent à la salle expérimentale pendant environ 7 jours. Utilisez n = 10 souris par groupe.
    2. Pour l'évaluation des effets des médicaments, administrer le médicament et le placebo pour le groupe de contrôle en continu via l'eau de boisson ou par des boulettes de nourriture à partir de 3 ou 5 jours après l'immunisation (n = 10 par groupe). Durant le pic de la maladie, administrer un médicament ou un placebo avec du lait ou 3% de flocons de maïs sucre eau trempés.
  2. Matériel de vaccination
    1. Utiliser un kit d'induction d'EAE comprenant l'antigène (peptide de la protéine protéolipide, PLP139-151, 1 mg / émulsion ml) dans une emulsion avec de l'adjuvant complet de Freund (CFA, Mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur H37 Ra) et de 2 flacons (5 ug chacun) de la toxine de la coqueluche lyophilisée (PTX).
    2. Dissoudre la PTX (2 pg / ml) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS; par exemple, </ Em> ajouter 1,5 ml de PBS à chaque tube PTX, bien mélanger, retirer avec la même pointe de pipette, et ajouter à 1 ml de PBS dans un tube de 50 ml); bien mélanger.
  3. Immunisation
    1. Injecter PLP / CFA voie sous-cutanée en 2 parties, chaque 100 pi, à la fois à la base de la queue. Ne pas injecter dans le dos du cou, car toutes les réactions immunitaires de la peau dans la partie supérieure du dos ou du cou perturberont imagerie de la tête et de la moelle épinière.
    2. Injecter 100 ul de PTX intrapéritonéale (ip), deux fois par souris, le 1 premier - 2 h après l'immunisation et la seconde à 24 h.
    3. Pour les souris témoins, injecter CFA sans PLP (2 portions de 100 pi) plus PTX sans PLP.
  4. Souris manipulation après la vaccination
    1. Peser les souris tous les jours jusqu'au jour 7, puis peser tous les jours.
      REMARQUE: Les souris perdent environ 1 - 2 g de poids corporel au cours de l'EAE. La baisse marque le début de l'EAE.
    2. Évaluer les symptômes cliniques par jour du jour 7 accordment aux systèmes de notation standard (c. -à- score 0: pas de changements évidents dans les fonctions motrices; marquer 0,5: la paralysie distale de la queue; score 1: queue paralysie complète; marquer 1.5: parésie légère d'un ou les deux pattes de derrière; score 2: parésie sévère des pattes postérieures; marquer 2.5: paralysie complète d'une jambe de derrière, score 3: paralysie complète des deux pattes postérieures; marquer 3.5:. paralysie complète des pattes postérieures et parésie d'une jambe avant euthanasier les souris avec des scores de 3,5 ou plus pour > 12 heures.
  5. EAE cours et le temps de l' imagerie
    1. Effectuer la première imagerie à l'apparition de la maladie, lorsque les souris atteignent des scores> 1, qui se produiront autour du jour 10-12 après la vaccination.
    2. Effectuer la deuxième imagerie au sommet, qui sera atteint 1 ou 2 jours après les premiers symptômes se développent et va durer pendant 1 - 3 jours.
      NOTE: Par la suite, les souris se rétablir complètement dans les 7 à 10 jours. Imaging pendant les intervalles peut encore montrer des fuites vasculaires,mais les indicateurs d'inflammation doivent être négatifs.

2. Bioluminescent et imagerie proche infrarouge de névrite optique et inflammation du cerveau

  1. La configuration du système d'imagerie
    1. Effectuer l'imagerie in vivo avec tout équipement qui permet l'analyse de bioluminescence et de signaux dans le proche infrarouge.
    2. Garder la souris sous 2 à 2,5% d'isoflurane anesthésie pendant toutes les procédures d'imagerie.
    3. Position un ou deux souris à côté de l'autre dans l'appareil en utilisant les approvisionnements en gaz du milieu. Positionner la colonne vertébrale supérieure dans le centre.
    4. Utilisez deux souris simultanément, un par groupe, pour l'évaluation des effets des médicaments pour comparer des paires. Ceci est important pour l'imagerie bioluminescente.
    5. Protégez le site de la vaccination avec un chiffon noir et prendre une image photographique et de référence pour évaluer le positionnement correct de la souris / souris. Utiliser la mise au point B avec une distance de 6,5 cm à l'appareil pour toutes les images.
  2. Injection et imagerie de la sonde d'inflammation bioluminescente
    1. Utilisez les paramètres in vivo dans des systèmes d'imagerie: Epi-BLI, Em filtre ouvert, Ex bloc de filtre, fstop 1, binning 8, concentrer B = 6,5 cm, ad exposition 120 s; prendre une image de référence.
    2. Injecter 100 ul IP du réactif chimioluminescent prêt à l'emploi (40 mg / ml). Bien mélanger avant de remplir la seringue.
    3. Capturer des images de bioluminescence 5, 10 et 15 min après l'injection. Le cours du temps du pic bioluminescente diffère entre les animaux.
      NOTE: Le pic se produira 5-10 min après l'injection; une baisse à 15 min indique qu'aucune autre images sont nécessaires. Utilisez des paires de souris des groupes de contrôle et de traitement pour éliminer les biais mineures dues à différents cours à temps.
    4. Remplissez les descriptions pertinentes à l'expérience. Observer une boîte de dialogue pop-up automatiquement; il comprend des informations, telles que la souche de la souris, le sexe, le point de temps, le temps d'injection de la sonde, le groupe, etc. Enregistrer les fichiers dans tous les odossier ne; ils auront des balises de temps et toutes les descriptions.
  3. Injection et imagerie de nanoparticules fluorescentes proche infrarouge pour l' intégrité BBB
    1. Utilisez l'imagerie à épifluorescence proche infrarouge dans le B-focus (distance: 6,5 cm). Les maxima d'excitation / émission des nanoparticules fluorescentes pégylés sont 675/690 nm. Capturez deux images à différentes longueurs d'onde, à Ex640 / EM700 et Ex675 / Em720; utiliser un 2-s exposition, binning 8 et fstop 2. Prenez une image de référence.
    2. Injecter 70 ul de nanoparticules fluorescentes infrarouges pégylés iv à travers la veine de la queue et imaginer la souris 3 h et 24 h après l'injection en utilisant les paramètres ci-dessus. Mélangez bien la solution avant de remplir la seringue.
    3. Injecter chlorure de sodium à 0,9% chez les souris témoins, qui seront nécessaires pour évaluer la spécificité du signal.
  4. Injection et imagerie de la sonde proche infrarouge fluorescent pour l' activité MMP
    1. Raser ou depilate la tête et upper région de la colonne vertébrale prudemment un jour avant de prendre l'image de référence. La peau ne doit pas être blessé.
    2. Utilisez l'imagerie à épifluorescence proche infrarouge dans le B-focus (distance: 6,5 cm). Les maxima d'excitation / émission de la sonde activable MMP sont 680/700 nm. Capturez deux images à différentes longueurs d'onde, à Ex640 / EM700 et Ex675 / Em720; utiliser un-s 1 exposition, binning 8 et fstop 2. Prenez une image de référence.
    3. Ajouter 200 ul de 1 x PBS dans le tube 1,5 ml de la solution prête à l'emploi (20 nmol / 1,5 ml dans 1 x PBS), de sorte qu'il sera suffisant pour 10 souris; bien mélanger avant de remplir la seringue.
      REMARQUE: Le volume disponible ne tient pas compte du fait que peu de volume est perdue au cours du remplissage de la seringue et l'injection.
    4. Injecter 150 ul de la iv sonde à travers la veine de la queue 24 h avant l'imagerie. Injecter du PBS seulement chez les animaux de contrôle pour évaluer la spécificité du signal.
    5. A 24 h après l'injection, prendre des images Epi-FL au moins deux longueurs d'onde, Ex640 / EM700 et Ex 675 / EM720, avec les paramètres expliqué ci-dessus (1-s exposition, mise au point B, binning 8 et fstop 2).
      NOTE: L'utilisation de deux longueurs d'onde permet de déconvolution spectrale en soustrayant le signal non spécifique.

3. Analyses image

  1. L' analyse par bioluminescence (BLI)
    1. Double-cliquez sur le logiciel pour l'ouvrir.
    2. Dans la barre de menu supérieure, cliquez sur l'icône du navigateur de fichier, allez dans le répertoire du dossier de l'expérience, et sélectionnez - le; cela va ouvrir tous les fichiers dans le dossier dans une table.
    3. Configurer les colonnes montrant les descriptions pertinentes à l'expérience.
    4. Pour le contrôle de la qualité, double-cliquez sur un fichier d'une souris non-répondeur sans symptômes de l'EAE et / ou une souris naïve pour vérifier la spécificité des signaux EAE.
      NOTE: Il devrait y avoir aucun signal dans des souris naïves et le signal minimal chez les souris non-répondeurs.
      1. Vérifiez l'image de référence avant l'injection de la prosoit pour chaque souris en tant que contrôle supplémentaire de la spécificité du signal; il devrait être négatif.
    5. Pour sélectionner une image, double-cliquez sur le premier fichier de la première souris EAE et vérifier l'intensité bioluminescente (LUT gamme de bar) et la localisation. Vérifiez toutes les images une par une. Fermez le fichier avec l'intensité la plus faible pour chaque souris (ie, garder 2 sur 3 images pour chaque souris).
    6. l'ajustement et l'exportation image
      1. Double-cliquez sur le premier fichier à quantifier. Observez une nouvelle fenêtre pop up. Sous "options" (menu supérieur), personnaliser les étiquettes à afficher dans chaque image.
      2. Dans la palette d'outils à droite, aller à "Réglage de l'image." Par défaut, les intensités minimales et maximales sont réglées sur "auto" et affichés dans rainbow pseudocolor. Sélectionnez "manuel" pour modifier les paramètres si nécessaire.
        NOTE: Par exemple, toutes les images exportées peuvent avoir des barres de LUT identiques (minima et maxima identiques) pour être facilement comparables.L'ajustement des minima et maxima n'a aucun impact sur les résultats quantitatifs.
      3. Cliquez sur l'image à l'exportation, sélectionnez png, le répertoire et un nom d'image
    7. Quantification des régions d'intérêt (ROI)
      1. Aller à la "ROI" outil dans la palette d'outils. Sélectionnez la méthode de ROI (cercle, rectangulaire, auto ou mains libres) et le nombre de ROIs. Observez la fenêtre de ROI pop up dans la fenêtre d'image.
      2. Avec la souris, ajuster la taille et la position. Utilisez des seuils de ROI identiques pour toutes les images si l'outil d'auto-ROI est utilisé. Utilisez des zones identiques pour toutes les images si tailles et positions ROI sont définies manuellement (par exemple, ROIs circulaires).
      3. Cliquez sur "mesurer RO.I. Observer une nouvelle fenêtre pop - up. Personnalisez les colonnes (par exemple, le nom du fichier, le nombre d'animaux, le groupe, l' expérience, la superficie, les comptages totaux, comptes moyens, le nombre de SD, min et max Chiffres, région, temps le point, le temps d'injection de la sonde, etc.). Enregistrer les paramètres personnalisés. Lorsque ready, tout sélectionner (Ctrl + A), et copier et coller le tableau dans une feuille de calcul.
      4. Exporter l'image comme png avec les ROIs en place. Enregistrer et fermer le fichier image.
    8. Répétez la procédure (étapes 3.1.6 - 3.1.7) pour tous les fichiers d'image qui doivent être quantifiés. Copiez tous les quantifications de retour sur investissement dans le tableur.
      NOTE: Ici, les résultats peuvent être triés par groupe, point de temps, etc. et analysées statistiquement. Utilisez les comptes totaux de signaux de bioluminescence dans le ROIs pour les analyses statistiques.
  2. (NIR) analyse infrarouge Près de nanoparticules fluorescentes
    1. Utilisation des commandes dans le logiciel, régler le seuil de l'image.
      NOTE: Cela n'a aucun impact sur le résultat quantitatif.
    2. comparer visuellement les images capturées à Ex / Em 675/720 et Ex / Em 640/700 pour évaluer la spécificité du signal.
    3. Utilisez les images capturées à Ex / Em 675/720 pour l'analyse quantitative (maximum d'excitation: 680 nm). Définir ROIs, pour lequel l'outil d'auto-ROI peut être utilisé. Réglez le seuil d'auto-ROI et de l'utiliser pour toutes les images. Quantifier l'efficacité radiante totale dans ROIs (voir étape 3.1).
  3. (NIR) analyse-proche infrarouge de la sonde sensible à une protéase
    1. Utilisation des commandes de logiciels, régler le seuil de l'image.
      NOTE: Cela n'a aucun impact sur le résultat quantitatif. Effectuer unmixing spectrale de l'auto-fluorescence. L'outil unmixing est mis en œuvre Living Image. L'auto-unmixing utilise Ex / Em 640/700 comme spécifique et 675/720 en tant que l'image de l'auto-fluorescence.
    2. Sélectionnez l'image unmixed et définir les ROIs, comme décrit ci-dessus. Utilisez l'efficacité rayonnante totale dans ROIs pour des analyses quantitatives et statistiques.

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Representative Results

Cours Temps de bioluminescence de névrite optique

Le signal de bioluminescence de la sonde de l'inflammation a été la plus forte autour des yeux et est produite exclusivement chez des souris EAE avec névrite optique. Un signal a été dans ni les souris non-EAE, ni les souris non injectées avec la sonde de l'inflammation. Le signal a disparu lorsque la souris récupéré. Par conséquent, le signal est spécifique pour la névrite optique, et le pic du signal est parallèle à la crête des scores EAE cliniques. La figure 1 montre deux exemples de SJL / J souris imagées au jour 10 et 14 après induction de l' EAE. Le signal bioluminescent était le plus élevé au jour 10 et a disparu lorsque les souris ont commencé à se rétablir. Les cours du temps des scores cliniques correspondait à la disparition du signal bioluminescente (exemple-1) ou précédé (exemple 2) la baisse des scores.


Figure 1. Cours Temps de névrite optique et Scores cliniques en EAS-SJL / J Souris. Les images de bioluminescence de névrite optique ont été capturés 10 minutes après l'injection de la sonde d'inflammation (100 ul ip) lors de la 1 ère évasement de la maladie chez deux souris SJL / J à différents moments après l' immunisation. Les images bioluminescentes (panneau de gauche) ont été capturés 10 et 14 jours après la vaccination et sont présentés comme arc-pseudocolor superpositions de photographie. barres de Lut vont du bleu (faible) au rouge (haute-bioluminescence). Barre d'échelle: 1 cm. Le panneau de droite montre les graphiques à barres des différents comptages totaux de bioluminescence dans ROIs (moyenne ± sd de 3 images chacun) et les durées des scores EAE cliniques. Les flèches rouges marquent les jours d'imagerie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Évaluation de l' efficacité du traitement

Sonde Inflammation

Les effets du médicament (R-flurbiprofène 5 mg / kg / j) 5 sont représentés sur la figure 2. Cinq exemples d'images de bioluminescence dans chaque groupe sont présentées. Les scores du groupe de véhicules et de traitement étaient hétérogènes, mais chez toutes les souris, le signal de bioluminescence dans l'œil montrant une inflammation dans le nerf optique était plus faible dans le groupe des médicaments (figure 2A). La quantification des comptages totaux de bioluminescentes dans ROIs a confirmé significative l' efficacité du traitement (figure 2B, avec la boîte parcelles des comptages totaux de bioluminescentes, apparié 2-tailed test t, P <0,05). Les résultats de l'imagerie d'accord avec l'effet thérapeutiques du médicament en fonction des scores cliniques et manifestations histopathologiques de l' EAE dans la moelle épinière et nerf optique 5.

Figure 2
Figure 2. Efficacité des médicaments dans l' EAE-SJL / J souris en utilisant Bioluminescent Imaging. les souris SJL / J ont reçu le véhicule ou le médicament (R-flurbiprofène 5 mg / kg / j) à partir du jour 5 après la vaccination. Les images ont été capturées après l'injection de la sonde de l' inflammation (100 pi ip) au 1 er EAE pic, n = 10 par groupe. EAE développé en 7/10 dans les deux groupes, et EAE non-répondeurs étaient sans signaux. A) images bioluminescence chez les souris vivant capturés 5-15 min après l'injection ip de 100 pi de la sonde de l' inflammation sont présentés comme arc pseudocolor superpositions de photographie. barres de LUT vont du bleu (faible) au rouge (haute intensité). Barre d'échelle: 1 cm. Le pic individueldes comptages totaux de bioluminescentes dans ROIs a été utilisé pour la quantification. ROIs ont été limités à la tête. Les sites d'injection PLP ont été protégés avec un tissu noir. B) Box parcelles montrant la quantification des comptages totaux en ROIs. La boîte représente la gamme interquartile, la ligne est la médiane, et les moustaches montrent le minimum au maximum. Les chiffres totaux différaient significativement entre les groupes (test t 2 faces non apparié, P <0,05), montrant une réduction de la névrite optique et l'encéphalite chez les souris recevant des médicaments. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nanoparticules fluorescentes pégylés

images épifluorescence de nanoparticules dans le proche infrarouge ont révélé des fuites vasculaires autour des yeux et dans le cerveau à la fois le traitement groups (figure 3A, 2 exemples). Les particules diffusent très lentement dans le sang dans l'espace interstitiel, à l'exception des sites d'inflammation, où le colorant accumule, ce qui permet une évaluation de l'intégrité du Bureau. La fuite était évidente à 3 h et 24 h après l'injection des nanoparticules, mais il a été plus forte au point de temps plus tard. Il n'y avait aucun signal spécifique chez la souris ou souris non EAE non injectée avec des nanoparticules (panneau de droite). Par conséquent, le signal était spécifique. L'analyse quantitative de l' efficacité énergétique dans ROIs (figure 3B) n'a pas révélé de différences significatives entre les groupes de traitement (n = 3 par groupe, test t apparié 2 à queue, P <0,05).

figure 3
Figure 3. Évaluation de barrière hémato - encéphalique Perturbation avec pégylé Fluorescent Nanoparticules. SJL / J souris ont reçu un véhicule ou d'un médicament (R-flurbiproffr 5 mg / kg / j) à partir du jour 5 après la vaccination. Les images ont été capturées 3 h et 24 h après l'injection de nanoparticules dans le proche infrarouge marqué (70 pi iv) au cours du premier pic d'EAE, n = 3 par groupe. EAE non-répondeurs étaient sans signaux. L'outil d'auto-ROI a été utilisé pour la quantification de l'efficacité lumineuse. Les ROIs ont été limités à la tête. Les sites d'injection PLP étaient protégés. A) Images épifluorescence Des exemples de souris vivantes, capturées 3 h et 24 h après l'injection de nanoparticules. Des images de souris sans EAE ou sans l'injection de nanoparticules ont été utilisées comme témoins d'imagerie. Barre d'échelle: 1 cm. barres de LUT vont du rouge foncé (faible) à jaune (haute intensité). B) de diagrammes à barres montrant la quantification de l'efficacité énergétique dans ROIs (moyenne ± écart - type). Les groupes de traitement ne diffèrent pas significativement (test t apparié 2 faces). S'il vous plaît cliquez ici pour v IEW une version plus grande de cette figure.

Matrice métalloprotéinase sensible sonde

Après soustraction de l'autofluorescence, des images de la sonde MMP protéase activable ont révélé une inflammation dans le cerveau et la moelle épinière chez des souris atteintes d' EAE (figure 4A, des exemples de 4 souris par groupe). Il n'y avait pas de signal dans des souris non injectées avec la sonde, et un signal faible est produite chez une souris EAE sans symptômes cliniques (non répondeurs). Images de la figure 4 montrent le signal à Ex / Em 640/700 soustraite par l'image au Ex / Em 675/720. Les différences entre les traitements ont été révélés seulement après l'analyse quantitative de l'efficacité énergétique dans l' auto-ROIs après déconvolution spectrale (Figure 4B, apparié 2-tailed test t, n = 6 et 4, P <0,05).

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Figure 4. Évaluation de la métalloprotéinase Activité avec MMP-sensible Sonde proche infrarouge Imaging. les souris SJL / J ont reçu le véhicule ou le médicament (R-flurbiprofène 5 mg / kg / j) à partir du jour 5 après la vaccination. Les images ont été capturées 24 h après l'injection de la sonde (150 pi iv) au 1er pic EAE, n = 6 et 4. Les sites d'injection PLP étaient protégés. EAE non-répondeurs et les souris sans MMP injections de sonde ont été utilisés comme témoins. Chaque 2 images ont été capturées à Ex / Em 640/700 nm (signal spécifique) et 675/720 nm (auto-fluorescence). Utilisation de l'outil de déconvolution spectrale, l'auto-fluorescence a été soustraite et ensuite, l'outil d'auto-ROI a été utilisé pour identifier les sites d'activité MMP spécifique. L'efficacité de rayonnement total a été utilisé pour la quantification. A) images épifluorescence exemplaires chez les souris vivant capturé 24 h après l' injection de la sonde. Les images sont le résultat de déconvolution spectrale (UMX). Barre d'échelle: 1 cm. bar LUTs gamme du rouge foncé (faible) à jaune (haute intensité). B) Box parcelles montrant la quantification de l'efficacité de rayonnement totale dans ROIs. La boîte représente la gamme interquartile, la ligne est la médiane, et les moustaches montrent le minimum au maximum. L'astérisque indique une différence significative entre les groupes (test t apparié 2 côtés, P <0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La présente vidéo montre les techniques de la bioluminescence et la fluorescence dans le proche infrarouge dans l' imagerie in vivo de l' EAE chez les souris SJL / J. Nous montrons que l'imagerie par bioluminescence à l'aide d'une sonde sensible à l'inflammation montre principalement la névrite optique et la quantification en accord avec l'évaluation clinique de l'EAE et la sévérité des effets des médicaments. Cependant, le procédé d'imagerie par bioluminescence n'a pas été en mesure de détecter une inflammation de la moelle épinière lombaire, qui est un site principal de l' EAE 17 manifestation, probablement parce que le signal est absorbé par la colonne vertébrale.

L'imagerie dans le proche infrarouge est plus sensible mais au détriment d'une forte interférence avec l'auto-fluorescence, ce qui ne se produit pas avec la bioluminescence. Le temps d'exposition de NIR est beaucoup plus courte (1 - 2 s) par rapport à BLI (2 - 5 min), ce qui rend NIR la méthode préférée pour les séries chronologiques à l'évolution rapide des intensités de signal.

Étapes critiques avecdans le protocole et limites de la technique

Les signaux du site de vaccination interfèrent avec l'imagerie de la moelle épinière dans l'EAE, mais cela peut être contourné en plaçant les deux sites d'injection à la base de la queue, qui n'a pas été inférieure à celle des sites d'injection recommandés (du cou et de la base de la queue). Néanmoins, il est nécessaire de protéger les sites d'injection avec un chiffon noir.

Pour l'imagerie par bioluminescence, il est essentiel de capturer une série temporelle d'images, car la cinétique diffèrent entre les animaux. Pour éviter les biais causés par la cinétique, l' imagerie de paires de contrôle (par exemple, un véhicule ou de type sauvage) et verum (par exemple, un médicament ou transgénique) souris est avantageux. Selon le fabricant, le signal doit être stable pendant 30 min. Cependant, dans l'EAE, nous avons observé une cinétique plus rapide et plus transitoires, avec des pics qui se produisent à 5-10 min et une baisse substantielle de 15 min.

Pour l'imagerie dans l'infrarouge proche, le Manufacturer recommande le réglage Ex / Em pour une sonde spécifique. Néanmoins, il est utile d'exécuter une série de filtres d'abord et toujours capturer des images au moins à deux combinaisons d'excitation / émission, qui correspondent étroitement aux maxima Ex / Em rapporté et peut être ensuite utilisé pour déconvolution spectrale des signaux non spécifiques.

Il est important d'utiliser des souris blanches, comme SJL / J, parce que la lumière et la fluorescence sont fortement absorbées par la fourrure noire. souris noires doivent être prudemment rasé sur la tête et le dos un jour avant l'imagerie. Les lésions cutanées doivent être évités, car ils apparaissent comme des taches inflammatoires et interférer avec l'imagerie du cerveau ou de la moelle épinière. Pour l'imagerie NIR, le fabricant recommande l'épilation de toutes les souris, les souris même blanches. Même après le rasage, la tête et le dos des résultats chez les souris noires étaient moins convaincantes qu'avec des souris blanches (non représenté). Pour le modèle EAE progressive primaire chez les souris C57BL6, souris blanches C57BL6, qui sont disponibles dans le commerce, peuvent être un alteroriginaire de. souris SKH1 glabres, immunocompétents sont utiles pour l'imagerie infrarouge proche, mais pas EAE, parce que ces souris ont un fond génétique albinos et ne développent pas de manière fiable EAE (score maximum: 0.5 - 1). l'imagerie bioluminescente utilisant la sonde de l'inflammation chez ces souris a révélé plusieurs points inflammatoires dans la peau (non représenté) où les follicules pileux sont perdus.

NIR imagerie de l'activité de protéase a révélé une inflammation du cerveau et de la moelle épinière, mais les signaux ont été superposés par auto-fluorescence, ce qui nécessite déconvolution spectrale avant l'analyse quantitative. Par conséquent, l'imagerie NIR était moins robuste que l'imagerie par bioluminescence et était plus cher. Cependant, l'utilisation de sondes activables de la protéase peut être utile pour l'évaluation des médicaments qui ciblent spécifiquement les métalloprotéinases de la matrice.

Avantages et inconvénients

Les différentes techniques d'imagerie sont complémentaires et répondent aux questions spécifiques. Les avantages de Bioluminimagerie Escent sont abordables (environ 20 Euro / souris); un manque d'auto-bioluminescence, qui pourrait interférer avec le signal; haute spécificité; injection ip pratique et analyse d'image; et de robustesse et de fiabilité. Inconvénients sont longues durées d'exposition et l'absorption de signal en fourrure noire et de l'os.

Les avantages du NIR sont la plus grande disponibilité des sondes NIR marquées, la facilité d'étiquetage personnalisé NIR, peu de temps d'exposition, et une sensibilité élevée. Les inconvénients sont les coûts élevés (50 - 100 Euro / souris), l'absorption par la fourrure, une forte interférence avec auto-fluorescence, et la nécessité de déconvolution spectrale et le traitement de l'image avant l'analyse.

Un certain nombre de sondes sont disponibles qui permettent de détecter des sites d'inflammation , car ils sont activés par des enzymes pro-inflammatoires qui sont régulés positivement dans les sites d'inflammation (par exemple, des peroxydases ou des métalloprotéases) en raison de l'infiltration de cellules immunitaires. Certaines de ces sondes seront également détecter signirs montrant l' infiltration des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral ou la libération d'enzymes par la tumeur elle - même (par exemple MMP). Les sondes qui accumulent dans les tissus dus à une fuite capillaire permet de détecter des perturbations dans la BHE, mais aussi sur d'autres sites de l'inflammation et le cancer.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives

La combinaison de "l'imagerie ainsi que des plaies cliniques" était supérieure à "scores" seulement pour l'évaluation de l'état de la maladie et la détection des effets des médicaments. Le signal de bioluminescence autour des yeux est également d' accord avec des études histopathologiques antérieures montrant la destruction de la myéline et des infiltrats de cellules immunitaires dans le nerf optique 5. Environ 2/3 des patients atteints de SEP développent des épisodes de névrite optique. Jusqu'à présent, il n'y a pas de méthodes fiables, non-invasive pour quantifier la névrite optique chez la souris, à l'exception d'imagerie par résonance magnétique de diffusion (IRM) et op vivanttical tomographie par cohérence (OCT), qui sont techniquement exigeant 18. Octobre a été introduite dans l' EAE comme méthode montrant les changements de la rétine et une atrophie pendant EAE, ce qui suggère une réaction auto - immune dans le nerf optique 19.

Par rapport à la méthode décrite dans ce manuscrit, octobre est un facteur de stress plus élevés pour les souris, car elle nécessite une anesthésie profonde. La lecture est pas une visualisation directe du nerf optique 19.

imagerie proche infrarouge de nanoparticules fluorescentes a été utile pour visualiser la perturbation de la BHE, qui est une autre caractéristique de l'EAE et MS. Outre l' IRM 20, 21, il n'y a pas de méthode non-invasive pour le suivi in vivo de BBB intégrité. Ce serait très utile, parce que les médicaments expérimentaux et phyto-médicaments agissent spécifiquement en serrant la barrière 22, 23, ce qui empêche normalement le recrutement de lymphocytes excessive dans le SNC 24. Prévenir l' attachement leucocytaire ou transmigration à travers la BHE et de réduire son leakiness est une stratégie efficace dans le traitement de la SP 25, et de l' imagerie de nanoparticules peut aider à évaluer l' efficacité des médicaments candidats. Jusqu'à présent, les particules sont coûteux. La microscopie intravitale est une autre technique utilisée pour visualiser l' intégrité BBB 26, mais elle exige normalement de longue durée, l' anesthésie profonde (par exemple, avec de la kétamine et de xylazine) en raison de la craniotomie et interdit ré-éveiller les souris, prévenant ainsi l' analyse en fonction du temps. Cependant, la microscopie intravitale fournit des images à haute résolution au cellulaire à des niveaux intracellulaires, ce qui est pas réalisable avec l' imagerie in vivo.

Applications futures ou les directions après Maîtriser la technique

En résumé, la te d'imageriechniques présentées dans la présente aide vidéo pour évaluer les cours individuels de la maladie et de surveiller les effets des médicaments, qui étaient en partie pas révélé par les seuls scores cliniques. Les techniques sont d'accord avec les 3 "R" principes de remplacement, de réduction et de raffinement dans l'expérimentation animale et sont utiles add-on des outils de recherche sur les médicaments.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) et le programme de financement de la recherche "Landesoffensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) de l'Etat de Hesse, Centre de recherche pour la médecine translationnelle et Pharmacologie TMP et Else Kröner-Fresenius Foundation (EKFS), Groupe de formation en recherche translationnelle innovation Research - Pharma (TRIP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AngioSpark-680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10149 Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680 Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA NEV10126 Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA 760535 Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion  Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
Pertussis Toxin Hooke Labs, St Lawrence, MA EK-0123 EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software  Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA CLS136334 IVIS analysis software
Isoflurane Abbott Labs, Illinois, USA 26675-46-7 Anaesthetic

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Médecine numéro 121 encéphalomyélite auto-immune la sclérose en plaques névrite optique l'imagerie en direct optique bioluminescence infrarouge inflammation
Bioluminescence et proche infrarouge Imaging de névrite optique et inflammation du cerveau dans le modèle EAE de la sclérose en plaques chez des souris
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Schmitz, K., Tegeder, I. Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55321, doi:10.3791/55321 (2017).

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